蛋白質(zhì)與酶工程酶的提取分離和純化

蛋白質(zhì)與酶工程酶的提取、分離和純化檢驗醫(yī)學院張雪梅當前1頁，總共85頁。一、概述二、酶的提取三、酶的分離純化四、酶的結晶五、濃縮與干燥六、酶純化步驟的設計及評價酶的提取、分離和純化當前2頁，總共85頁。一、概述1-1酶提取與分離純化的定義

將酶從細胞或其它含酶原料中提取出來，再與其它物質(zhì)分開，從而獲得所需酶的技術過程*酶的純化程度根據(jù)需要而定*純化方法多種多樣，為獲得較好的效果往往是2種或2種以上聯(lián)合應用

當前3頁，總共85頁。1-2提取純化之目的1)酶催化功能的應用2)酶學研究

酶的結構、功能、催化機制、催化動力學酶的生物合成及其調(diào)控規(guī)律等

1-3純化的必要性1)生物細胞中同時存在多種多樣的酶2)多酶可能作用于同一個底物3)酶在生物細胞中的分布并不是均一的當前4頁，總共85頁。二、酶的提?。╡xtraction)2-1了解所分離酶在細胞中的分布

1、細胞外酶：由細胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到胞外發(fā)揮作用的酶；大多屬于水解酶，通常含量高，容易得到2、細胞內(nèi)酶：在細胞內(nèi)合成后并不分泌到細胞外，而在細胞內(nèi)起催化作用。該類酶在細胞內(nèi)往往與細胞器結合，不僅有一定的區(qū)域性，而且催化的反應具有一定順序性

當前5頁，總共85頁。真核細胞內(nèi)酶的分布①細胞膜：ATP酶、腺苷酸環(huán)化酶等②細胞核：DNA聚合酶、連接酶和RNA聚合酶等③線粒體：三羧酸循環(huán)、電子傳遞、氧化磷酸化、尿素循環(huán)、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白質(zhì)合成、DNA聚合酶、RNA聚合酶等④高爾基體：多糖、核蛋白粘液生成酶⑤溶酶體：各種水解酶等⑥葉綠體：參與光合作用形成ATP、NADPH有關的酶類、與暗反應有關的酶系當前6頁，總共85頁。線粒體主要酶的分布（約有120種酶）部位酶的名稱外膜單胺氧化酶、犬尿氨酸羥化酶、NADH-細胞色素C還原酶、脂類代謝有關的酶（酰基輔酶A合成酶、脂肪酸激酶等）特征酶：單胺氧化酶膜間隙腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亞硫酸氧化酶特征酶：腺苷酸激酶內(nèi)膜細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶、NADH脫氫酶、肉堿酰基轉(zhuǎn)移酶、-羥丁酸和-羥丙酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、ATP合成酶系、腺嘌呤核苷酸載體特征酶：細胞色素（c）氧化酶基質(zhì)檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、延胡索酸酶、谷氨酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶復合體、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)和核酸合成酶系、脂肪酸氧化酶系特征酶：蘋果酸脫氫酶當前7頁，總共85頁。2-2起始材料的選擇

原則：選取酶含量高的材料可以是天然的動植物

或人工培養(yǎng)的微生物、動植物細胞等

*注意材料的生長階段*注意酶在生物體內(nèi)的富集區(qū)域由于從動物內(nèi)臟或植物果實中提取酶制劑受到原料和成本的限制，因此，目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來獲得大量的酶制劑當前8頁，總共85頁。2-3細胞膜和細胞壁的破碎1、主要方法：當前9頁，總共85頁。1）當前10頁，總共85頁。當前11頁，總共85頁。2）當前12頁，總共85頁。當前13頁，總共85頁。超聲波破碎法當前14頁，總共85頁。3）當前15頁，總共85頁。4）當前16頁，總共85頁。2、選擇原則如酶法+超聲當前17頁，總共85頁。

2-4酶的提取

1、定義

在適當條件下，用適當?shù)奶崛∫禾幚砗冈希姑赋浞秩苡谄渲械倪^程。

2、提取液的選擇

根據(jù)酶的結構和溶解特性來選擇適當?shù)奶崛∫?/p>

*極性物質(zhì)易溶解于極性溶劑，反之，即相似相溶*酸性物質(zhì)易溶解于堿性溶液，反之亦然。當前18頁，總共85頁。2-4酶的提取3、常用的提取液：酶通常都溶于水，因此通常用水作為溶劑，配制成一定濃度的稀酸、稀堿、稀鹽溶液進行抽提4、有些酶與脂質(zhì)結合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑抽提，如：丙酮粉，有助于酶與脂肪或磷脂膜分離；高離子強度水溶液也有助于酶從結合的膜上解析下來。當前19頁，總共85頁。2-5主要的提取方法1、鹽溶液提取該法用于在低濃度鹽溶液中溶解度大的酶的提取常用的鹽濃度：0.02-0.05mol/L，大多數(shù)P酶用該法提取

R酶常用0.14mol/L的NaCl溶液提取。

*鹽溶現(xiàn)象：低鹽條件下，酶在水中的溶解度隨鹽濃度升高而增加的現(xiàn)象

*鹽析現(xiàn)象：當鹽濃度達到一定界限后，酶的溶解度則隨鹽濃度升高而降低的現(xiàn)象當前20頁，總共85頁。2、酸溶液提取

在酸性條件下溶解度大并穩(wěn)定的酶可用此法如：胰蛋白酶（pI=8.9）可用0.12mol/L的硫酸溶液3、堿溶液提取在堿性條件下溶解度大并穩(wěn)定的酶該法適用如：大腸埃希菌的L-天冬酰胺酶（pI=4.85）可用pH11-12.5的溶液當前21頁，總共85頁。

4、有機溶劑提?。喝缑概c脂質(zhì)結合牢固，或含有較多非極性基團的酶，可用與水混溶的有機溶劑（乙醇、丙酮、丁醇等），如：

P酶：膽堿酯酶、細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶等用丁醇萃取，有較好效果

R酶：可用酸苯酚溶液提取當前22頁，總共85頁。主要的提取方法小結地當前23頁，總共85頁。5、影響酶提取的其它重要因素溫度：適當提高，可以提高酶的溶解度和酶分子的擴散速度；過高則引起酶失活pH:

在等電點條件下，酶的溶解度最小；為提高溶解度，要避開酶的等電點;但是，也不宜偏離pI太遠（過高或過低），以免引起酶變性失活當前24頁，總共85頁。提取液體積

*適當增加其體積，可以提高酶的產(chǎn)率*過量，則降低[酶]，增加后續(xù)分離純化的難度一般為原始材料的3-5倍，且分3次使用

加入保護劑，以提高酶的穩(wěn)定性如酶的底物、輔酶和某些抗氧化劑當前25頁，總共85頁。三、酶的分離純化

（isolation,separation)(purification)3-1分離純化方法分類1、基于分子大小或質(zhì)量

(1)離心(2)透析(3)凝膠過濾(4)超過濾2、基于電荷

(1)離子交換色譜(2)電泳(3)等電聚焦當前26頁，總共85頁。3、基于溶解度

改變pH、離子強度、介電常數(shù)等實現(xiàn)的沉淀分離：

(1)鹽析法(2)復合沉淀法(3)有機溶劑沉淀法(4)等電點沉淀法(5)選擇性變性沉淀法當前27頁，總共85頁。4、基于特異性結合位置/親和力的差異

親和色譜（層析）5、其它方法（略）（1）基于分配系數(shù)的差異：雙水相系統(tǒng)萃取法（2）基于疏水作用的差異：疏水層析（3）在磷酸鈣凝膠柱上分級吸附（4）羥基磷灰石色譜（5）冷凍干燥（濃縮）當前28頁，總共85頁。1、沉淀分離3-2常用的分離純化方法當前29頁，總共85頁。取正常人血清5ml加等量生理鹽水混勻攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨使飽和度為20％

↓4℃，10min離心(3000rpm),10min，棄沉淀上清繼續(xù)滴加飽和硫酸銨使飽和度為50％。

↓置4℃，3小時以上離心(3000rpm),10min，棄上清所得沉淀物以0.02MPH7.4PBS溶解至5ml↓裝入透析袋中對PBS充分透析（換液3次）

↓萘氏試劑測透析外液無黃色

取少許透析袋液適當倍數(shù)稀釋后，測蛋白含量。例鹽析純化血清免疫球蛋白當前30頁，總共85頁。2、離心（centrifugation)（1）定義：利用離心機旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的顆粒分離的技術過程。*優(yōu)點：處理量大，可達幾升*離心條件的選擇：以靶酶與雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的差異為依據(jù)，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離心條件當前31頁，總共85頁。常速/低速離心機：主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等有形物質(zhì)分離，也可分離較大顆粒的酶結晶分離；高速離心機：最大轉(zhuǎn)速1~2.5x104rpm。在酶的分離中，主要用于沉淀及細胞碎片和細胞器的分離；為防止離心過程中溫度升高而致酶失活，一般用高速冷凍離心機；超速離心機：最大轉(zhuǎn)速達2.5~12x104rpm。主要用于DNA、RNA（酶）、蛋白質(zhì)(酶）等生物大分子以及細胞器、病毒等的分離純化等。（2）離心機的常用分類當前32頁，總共85頁。當前33頁，總共85頁。當前34頁，總共85頁。

①差速離心（differentialcentrifugation)：即采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離。主要用于分離那些差異大的顆粒；操作簡單、方便，但是分離效果較差，一般用于粗分。（3）離心方法的選擇當前35頁，總共85頁。

差速離心舉例沉淀：細胞核上清液沉淀：線粒體溶酶體細胞膜碎片上清液沉淀：核糖核蛋白體上清液：可溶性成分500g,10min已經(jīng)破碎的細胞10,000g,10min100,000g,3h當前36頁，總共85頁。

②密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，通過重力或離心力場的作用，使樣品中的組份依據(jù)其沉降速率和密度的不同而分層、分離這類分離又分為：

差速-區(qū)帶（Rate—Zonal，R-Z）等密度（Isopycnic）/平衡密度梯度離心當前37頁，總共85頁。A.差速-區(qū)帶(R-Z)：是根據(jù)分離的顆粒在梯度液中沉降速度的不同，在離心力作用下處于不同密度梯度層，從而形成一系列區(qū)帶，達到彼此分離的目的。

方法：在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、CsCl等），待分離的樣品以很薄的一層鋪在梯度液的上部，在離心過程中由于不同組份在梯度液中沉降速率的差別，而在離心的某一時刻形成了數(shù)個分別含不同組份顆粒的區(qū)帶。當前38頁，總共85頁。B.平衡密度梯度離心法（equilibriumdensitygradientcentrifigation)/等密度梯度離心法當欲分離的不同顆粒的

密度不同時，配制包含其密度范圍的離心介質(zhì)，在離心力作用下，不同浮力密度的顆?；虺两怠⒒蛏细?，只要時間足夠長，就可以一直移動到與它們各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度點），形成區(qū)帶，從而實現(xiàn)分離目的

常用介質(zhì)：銫鹽（氯化銫，硫酸銫，溴化銫等）當前39頁，總共85頁。

（4）注意離心溫度和介質(zhì)pH的影響，以免目的酶凝集、變性和失活，甚至引起轉(zhuǎn)子和離心機其它部件的腐蝕。

*一般4℃左右，耐熱酶除外*必須是酶穩(wěn)定的范圍內(nèi)，必要時采用緩沖液當前40頁，總共85頁。3、過濾與膜分離當前41頁，總共85頁。當前42頁，總共85頁。當前43頁，總共85頁。（1）透析

透析（dialysis)：利用小分子物質(zhì)的擴散作用，使小分子不斷透過半透膜而擴散到膜外，而大分子則被截留于膜內(nèi)，從而實現(xiàn)分離。用途：去除酶液中無機鹽、有機溶劑或低分子量的抑制劑缺點：耗時；透析結束后，樣品體積大，濃度低，難于工業(yè)化生產(chǎn)

透析膜是帶有微孔的篩子，其孔徑在一定范圍內(nèi)是可選的；可用動物膜、羊皮紙、火棉膠等制成。當前44頁，總共85頁。定義：以膜兩邊的流體靜壓差為推動力的膜分離技術。在靜壓差作用下，小于孔徑的顆粒穿過膜孔，而大于孔徑者被截留。超濾膜截留的顆粒直徑為2--200nm，相等于分子量1x103-5x105，主要用于病毒和各種生物大分子的分離。（2）超濾（ultrafiltration)

當前45頁，總共85頁。

超濾技術的優(yōu)勢：是純物理過程，不會改變產(chǎn)品的理化性能和活性與離心和層析法比，處理量大，時間短，易線性放大，成本較低收集細胞效果優(yōu)良，處理量大，保持細胞活性良好，操作簡單可以進行多種工藝的處理，如：細胞、菌體收集、破碎后的澄清過濾、分離、濃縮、緩沖液更換等投資小，通用性強當前46頁，總共85頁。超濾技術應用：

濃縮和透析除熱源脫鹽和緩沖液交換小分子處理細胞收集/澄清病毒收集/澄清當前47頁，總共85頁。4、色譜法（層析法）當前48頁，總共85頁。（1）離子交換色譜（層析）定義：

IonExchangeChromatography：以離子交換劑為固定相，特定的離子溶液為流動相，依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同進行分離純化的層析方式。使用規(guī)?？纱罂尚?；純化倍數(shù)為10左右當前49頁，總共85頁。離子交換劑分類

①按其活性基團的不同來分

*陽離子交換劑：其活性基團為酸性基團（如磺酸基，磷酸基，羧基等），在一定條件下，可以解離出氫離子（H+)與其它陽離子進行交換，故稱（如：

*陰離子交換劑：其活性基團為堿性基團（季胺，叔胺，仲胺，伯胺等），在一定條件下可解離出OH-與其它陰離子交換。如：當前50頁，總共85頁。

②按母體的種類分：母體（基質(zhì)）一般是不溶性聚合物，如樹脂、纖維素、葡聚糖、醇脂糖等

*離子交換纖維素:是纖維素作為母體，交換容量大（0.2-1.0mg/克干膠）*離子交換樹脂:聚苯乙烯樹脂為母體*離子交換凝膠:葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠為母體，交換容量更大2.5-4.5mg/克干膠）當前51頁，總共85頁。離子交換層析的基本步驟當前52頁，總共85頁。解吸方法--洗脫原理

蛋白質(zhì)是通過靜電引力可逆結合在相應的離子交換劑上，洗脫蛋白質(zhì)（即打開蛋白質(zhì)與離子交換劑之間的離子鍵）的常用方法：

①加大反離子的濃度，常用的反離子是NaCl

②改變?nèi)芤旱膒H

（改變結合基團的電荷）

③同時改變pH與離子強度當前53頁，總共85頁。分離酶蛋白時交換劑選擇的一般原則：

根據(jù)酶穩(wěn)定性的需要：

*酶蛋白穩(wěn)定存在的pH<pI，用陽離子交換劑*酶蛋白穩(wěn)定存在的pH>pI，用陰離子交換劑*兩種pH條件下均能穩(wěn)定存在，二種交換劑均可當前54頁，總共85頁。

也稱凝膠層析、凝膠過濾或分子排阻層析：是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含有各種組份的相對分子量不同而達到分離的一種層析技術

20世紀50年代末發(fā)展起來的快速簡便的分離技術—操作簡便，不需要再生處理即可反復使用，適用于分子量不同的各種物質(zhì)的分離（2）分子篩層析當前55頁，總共85頁。原理：

其分離是因為不同大小的分子或進入或不進入凝膠微孔，因而所經(jīng)過的路程不同、走過柱全長所需的時間各異，實現(xiàn)彼此分離的目的：能進入微孔的小分子不斷地進出于一個個凝膠顆粒的微孔，做無定向的分子擴散運動（布朗運動），因而其向下移動的速度就很慢；不能進入微孔的大分子則只能分布于凝膠顆粒的間隙，隨溶液流動而進行垂直向下的移動，以較快的速度通過凝膠柱。當前56頁，總共85頁。當前57頁，總共85頁。凝膠材料種類層析用的微孔凝膠是凝膠材料與交聯(lián)劑交聯(lián)聚合而成的；凝膠內(nèi)部具有微細的、多孔網(wǎng)狀結構。*常用的交聯(lián)劑：環(huán)氧氯丙烷*常用的凝膠材料：葡聚糖凝膠（SephadexG）交聯(lián)丙烯基葡聚糖（Sephacryl）聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gelP）瓊脂糖凝膠（Sepharose)

*新型凝膠材料：superose，superdex

*分離性能：凝膠孔徑大小決定其能夠分離的顆粒的大??；凝膠顆粒越細，流速越慢，分離效果越好。

當前58頁，總共85頁。相對分子量不是唯一的分離依據(jù)；

對于分子量相同的分子，也可依據(jù)其分子形狀的不同，再加上各種物質(zhì)與凝膠之間的非特異性吸附作用的差異，也可以分離。當前59頁，總共85頁。分子篩層析的優(yōu)缺點當前60頁，總共85頁。（3）親和色譜(層析）（1）定義：利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，分離純化生物分子的技術，是酶分離純化的重要技術

專一而可逆的結合包括：酶蛋白與底物、競爭性抑制物和輔助因子酶蛋白（抗原）與抗體酶RNA與互補的RNA當前61頁，總共85頁。

（2）原理：

酶的底物或競爭性抑制劑等通過共價鍵與惰性載體（如瓊脂糖）相連接，形成親和載體；當含酶混合物通過親和載體時，靶酶便與底物或競爭性抑制劑發(fā)生特異性結合，保留在柱子上，其它酶和雜蛋白則因“無處可依”而被洗出柱子

最后通過解吸附，將酶洗脫：

*通過加入底物與親和載體競爭酶分子*也可改變pH或離子強度使結合的酶解吸當前62頁，總共85頁。（3）特點①因其結合的專一性，所以產(chǎn)品的純度高②步驟少③親和載體的制備較難④造價高、規(guī)模小當前63頁，總共85頁。四、酶的結晶4-1定義：溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程，是酶分離純化的手段之一

時間可以從幾小時，幾天，幾個月，甚至幾年。為獲得較高純度的酶創(chuàng)造了條件。為酶結構和功能的研究提供了適宜的樣品；

當前64頁，總共85頁。Artorscience？當前65頁，總共85頁。1、鹽析結晶法：在適當?shù)臏囟群蚿H條件下，于接近飽和的酶液中緩慢增加某種中性鹽的濃度，使酶的溶解度慢慢降低，達到稍微過飽和狀態(tài)，而析出酶晶體的過程;多用硫酸銨，也用硫酸鈉等4-2結晶方法當前66頁，總共85頁。

通過汽相擴散的方式增加鹽濃度，使蛋白析出結晶。使用的試劑盒為商品化的HamptonResearchCrystalScreenI&II和PEGScreen篩選試劑盒進行，分別采用懸滴法和坐滴法。SP0987、SPD0280蛋白質(zhì)的結晶SP0987在0.2M檸檬酸鋰、20%PEG3350條件晶體質(zhì)量較好SPD0280在0.2M硫酸鎂、20%PEG3350條件下晶體質(zhì)量較好當前67頁，總共85頁。圖3SPD0280蛋白質(zhì)母體晶體圖4SPD0280蛋白質(zhì)硒代晶體

圖1SP0987蛋白質(zhì)母體晶體圖2SP0987蛋白質(zhì)硒代晶體

當前68頁，總共85頁。2、有機溶劑結晶法：是在接近飽和的酶液中慢慢加入某種有機溶劑，使酶的溶解度降低而析出酶晶體的過程；常用的有機溶劑有乙醇、丙醇、甲醇等3、透析平衡結晶法：將酶液裝進透析袋，對一定濃度的鹽溶液進行透析，使酶液逐漸達到飽和態(tài)而析出結晶的過程4、等電點結晶法：是通過緩慢改變酶液的pH，使之逐漸達到其等電點，而使酶析出結晶的過程當前69頁，總共85頁。

五、酶的濃縮與干燥

濃縮（concentration)與干燥（Drying)都是酶與溶劑（通常是水）分離的技術過程，是酶分離純化的一個重要環(huán)節(jié)1、濃縮：是從低濃度溶液中除去水分或其它溶劑而成為高濃度溶液的過程

蒸發(fā)濃縮，即通過加熱或減壓方法使溶液中的部分溶劑汽化蒸發(fā)，得以濃縮：真空蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器真空蒸發(fā)器薄膜蒸發(fā)器當前70頁，總共85頁。2、干燥：將固體、半固體或濃縮液中的水分或其它溶劑除去一部分，獲得含水較少的固體物質(zhì)的過程干燥時，首先是從其表面蒸發(fā)，隨后才是其內(nèi)部的水分子擴散到表面繼續(xù)蒸發(fā)。干燥后的物質(zhì)穩(wěn)定性好，利于保存、運輸和使用

常用的方法：真空干燥冷凍干燥噴霧干燥氣流干燥吸附干燥等

獲得的酶質(zhì)量最高的是冷凍干燥當前71頁，總共85頁。3、酶的保存

在合適的條件下，酶一般可保存較長的時間。在4℃下，可將酶懸浮在濃硫酸銨或PEG溶液中保存，10mg/ml的濃酶液可加入25%～50%甘油保存可將酶液過濾除菌，以減少微生物降解作用需還原性巰基維持催化活性的酶，可與1mmol.L-1EDTA和還原性巰基試劑一起在液氮中保存許多酶在冰凍狀態(tài)下保存得很好當前72頁，總共85頁。1、防止酶變性失活：（1）低溫（2）一般在中性pH環(huán)境操作（pH<4或>10不穩(wěn)定）（3）防重金屬,有機溶劑,微生物及蛋白酶污染2、追蹤酶分離每一步的總活力和比活力，評判每個步驟的可行性。6-1酶分離純化的基本原則六、酶純化步驟的設計及評價當前73頁，總共85頁。6-2選擇純化方法時注意事項1、樣品體積、酶和雜質(zhì)的量、pH及離子強度2、酶的物理化學性質(zhì)：大小、等電點、溶解度、親水性3、需要純化的酶的生物學性質(zhì)：穩(wěn)定性、輔助因子當前74頁，總共85頁。6-3分離方法的順序選擇樣品量由大到小分辨率由低到高酶的回收率由低到高預處理-→粗分-→細分-→酶的制品當前75頁，總共85頁。粗分：初步純化細分1細分2檢查純化的進展情況有機溶劑、硫酸銨沉淀、磷酸鈣分級吸附、超濾等離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析、聚焦層析等SDS電泳、等電聚焦當前76頁，總共85頁。6-4純化步驟的定量評價測定試樣中酶的活力和蛋白質(zhì)濃度計算比活力制作純化表酶單位/mg蛋白質(zhì)當前77頁，總共85頁。酶活性及比活性測定酶的活性是指酶催化化學反應的能力，其衡量的標準是酶促反應速度。酶的活性單位是衡量酶活力大小的尺度，它反映在規(guī)定條件下，酶促反應在單位時間（s、min或h）內(nèi)生成一定量（mg、μg、μmol等）的產(chǎn)物或消耗一定數(shù)量的底物所需的酶量。

酶活性測定的目的：反映組織、體液或提純?nèi)芤褐忻傅拇嬖谂c多寡（含量鑒定）。當前78頁，總共85頁。國際單位(IU)在特定的條件下，每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為