蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定

泛素化對于細胞分化與凋亡、DNA修復、免疫應答和應激反應等生理過程起著重要作用磷酸化涉及細胞信號轉(zhuǎn)導、神經(jīng)活動、肌肉收縮以及細胞的增殖、發(fā)育和分化等生理病理過程糖基化在許多生物過程中如免疫保護、病毒的復制、細胞生長、炎癥的產(chǎn)生等起著重要的作用脂基化對于生物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導過程起著非常關(guān)鍵的作用組蛋白上的甲基化和乙?；c轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)當前1頁，總共97頁。第一節(jié)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定一、生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)磷酸化修飾及其功能蛋白質(zhì)的磷酸化反應是指通過酶促反應把磷酸基團從一個化合物轉(zhuǎn)移到另一個化合物上的過程,是生物體內(nèi)存在的一種普遍的調(diào)節(jié)方式，在細胞信號的傳遞過程中占有極其重要的地位蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的過程當前2頁，總共97頁。當前3頁，總共97頁。蛋白質(zhì)磷酸化在細胞信號轉(zhuǎn)導中的作用在胞內(nèi)介導胞外信號時具有專一應答特點胞內(nèi)信使，cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油）蛋白質(zhì)的磷酸化與脫磷酸化控制了細胞內(nèi)已有的酶“活性”對外界信號具有級聯(lián)放大作用蛋白質(zhì)的磷酸化與脫磷酸化保證了細胞對外界信號的持續(xù)反應當前4頁，總共97頁。

磷酸化類型絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸酯化精氨酸、組氨酸和賴氨酸的亞酰胺化，天冬氨酸和谷氨酸的酰化絲氨酸磷酸化：蘇氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化=1800：200：1當前5頁，總共97頁。被磷酸化修飾的蛋白改變所帶的電荷改變催化基團的性質(zhì)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變蛋白質(zhì)的亞細胞分步蛋白質(zhì)功能變化的多樣性當前6頁，總共97頁。蛋白質(zhì)磷酸化研究有三個主要目的(1)對位于某一特定狀態(tài)下細胞內(nèi)的給定蛋白質(zhì)在體內(nèi)的磷酸化氨基酸殘基定位(2)鑒定與磷酸化過程有關(guān)的激酶(3)分析所觀察到的磷酸化現(xiàn)象對功能的影響當前7頁，總共97頁。二、磷酸化蛋白質(zhì)分析的概述磷酸化修飾蛋白質(zhì)的識別與檢測是影響磷酸化蛋白質(zhì)組學研究的關(guān)鍵技術(shù)之一細胞內(nèi)僅有少部分蛋白質(zhì)被磷酸化,即使蛋白質(zhì)的表達量處于相對較高的水平,該蛋白質(zhì)的磷酸化部分的分析也很困難,一般一個發(fā)生磷酸化的蛋白質(zhì)其磷酸化的部分僅占其總量的10%

磷酸化蛋白質(zhì)含量少，化學計量值低，磷酸化的肽段很容易淹沒在大量非磷酸化的肽段中當前8頁，總共97頁。二、磷酸化蛋白質(zhì)分析的概述體外pmol體內(nèi)fmol32p蛋白標記32p細胞標記蛋白質(zhì)分離蛋白酶切蛋白酶切2DPP作圖2DPP作圖μLC－ESI-MS或MALDI-MSμLC－ESI-MSμHPLCIMAC磷酸氨基酸分析相關(guān)分析當前9頁，總共97頁。二、磷酸化蛋白質(zhì)分析的概述雙相磷酸多肽譜圖

2D—PP多肽在薄層纖維板上進行電泳是第一相，在同一塊板上進行薄層色譜(TCL)為第二相，分離得到的磷酸肽用放射自顯影或磷儲屏檢測此方法提供了其他方法不能提供的有關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的重要信息

(1)磷酸化位點的最大數(shù)目(2)放射自顯影強度提供了在所有磷酸化肽中磷酸化的相對化學計量(3)電泳和TCL的正交分離提供了磷酸肽之間親水性的相對狀態(tài)當前10頁，總共97頁。二、磷酸化蛋白質(zhì)分析的概述磷酸肽本身所具有的負電性使其在正離子模式的質(zhì)譜分析中信號受到抑制，在MALDI源的質(zhì)譜儀中磷酸肽的信號豐度會比其相應未磷酸化肽段的信號強度要低很多磷酰鍵較肽鍵容易斷裂，使磷酸化蛋白比非磷酸化蛋白鑒定要困難的多當前11頁，總共97頁。三、磷酸化蛋白質(zhì)的檢測32P放射性標記法抗體免疫印跡檢測法當前12頁，總共97頁。1、32P放射性標記法32P放射性標記法是最經(jīng)典的磷酸化蛋白質(zhì)檢測方法放射性32P標記的ATP處理細胞，使32P摻入磷酸化蛋白質(zhì)培養(yǎng)待標記的細胞至適當?shù)纳L期，在生長旺盛的細胞中磷酸鹽的轉(zhuǎn)運達到最高峰，用不含磷酸鹽的標記培養(yǎng)液替換原來的細胞培養(yǎng)液，并加入32P標記磷酸鹽共培養(yǎng)，使細胞ATP庫與32P平衡，蛋白激酶利用被放射標記的ATP使底物磷酸化當前13頁，總共97頁。局限性磷酸轉(zhuǎn)換速率較低的磷酸化蛋白質(zhì)不能標記組織樣本放射性污染當前14頁，總共97頁。2、抗體免疫印跡檢測法通過抗磷酸氨基酸抗體與磷酸化蛋白質(zhì)的免疫印跡反應(Westernblotting)來檢出磷酸化蛋白質(zhì)是較常用的方法在真核細胞中最常見的磷酸化修飾是在蛋白質(zhì)的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈羥基磷酸化已經(jīng)有商品化的抗酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸磷酸鹽抗體,其中抗酪氨酸磷酸鹽抗體的特異性最好，磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的抗原決定簇較小,抗原抗體結(jié)合位點有空間障礙,所以抗體的結(jié)合力較差免疫印跡法與免疫沉淀相結(jié)合,可以在電泳之前先富集目的蛋白質(zhì),但這樣也有可能丟失部分低豐度的目的蛋白質(zhì),同時免疫沉淀技術(shù)對抗體的要求更高,抗磷酸酪氨酸抗體具有較好的親和性可以進行免疫沉淀實驗當前15頁，總共97頁。樣品制備（細胞、組織、體液提取蛋白質(zhì)）制備型2D膠電泳分析型2D膠電泳考馬斯亮藍染色轉(zhuǎn)印到膜找出相應的磷酸化蛋白質(zhì)磷酸氨基酸抗體免疫檢測—得到磷酸化蛋白質(zhì)染色—得到全部蛋白質(zhì)點磷酸化蛋白質(zhì)鑒定圖譜比較當前16頁，總共97頁。四、蛋白質(zhì)磷酸化位點的分析1、磷酸肽的分離和富集分離濃縮分析物，提高信噪比如果磷酸肽被放射性標記，并具有相同的比活度，那么每一個被分離的肽段相應的活度計數(shù)就表明這一組分中磷酸肽的相對量，如果已知所用放射性標記物的比活，就能容易算出磷酸肽的絕對量放射性標記的磷酸肽的分離譜可以用來定量檢測不同時間或細胞狀態(tài)下蛋白質(zhì)磷酸肽狀態(tài)的變化肽分離方法也有效地除去了非肽類雜質(zhì)，更有利檢測和分析低豐度磷酸肽當前17頁，總共97頁。1、磷酸肽的分離和富集方法反相液相色譜（PR-HPLC）免疫沉淀固相金屬親和色譜金屬氧化物/氫氧化物親和色譜離子交換和等電聚焦當前18頁，總共97頁。免疫沉淀當前19頁，總共97頁。原理當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來免疫沉淀物當前20頁，總共97頁。固相金屬親和色譜Immobilizedmetalaffinitychromatography,IMACIMAC柱：金屬離子、螯合劑、填料原理：帶正電的金屬離子，如Fe3+、Ca3+、Cu2+可以與帶負電的磷酸集團產(chǎn)生靜電交互作用而結(jié)合，這種結(jié)合能力受pH值、離子強度和溶液有機相的影響，在高pH或磷酸鹽存在的緩沖液中，金屬離子與磷酸基團間的結(jié)合被破環(huán)，磷酸肽被釋放出來當前21頁，總共97頁。局限性丟失低豐度、沒有結(jié)合到IMAC柱上的磷酸化肽段具有多磷酸化位點的肽由于較強的親和力較難被洗脫下來酸性基團（天冬氨酸、谷氨酸）、電子供體（組氨酸）也會結(jié)合到柱上，造成非磷酸化肽的污染效果：依賴于所選擇的金屬離子、填充柱的材料及洗脫程序當前22頁，總共97頁。金屬氧化物/氫氧化物親和色譜Metaloxide/hydroxideaffinitychromatography,MOACTiO2、Al(OH)3、ZrO2TiO2富集磷酸肽原理：

TiO2是一種兩性物質(zhì)，由于鈦原子和氧原子的原子表面化合價不飽和，TiO2在不同的pH值下可以表現(xiàn)為路易斯酸或路易斯堿在酸性溶液中，鈦原子帶正電表現(xiàn)為路易斯酸，可以與陰離子結(jié)合。磷酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽都與TiO2具有高度的親和力，其中TiO2與磷酸鹽的結(jié)合能力最高調(diào)節(jié)pH值后，TiO2可用于富集磷酸肽當前23頁，總共97頁。離子交換和等電聚焦離子交換（strongaionexchange,SAX/strongcaionexchange,SCX）:離子強度不同進行分離IEF:等電點不同進行分離主要用于復雜樣本的預分離，降低樣本復雜程度結(jié)合金屬親和等其他富集技術(shù)，可取得很好的效果當前24頁，總共97頁。2、磷酸肽的識別質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合磷酸酶水解當前25頁，總共97頁。MALDI-TOFMS可以通過肽指紋譜(PMF)鑒定蛋白質(zhì)，與磷酸酯酶處理相結(jié)合可以確定磷酸化位點原理：磷酸酯酶處理后，磷酸化的肽丟失磷酸基團而產(chǎn)生特定質(zhì)量數(shù)的變化，MALDI-TOFMS通過檢測這種質(zhì)量數(shù)的變化而確定磷酸化位點當前26頁，總共97頁。原理通過MALDI-TOF/TOF一級質(zhì)譜可發(fā)現(xiàn)與肽段分子量理論值相差80Da

(HPO3=80Da)的質(zhì)譜峰,該峰的二級質(zhì)譜圖中如果母離子與旁邊的最高強度的質(zhì)譜峰相差98Da(中性丟失H3PO4=98Da),則可確定該肽段為磷酸化肽段,

進一步通過二級或多級質(zhì)譜的譜圖確認具體的磷酸化位點

利用β－消除反應使絲氨酸、蘇氨酸磷酸化殘基轉(zhuǎn)化為氨乙基丙氨酸,后者為賴氨酸的同形物,此位點可被胰蛋白酶和Lys-C

肽鏈內(nèi)切酶等酶特異性識別、酶切,通過質(zhì)譜即可很容易地判斷磷酸化位點。消除反應是從反應物的相鄰碳原子上消除兩個原子或基團，形成一個π鍵的過程1,2–消除反應（β-消除反應）當前27頁，總共97頁。PSD-MALDI-MS分析源后衰變發(fā)生在源內(nèi)離子化之后的分子裂解MALDI-TOF-MS離子源內(nèi)發(fā)生的離子在真空無電場飛行管飛行過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)裂解，丟失一個中性分子后產(chǎn)生了碎片離子碎片離子具有與其前體離子相同的飛行速度，但由于質(zhì)量小，動能比前體離子?。▉喎€(wěn)離子）β－消除反應丟失HPO3或H3PO4，產(chǎn)生數(shù)減少80Da或98Da亞穩(wěn)離子當前28頁，總共97頁。圖利用MALDI-TOF/TOF譜圖鑒定磷酸化肽段a:酶切產(chǎn)物的一級質(zhì)譜圖。磷酸化肽段的質(zhì)譜峰用星號標出,其相對未磷酸化肽段的理論分子量位移80Da(HPO3=80Da);b:a中標記星號的質(zhì)譜峰的二級質(zhì)譜分析。在圖中可見比母離子小98Da(H3PO4=98Da)的中性缺失峰

當前29頁，總共97頁。串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)前體離子掃描通過檢測磷酸基團產(chǎn)生的特定片段來報告磷酸肽的存在；磷酸化肽經(jīng)CID（碰撞誘導解離）后會產(chǎn)生磷酸基團的特異性片段，這些特異性的片段在用串聯(lián)質(zhì)譜進行前體離子掃描時可作為磷酸肽的“報告離子”當前30頁，總共97頁。前體離子掃描在三級四級串聯(lián)質(zhì)譜采用使各種質(zhì)荷比的離子依次通過Q1分析器，Q2為碰撞誘導解離室，將Q3分析器的電壓和頻率設(shè)定為只能傳輸某一特定質(zhì)荷比，即特定質(zhì)荷比的子離子直接檢測在碰撞誘導解離過程中丟失的碎片離子當前31頁，總共97頁。前體離子掃描分析磷酸肽負離子模式設(shè)定Q3中僅能通過的子離子質(zhì)荷比m/z79，即磷酸肽丟失的PO3-，這樣得到的質(zhì)譜圖僅顯示丟失m/z79的離子的譜峰丟失磷酸根離子的磷酸肽譜峰多肽產(chǎn)生的各種碎片離子中，質(zhì)量數(shù)在79Da附近的幾乎沒有當前32頁，總共97頁。中性丟失掃描具有兩級質(zhì)量分析器和碰撞誘導解離室的串聯(lián)質(zhì)譜儀Q1和Q2同步掃描，但掃描范圍不一樣，保持一個特定的電壓差值，這個電壓差所代表的質(zhì)荷比m/z值代表一個中性分子的質(zhì)量將Q1輸送來的離子碰撞誘導裂解，再將碎片離子送入Q3只有在Q2中誘導裂解后能丟失這一特定中性分子的離子才會被Q3傳輸?shù)綑z測器當前33頁，總共97頁。中性丟失掃描分析磷酸肽從帶一個正電荷的[M+H]+肽混合物中尋找丟失中性磷酸分子H3PO4的磷酸肽，則Q1和Q3的掃描電壓差所代表的質(zhì)荷比應為m/z98從帶兩個正電荷的[M+2H]2+肽混合物中尋找丟失中性磷酸分子H3PO4的磷酸肽，則Q1和Q3的掃描電壓差所代表的質(zhì)荷比應為m/z49只能分析磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸當前34頁，總共97頁。3、磷酸化氨基酸位點的確定用于確定磷酸化肽中磷酸化位點的質(zhì)譜方法基于兩種不同原理第一種方法取決于磷酸酯鍵的化學穩(wěn)定性如在ESI質(zhì)譜儀的碰撞室或離子源中，或在MALDI—MS的源后裂解（PSD）過程中磷酸化肽可通過磷酸酯鍵斷裂產(chǎn)生的碎片離子鑒定當前35頁，總共97頁。第二種方法基于肽段增加的磷酸酯基團的質(zhì)量數(shù)如果蛋白是已知的，可通過質(zhì)量數(shù)來確定肽段在某些情況下，肽段只含有一個絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，則很容易找到磷酸化位點，但在大多數(shù)情況下肽段含有許多個絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，則確定磷酸化位點發(fā)生困難

當前36頁，總共97頁。五、蛋白質(zhì)磷酸化的定量分析定量：磷酸化蛋白與其對應的非磷酸化蛋白質(zhì)的比例研究的蛋白樣本酶切后等分成兩部分,一部分直接用CH3OH甲酯化,另一部分經(jīng)過磷酸酯酶處理后用CD3OH甲酯化,隨后將兩者混合進行串聯(lián)質(zhì)譜研究,即可得到磷酸化肽段的磷酸化水平的定量信息該技術(shù)設(shè)計巧妙,但甲酯化的效率可能會影響定量結(jié)果當前37頁，總共97頁。一種基于穩(wěn)定同位素標記的分析技術(shù)SILAC(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture)采用含有輕同位素型和重同位素型氨基酸的培養(yǎng)液對不同細胞分別進行培養(yǎng),使細胞內(nèi)的蛋白被同位素穩(wěn)定標記,提取細胞蛋白并將其等量混合,酶切后進行質(zhì)譜鑒定,通過分析不同標記型肽段的相對量而確定蛋白的相對量15N穩(wěn)定同位素標記法、磷酸肽同位素親和標記法既可以研究全蛋白質(zhì)組的變化,也可以結(jié)合磷酸化肽段的富集技術(shù)和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對磷酸化肽段進行定量研究當前38頁，總共97頁。15N穩(wěn)定同位素標記法一種正常培養(yǎng)基，一種由15N提供N源質(zhì)譜圖中，每一個水解肽段表現(xiàn)為一對峰15N/14N的同位素豐度比可以體現(xiàn)出兩種細胞來源蛋白質(zhì)表達量的相對水平兩種細胞表達完全一致，所有15N/14N豐度比將在一個平均值范圍內(nèi)兩種來源的蛋白質(zhì)的磷酸化程度不同，其含磷肽段與相應未磷酸化肽段的15N/14N的豐度比就與平均值不同，根據(jù)其比值來進行磷酸化程度的相對定量當前39頁，總共97頁。15N穩(wěn)定同位素標記法當前40頁，總共97頁。磷酸肽同位素親和標記法使磷酸肽或磷酸化蛋白在堿性環(huán)境下發(fā)生β消除，同時用親核試劑攻擊形成的雙鍵并發(fā)生加成反應對不同來源的磷酸肽或磷酸化蛋白使用不同的親核試劑其中一種試劑上的氫由氘代替再通過化學反應在加成的親核試劑上連接一個親和標簽（生物素）當前41頁，總共97頁。磷酸肽同位素親和標記法當前42頁，總共97頁。磷酸肽同位素親和標記法當前43頁，總共97頁。磷酸肽同位素親和標記法當前44頁，總共97頁。磷酸肽同位素親和標記法當前45頁，總共97頁。第二節(jié)糖基化蛋白質(zhì)的鑒定糖蛋白是由短的寡糖鏈與蛋白質(zhì)共價相連構(gòu)成的分子糖蛋白包括酶、激素、載體、凝集素、抗體等糖蛋白攜帶某些蛋白質(zhì)代謝去向的信息寡糖鏈在細胞識別、信號傳遞中起關(guān)鍵作用當前46頁，總共97頁。一、糖蛋白的結(jié)構(gòu)特征糖鏈與蛋白的連接方式①N-糖苷鍵型：寡糖鏈（N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAC的β-羥基）與Asn的酰胺基、N-未端的α-氨基、Lys或Arg的ω-氨基相連②O-糖苷鍵型：寡糖鏈（GalNAC的α-羥基）與Ser、Thr和羥基賴氨酸、羥脯氨酸的羥基相連③S-糖苷鍵型：以半胱氨酸為連接點的糖肽鍵④酯糖苷鍵型：以天冬氨酸、谷氨酸的游離羧基為連接點當前47頁，總共97頁。糖蛋白中糖鏈的結(jié)構(gòu)

糖蛋白中的糖鏈變化較大，含有豐富的結(jié)構(gòu)信息，寡糖鏈往往是受體、酶類的識別位點N-糖苷鍵型（N-連接）①高甘露糖型：由GlcNAc和甘露糖組成②復合型：除了GlcNAc和甘露糖外、還有果糖、半乳糖、唾液酸；③雜合型：包含①和②的特征，五糖核心O-糖苷鍵型（O-連接）沒有五糖核心當前48頁，總共97頁。分類可溶性糖蛋白存在于細胞內(nèi)液、各種體液及腔道腺體分泌的粘液中血漿蛋白除白蛋白外皆為糖蛋白。包括酶（如核酸酶類、蛋白酶類、糖苷酶類）、肽類激素（如絨毛膜促性腺激素、促黃體激素、促甲狀腺素、促紅細胞生成素）、抗體、補體、以及某些生長因子、干擾素、抑素、凝集素及毒素等當前49頁，總共97頁。膜結(jié)合糖蛋白肽鏈由疏水肽段及親水肽段組成，疏水肽段可為一至數(shù)個，并通過疏水相互作用嵌入膜脂雙層中；親水肽段暴露于膜外糖鏈連接在親水肽段并有嚴格的方向性：在質(zhì)膜表面糖鏈一律朝外，在細胞內(nèi)膜一般朝腔面包括酶、受體、凝集素及運載蛋白等，常參與細胞識別，并可作為特定細胞或細胞在特定階段的表面標志或表面抗原當前50頁，總共97頁。凝集素糖結(jié)合蛋白，能專一識別某一特定的單糖或寡糖中特定的糖基序列而與之結(jié)合富集、濃縮、分離、糖鏈的結(jié)構(gòu)分析當前51頁，總共97頁。結(jié)構(gòu)糖蛋白為細胞外基質(zhì)中的不溶性大分子糖蛋白膠原及各種非膠原糖蛋白(纖粘連蛋白、層粘連蛋白等)作為細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分起支持、連接及緩沖作用，參與細胞的識別、粘著及遷移，并調(diào)控細胞的增殖及分化

當前52頁，總共97頁。二、生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定糖蛋白糖蛋白糖苷內(nèi)切酶還原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TO-MS糖含量相對分子量MALDI-TO-MSESI串聯(lián)質(zhì)譜凝集素提取氨基酸序列糖基化位點糖肽片段當前53頁，總共97頁。糖含量、糖苷鍵類型、糖基化位點是糖蛋白一級結(jié)構(gòu)的重要指標糖蛋白的平均分子量及糖含量的測定糖苷內(nèi)切酶將糖鏈切掉，將反應前后的質(zhì)譜圖比較，就能直接表述糖鏈的平均質(zhì)量，而糖蛋白的平均糖含量可由糖鏈的平均質(zhì)量占糖蛋白平均相對分子質(zhì)量的百分比來表示當前54頁，總共97頁。糖基化類型及糖基化位點的確定蛋白酶酶切和糖苷內(nèi)切酶相結(jié)合先用蛋白酶將糖蛋白酶切成含有或不含有糖鏈的肽片段，獲得糖蛋白的肽質(zhì)量指紋譜，再用糖苷內(nèi)切酶將糖鏈切除，其肽質(zhì)量指紋譜將發(fā)生變化，原含有糖肽段的質(zhì)量由于糖鏈的丟失在質(zhì)譜圖發(fā)生位移，通過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫檢索可以得到位移肽段的氨基酸序列，從而確定糖基化位點當前55頁，總共97頁。當前56頁，總共97頁。1、MALDI-TOF-MS的應用基質(zhì)的選擇α-腈基－4－羥基肉桂酸當前57頁，總共97頁。1、MALDI-TOF-MS的應用糖蛋白的平均分子質(zhì)量及糖含量的測定糖蛋白分子結(jié)構(gòu)具有不均一性糖鏈的微不均一性糖基化位點的不均一性多羥基結(jié)構(gòu)的糖鏈使其質(zhì)子化能力低糖鏈末端唾液酸的干擾當前58頁，總共97頁。1、MALDI-TOF-MS的應用糖蛋白的平均分子質(zhì)量及糖含量的測定糖鏈的微不均一性質(zhì)譜圖上表現(xiàn)一簇峰G＋各峰之間約相差一個糖基有時還出現(xiàn)雙電荷峰G2＋分子離子峰變寬，糖鏈分子質(zhì)量越大，峰越寬，靈敏度越差當前59頁，總共97頁。1、MALDI-TOF-MS的應用典型的糖蛋白的出峰模式，不均一性造成多種糖形存在為51000的雙電荷峰雜質(zhì)N-糖基化質(zhì)譜分析圖當前60頁，總共97頁。1、MALDI-TOF-MS的應用去糖基化處理的質(zhì)譜分析圖去糖基化的單電荷峰，圖譜變得簡單且峰形尖銳去糖基化的雙電荷峰完整的未發(fā)生去糖基化的單電荷峰當前61頁，總共97頁。1、MALDI-TOF-MS的應用經(jīng)唾液酸酶去唾液酸化處理的質(zhì)譜分析去唾液酸化的單電荷峰去唾液酸化的雙電荷峰非特異性降解產(chǎn)物當前62頁，總共97頁。當前63頁，總共97頁。1、MALDI-TOF-MS的應用糖基化類型及糖基化位點的確定尋找質(zhì)譜圖上峰的位移從位移峰的肽段序列中，尋找出可能連接糖鏈的氨基酸當前64頁，總共97頁。2、LC-ESI-Q-TOF-MS糖鏈結(jié)構(gòu)的分析串聯(lián)質(zhì)譜的母離子掃描技術(shù)選擇特定的糖鏈離子，經(jīng)碰撞活化使用惰性氣體將其打碎，從而推斷糖鏈結(jié)構(gòu)如人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)分析選擇以HPLC分離的一個糖鏈，其分子離子雙電荷[M+2H]2＋在電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜中為823.8，將其設(shè)為母離子，以惰性氣體與其碰撞產(chǎn)生碎片當前65頁，總共97頁。2、LC-ESI-Q-TOF-MS糖鏈結(jié)構(gòu)的分析當前66頁，總共97頁。2、LC-ESI-Q-TOF-MS糖鏈結(jié)構(gòu)的分析中性丟失當前67頁，總共97頁。3、凝集素在糖蛋白分析中的應用伴刀豆蛋白（ConA）對高甘露糖型N-糖鏈有專一性麥胚凝集素（WGA）對雜合型N-糖鏈有專一性兵豆凝集素對親和核心巖藻糖類糖鏈有專一性當前68頁，總共97頁。糖蛋白結(jié)構(gòu)質(zhì)譜解析母離子當前69頁，總共97頁。糖蛋白結(jié)構(gòu)質(zhì)譜解析由于N-糖蛋白殼二糖核心中與天冬酰胺連接的乙酰葡萄糖胺殘基會在碰撞過程中發(fā)生跨環(huán)斷裂，先后產(chǎn)生質(zhì)荷比相差120，80的中性碎片丟失，這兩個碎片是發(fā)現(xiàn)糖基化位點及糖肽氨基酸序列的標志當前70頁，總共97頁。糖蛋白結(jié)構(gòu)質(zhì)譜解析當前71頁，總共97頁。3、凝集素在糖蛋白分析中的應用當前72頁，總共97頁。第三節(jié)蛋白質(zhì)相互作用的鑒定免疫沉淀酵母雙雜交系統(tǒng)噬菌體展示技術(shù)串聯(lián)親和純化(tandemaffinitypurification，TAP)蛋白質(zhì)片段互補分析（proteinfragmentcomplementationanalysis,PCA）蛋白質(zhì)芯片當前73頁，總共97頁。酵母雙雜交（twohybridsystem）研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控時建立利用真核生長轉(zhuǎn)錄因子的兩個不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain)，分別與目標蛋白X及可能與目標蛋白相互作用的蛋白Y相連，并共同轉(zhuǎn)入酵母細胞;如果蛋白X與Y能夠發(fā)生相互作用就能使轉(zhuǎn)錄因子原來分開的兩部分結(jié)合，形成完整的活性形式從而激活下游報告基因;通過檢測報告基因的表達產(chǎn)物就可判斷兩種蛋白是否發(fā)生相互作用

當前74頁，總共97頁。當前75頁，總共97頁。酵母激活因子GAL4：N端：147個氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)，C端：113個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptionactivationdomain,AD)GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進行轉(zhuǎn)錄組成部分：（1）與BD融合的蛋白表達載體，被表達的蛋白稱誘餌蛋白（bait）（2）與AD融合的蛋白表達載體，被其表達的蛋白稱靶蛋白（prey）（3）帶由一個或多個報告基因的宿主菌株酵母雙雜交系統(tǒng)當前76頁，總共97頁。YeastTwoHybrid原理BDXCOOHADcDNANH2

COOH共轉(zhuǎn)化+BDX?ADGal4Gal4PromoterReporterTrp-Leu-cDNAlibraryNH2Gal4Gal4當前77頁，總共97頁。當前78頁，總共97頁。優(yōu)點作用信號是在融合基因表達后，在細胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟檢測在活細胞內(nèi)進行，可以在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況檢測的結(jié)果可以是基因表達產(chǎn)物的積累效應，因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析細胞漿、細胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白以用作大規(guī)模的蛋白篩選，在較短時間內(nèi)對找到某些藥物對相關(guān)組織主要的作用蛋白，對于藥物的修飾和改進明確方向當前79頁，總共97頁。局限性(1)不能研究具有自激活特性的蛋白質(zhì)；(2)只能檢測兩個蛋白間的相互作用；(3)檢測的相互作用需發(fā)生在細胞核內(nèi)，對于不能定位到細胞核中的蛋白質(zhì)無法研究；(4)大部分實驗中有將近50%的假陽性率，且推測的相互作用僅有3%在兩種以上的實驗中得到驗證當前80頁，總共97頁。噬菌體展示技術(shù)噬菌體表面展示技術(shù)是一種對多肽功能非常有效的篩選技術(shù)，即將外源蛋白分子或多肽的基因克隆到絲狀噬菌體基因組中，與噬菌體外膜蛋白融合表達，展示在噬菌體顆粒的表面由于外源蛋白或多肽的基因型和表型統(tǒng)一在同一噬菌體顆粒內(nèi)，因此，通過表型篩選就可以獲得它的編碼基因當前81頁，總共97頁。當前82頁，總共97頁。當前83頁，總共97