淋病等實驗室診斷技術(shù)(玉林)

性病實驗室診斷在性病防治中的作用效果評價臨床服務(wù)疫情監(jiān)測科學(xué)研究實驗室診斷當(dāng)前1頁，總共84頁。實驗室診斷在性病防治中的作用經(jīng)典性病監(jiān)測性病梅毒淋病軟下疳性病性淋巴肉芽腫梅毒淋病軟下疳性病性淋巴肉芽腫非淋菌性尿道炎生殖器皰疹尖銳濕疣HIV/AIDS新的方法監(jiān)測的性病梅毒淋病生殖道沙眼衣原體感染生殖器皰疹尖銳濕疣HIV/AIDS當(dāng)前2頁，總共84頁。性病實驗室診斷在性病防治中的作用冰山一角感染者有癥狀者就診者正確診斷者接受治療者治愈者當(dāng)前3頁，總共84頁。在性病臨床服務(wù)中的應(yīng)用 確診有癥狀的病例實驗室檢測對有癥狀的性病患者可以提高臨床診斷的特異性，達到明確診斷的目的。發(fā)現(xiàn)無癥狀的感染有些性病感染者，特別是女性，在感染后往往不表現(xiàn)出典型的癥狀，或癥狀輕微。對于這類人群只有通過實驗室檢測方法才能發(fā)現(xiàn)其感染。從而減少由于感染后未能得到及時的治療而引起嚴(yán)重的并發(fā)癥及后遺癥以及造成新的傳播。當(dāng)前4頁，總共84頁。在性病臨床服務(wù)中的應(yīng)用

指導(dǎo)臨床實踐了解病原體對藥物的敏感性及其流行趨勢，從而為臨床治療提供可靠的依據(jù)，保障治療的有效性。此外，實驗室檢測對新藥的推廣應(yīng)用和新治療方案的效果評估也提供了必要的支持。觀察療效及判斷治愈性病治療效果的正確評價，有助于盡早切斷傳染源、預(yù)防并發(fā)癥及后遺癥的發(fā)生。臨床療效的判斷往往需要借助于實驗室的檢測。當(dāng)前5頁，總共84頁。性病實驗室診斷的現(xiàn)狀梅毒: TPPA/TPHA淋病: 培養(yǎng)沙眼衣原體: 核酸檢測/EIA生殖器皰疹: 抗原/抗體EIA尖銳濕疣: 核酸檢測基本普及方法梅毒: RPR/TRUST淋球菌: 涂片鏡檢沙眼衣原體: 快速抗原檢測加強普及方法支原體培養(yǎng),…廣泛使用方法當(dāng)前6頁，總共84頁。淋病實驗室診斷

概況-病原學(xué)(1)淋病是指由淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae,簡稱淋球菌)引起的各種化膿性感染，是一種經(jīng)典的常見的性傳播疾病.淋球菌為革蘭陰性雙球菌，大小約0.6～0.8μm。通常成對生長，兩菌接觸面平坦。當(dāng)前7頁，總共84頁。概況-病原學(xué)(2)淋球菌與奈瑟屬的另一種致病菌腦膜炎球菌及其他共棲奈瑟菌在生物學(xué)上有許多相似性，可通過生化特性加以鑒別。發(fā)性感染部位主要為男性尿道或女性宮頸管內(nèi)膜。當(dāng)前8頁，總共84頁。概況-流行病學(xué)淋病的傳播途徑有以下二種：1、直接性接觸感染：成人淋病幾乎全部

通過性接觸感染。2、間接接觸感染：兒童可通過污染了淋

球菌的物品間接感染。新生兒可通過

母親產(chǎn)道分泌物間接感染。當(dāng)前9頁，總共84頁。淋病的實驗室診斷方法直接顯微鏡檢查淋球菌；分離培養(yǎng)淋球菌；非培養(yǎng)技術(shù)檢測淋球菌細胞成份如抗原或DNA（EIA,PCR）

當(dāng)前10頁，總共84頁。標(biāo)本的采集

取材部位依據(jù)

年齡性別性接觸方式臨床表現(xiàn)取材拭子種類

藻酸鈣拭子普通棉拭子滌綸拭子當(dāng)前11頁，總共84頁。標(biāo)本的采集-取材部位(1)男性異性戀者:采集尿道標(biāo)本，有口淫史者加取咽部標(biāo)本；同性戀者:采集尿道、直腸及咽部標(biāo)本.女性

采集宮頸標(biāo)本，必要時從尿道、直腸、咽部、前庭大腺和尿道旁腺取材.

當(dāng)前12頁，總共84頁。標(biāo)本的采集-取材部位(2)幼女幼女和/或處女膜未破的感染者標(biāo)本：采集陰道分泌物新生兒眼炎患者

采集眼結(jié)膜分泌物當(dāng)前13頁，總共84頁。標(biāo)本的采集-取材方法(1)尿道男性患者

用手指從陰莖根部向尿道口方向擠壓，有癥狀患者可擠出膿液，用取樣拭子蘸取膿液作涂片或培養(yǎng)。對擠壓后無明顯分泌物時，采用男用取材拭子插入尿道2～3cm，稍用力轉(zhuǎn)動，保留數(shù)秒鐘再取出，以采集到粘膜上皮細胞。當(dāng)前14頁，總共84頁。標(biāo)本的采集-取材方法(2)尿道女性患者

可抵著恥骨聯(lián)合輕輕按摩尿道口，擠壓出分泌物。如果無明顯分泌物，可用同男性相似的上述方法取材。當(dāng)前15頁，總共84頁。標(biāo)本的采集-取材方法(3)宮頸

避免使用防腐劑和潤滑劑，因為這些物質(zhì)對淋球菌有抑制作用。仔細檢查陰道壁和宮頸，如果宮頸口外面的分泌物較多，先用無菌棉拭清除過多的宮頸粘液。將一取樣拭子插入宮頸管內(nèi)1～2cm，稍用力轉(zhuǎn)動，保留10～30秒后取出。眼部

用男性采樣拭子在眼結(jié)膜處蘸取分泌物或輕繞眼結(jié)膜。當(dāng)前16頁，總共84頁。標(biāo)本的采集-取材方法(4)直腸

將取樣拭子插入肛門2～3cm，從緊靠肛環(huán)邊的隱窩中取材。避免接觸糞便。陰道

青春期前女孩可采集陰道標(biāo)本。將取樣拭子置于陰道后穹窿10～15秒，采集陰道分泌物。咽部

從咽后壁或扁桃體隱窩取材

當(dāng)前17頁，總共84頁。標(biāo)本的運送淋球菌的抵抗力弱，對熱敏感，不耐干燥。取材后標(biāo)本若不能立即接種于選擇性培養(yǎng)基上時，需采用運送系統(tǒng)。置于非營養(yǎng)型運送培養(yǎng)基中的標(biāo)本應(yīng)在12小時內(nèi)送到實驗室，接種于選擇性培養(yǎng)基，分離陽性率可達90%以上。超過24小時則分離陽性率下降。當(dāng)前18頁，總共84頁。直接顯微鏡檢查染色方法:

革蘭染液美蘭染液姬姆薩染液熒光抗體

革蘭染色為一傳統(tǒng)方法，因簡便、快捷及價廉、仍然為最廣泛采用的方法。革蘭染色將菌分為二大類，即染成紫色的革蘭陽性菌及染成紅色的革蘭陰性菌。當(dāng)前19頁，總共84頁。革蘭染色：細胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌當(dāng)前20頁，總共84頁。直接顯微鏡檢查的臨床意義男性淋菌性尿道炎的尿道標(biāo)本

敏感性及特異性可高達95%～99%，具診斷價值。宮頸標(biāo)本、無癥狀男性尿拭子及取自直腸的涂片時

敏感性僅40～70%。

不推薦直接顯微鏡檢查診斷直腸和咽部淋球菌感染。亦不能用于療后判愈。如果在多形核細胞外見到形態(tài)典型的革蘭陰性雙球菌，需做培養(yǎng)進行確證。當(dāng)前21頁，總共84頁。淋球菌鏡檢報告格式1、革蘭氏陰性雙球菌2、細胞內(nèi)外3、該細胞指的是什么細胞規(guī)范格式：細胞內(nèi)外見到革蘭氏陰性雙球菌或細胞內(nèi)外未見到革蘭氏陰性雙球菌當(dāng)前22頁，總共84頁。23美國中國美國和中國淋病病例性別分布比較當(dāng)前23頁，總共84頁。淋球菌培養(yǎng)培養(yǎng)法為診斷淋病的金標(biāo)準(zhǔn).對女性淋病的確診應(yīng)做淋球菌培養(yǎng)從選擇性培養(yǎng)基上分離出淋球菌即可診斷淋病。培養(yǎng)的敏感性81~100%。培養(yǎng)的優(yōu)點有：

—特異性極高（100%）；

—可發(fā)現(xiàn)無癥狀淋球菌感染患者；

—可確診兒童性虐待；

—可用于進一步作藥敏試驗；

—可用于治療后的判愈試驗。當(dāng)前24頁，總共84頁。淋球菌培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基

評價培養(yǎng)基質(zhì)量的一個重要指標(biāo):

男性淋菌性尿道炎標(biāo)本的革蘭染色與培養(yǎng)的符合率應(yīng)達95%～100%。如果革蘭染色陽性/培養(yǎng)陰性的比率較高則表明選擇性培養(yǎng)基的質(zhì)量欠佳當(dāng)前25頁，總共84頁。淋球菌培養(yǎng)接種標(biāo)本

取材后標(biāo)本應(yīng)盡可能及早接種。培養(yǎng)基應(yīng)先置于室溫或孵箱中預(yù)溫。將取材的拭子轉(zhuǎn)動涂布于平皿的上1/4范圍，然后用接種環(huán)分區(qū)劃線，以保證獲得較純的單個菌落。當(dāng)前26頁，總共84頁。接種標(biāo)本-四區(qū)劃分接種當(dāng)前27頁，總共84頁。接種標(biāo)本-四區(qū)劃分接種當(dāng)前28頁，總共84頁。淋球菌培養(yǎng)培養(yǎng)條件：35～36℃，含5%～10%CO2，濕潤（70%濕度）的環(huán)境。

CO2環(huán)境可由CO2培養(yǎng)箱、CO2產(chǎn)氣袋及燭缸提供。使用燭缸時，應(yīng)使用白色、無芳香味的無毒性蠟燭。在燭缸底部放些浸水棉球以保持一定的濕度。培養(yǎng)時間：24～48小時當(dāng)前29頁，總共84頁。淋球菌培養(yǎng)-觀察結(jié)果當(dāng)前30頁，總共84頁。淋球菌培養(yǎng)-淋球菌的初步鑒定初步鑒定淋球菌的主要依據(jù)

菌落特征 氧化酶試驗革蘭染色當(dāng)前31頁，總共84頁。淋球菌培養(yǎng)-淋球菌的確證試驗來自泌尿生殖道符合初步鑒定標(biāo)準(zhǔn)的分離株，一般可診斷為淋球菌，準(zhǔn)確性達98%。對于菌落形態(tài)不典型的分離株，來自咽部、眼睛、或其他泌尿生殖道外部位的分離株，來自低危人群（如兒童）的分離株，以及涉及醫(yī)療法律案例的分離株，應(yīng)作確證試驗。當(dāng)前32頁，總共84頁。淋球菌培養(yǎng)-淋球菌的確證試驗糖發(fā)酵試驗免疫學(xué)試驗

-熒光抗體染色

-協(xié)同凝集試驗

酶底物試驗DNA探針試驗

當(dāng)前33頁，總共84頁。糖發(fā)酵試驗糖發(fā)酵試驗檢測奈瑟球菌分解特定糖類(葡萄糖、麥芽糖、乳糖及蔗糖)產(chǎn)酸的能力。根據(jù)淋球菌僅分解葡萄糖，腦膜炎球菌分解葡萄糖和麥芽糖，乳屑奈瑟球菌分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖或不分解這些糖類，可將淋球菌與可能在淋球菌選擇性培養(yǎng)基上分離出的其他奈瑟球菌加以鑒別。當(dāng)前34頁，總共84頁。糖發(fā)酵試驗-奈瑟球菌屬的糖發(fā)酵特征細菌葡萄糖麥芽糖乳糖蔗糖淋球菌+---腦膜炎球菌++--乳酰胺奈瑟菌+++-灰色奈瑟球菌----布蘭漢卡他球菌----當(dāng)前35頁，總共84頁。淋球菌的鑒定特征菌落形態(tài)淋球菌樣革蘭染色革蘭陰性雙球菌氧化酶試驗陽性過氧化物酶試驗陽性快速糖發(fā)酵試驗G+L-M-S-當(dāng)前36頁，總共84頁。非培養(yǎng)診斷技術(shù)-核酸檢測

核酸檢測的特點

不依賴于活的病原體的存在，無需特殊運送條件；僅適合尿道或?qū)m頸標(biāo)本，以及尿液；不能進行抗生素敏感性試驗用于判愈試驗需在治療后至少3周以上進行.當(dāng)前37頁，總共84頁。淋球菌耐藥檢測當(dāng)前38頁，總共84頁。淋球菌耐藥檢測方法瓊脂紙片擴散法Etest瓊脂稀釋法分子生物學(xué)方法(耐藥基因檢測)當(dāng)前39頁，總共84頁。瓊脂紙片擴散法當(dāng)前40頁，總共84頁。瓊脂稀釋法

將待檢菌接種到含有不同濃度抗菌藥物的瓊脂平皿上，抗菌藥物濃度小時細菌生長，濃度大時細菌生長被抑制，據(jù)此可測出該菌株最低抑菌制濃度（MIC),判斷對抗菌藥物的敏感性。此法主要用于耐藥監(jiān)測.

MIC是指抗菌藥物能夠抑制細菌生長的最小抑菌藥物濃度，表示單位為g/ml當(dāng)前41頁，總共84頁。Etest當(dāng)前42頁，總共84頁。淋球菌耐藥監(jiān)測-內(nèi)容與方法監(jiān)測藥物青霉素頭孢克肟四環(huán)素阿奇霉素大觀霉素頭孢曲松環(huán)丙沙星當(dāng)前43頁，總共84頁。NGcasesin2006>3,000GRSPsitesin1987-2003GRSPsitesin2004-2006GRSPsitesin2007-1987：５個省1992-2006１5個省2007-2009２５個省2010-201210個?。?2點）中國淋球菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)當(dāng)前44頁，總共84頁。2006-2012年間廣西南寧地區(qū)淋球菌對頭孢曲松、大觀霉素、環(huán)丙沙星、TRNG和PPNG的變化趨勢

當(dāng)前45頁，總共84頁。2014年南寧地區(qū)淋球菌對抗生素敏感性當(dāng)前46頁，總共84頁。淋球菌耐藥監(jiān)測項目1、開展時間1987年至2015年，連續(xù)監(jiān)測28年2、課題：衛(wèi)生廳課題（2014年）一項

科技廳課題（2007年）一項3、文章：總共發(fā)表文章近15篇（皮研所）

其中大部分為國家級核心期刊論文，一篇SCI文章，中華醫(yī)學(xué)會系列雜志4篇。當(dāng)前47頁，總共84頁。性病門診檢查發(fā)現(xiàn)存在的問題—淋病1、淋病缺少治療藥（大觀、菌必治等）2、未開展淋球菌培養(yǎng)項目3、女性淋病僅涂片顯微鏡檢查就診斷和報病4、淋球菌培養(yǎng)未按要求使用淋球菌培養(yǎng)基當(dāng)前48頁，總共84頁。沙眼衣原體的病原學(xué)沙眼衣原體的分類與致病性沙眼衣原體泌尿生殖道和嬰幼兒感染的實驗室診斷沙眼衣原體感染的實驗室診斷當(dāng)前49頁，總共84頁。一、沙眼衣原體病原學(xué)嚴(yán)格細胞內(nèi)寄生

生活特性：原體和始體

正常生活周期持續(xù)性感染當(dāng)前50頁，總共84頁。分類：沙眼、性病淋巴肉芽腫和鼠生物變種Serovar:A,B,Ba,C,D,E,F,G,H,I,K,L1,L2,L3B群:B、Ba、D、

E、L1和L2C群:A、C、H、

I、J、K和L3中間群：G和F二、沙眼衣原體分類與致病性當(dāng)前51頁，總共84頁。三、沙眼衣原體泌尿生殖道感染的實驗室診斷檢測方法：直接涂片法免疫學(xué)方法：ELISA，IFA，膠體金法細胞培養(yǎng)法分子生物學(xué)方法當(dāng)前52頁，總共84頁。標(biāo)本的采集：泌尿生殖道感染：

男性：尿道拭子、尿沉渣和EPS等。女性：宮頸拭子/陰道拭子等。當(dāng)前53頁，總共84頁。直接涂片法（姬姆薩染色）：方法：涂片－姬姆薩染色－鏡檢包涵體。

當(dāng)前54頁，總共84頁。沙眼衣原體包涵體姬姆薩染色臨床應(yīng)用：眼部感染：敏感性95％，男性尿道：敏感性15％，宮頸感染：敏感性41％。應(yīng)用范圍：眼部標(biāo)本。當(dāng)前55頁，總共84頁。沙眼衣原體免疫熒光法檢測臨床應(yīng)用敏感性：74－90％高特異性:98－99％高缺點：主觀性，熒光顯微鏡臨床應(yīng)用：快速檢測非培養(yǎng)法陽性標(biāo)本的確證當(dāng)前56頁，總共84頁。ELISA法原理：Ab－Ag－Ab-酶－底物－顯色方法：加入標(biāo)本（孵育后洗板）酶標(biāo)抗體（孵育后洗板）底物（孵育）終止液－－機讀或肉眼讀。

當(dāng)前57頁，總共84頁。免疫膠體金快速法：原理：

方法：拭子＋I液－80C10分－冷5分－滴加5滴－15分讀結(jié)果結(jié)果：陽性：質(zhì)控窗＋，結(jié)果窗＋陰性：質(zhì)控窗＋，結(jié)果窗－失敗：質(zhì)控窗－，結(jié)果窗－當(dāng)前58頁，總共84頁。

免疫膠體金快速法檢測臨床應(yīng)用敏感性：33.3－49.7％低特異性:88.1－99.2％高缺點：需要確證，不宜質(zhì)控操作臨床應(yīng)用：臨床癥狀典型病例的檢測不適合非典型感染的篩查當(dāng)前59頁，總共84頁。細胞培養(yǎng)法：原理：衣原體在瘤細胞生長，染色檢測

方法：制備McCoy細胞接種標(biāo)本（2500轉(zhuǎn)，1h）去上清加新培養(yǎng)液（培養(yǎng)48－72）檢測（碘或姬姆薩染色，熒光法）

當(dāng)前60頁，總共84頁。當(dāng)前61頁，總共84頁。細胞培養(yǎng)法檢測臨床應(yīng)用敏感性：52－92％低特異性:99－100％高缺點：實驗室條件和實驗技術(shù)要求高，費時，敏感性低臨床應(yīng)用：“金標(biāo)準(zhǔn)”方法方法學(xué)評價沙眼衣原體感染的確證沙眼衣原體感染的科研當(dāng)前62頁，總共84頁。分子生物學(xué)檢測臨床應(yīng)用敏感性：75－97％高特異性:98－100％高缺點：實驗室條件和技術(shù)要求高，成本高，費時，假陽性，抑制物臨床應(yīng)用：臨床和健康體檢沙眼衣原體感染的篩查當(dāng)前63頁，總共84頁。

生殖器皰疹的實驗室診斷

當(dāng)前64頁，總共84頁。概述

生殖器皰疹是由單純皰疹病毒(HSV)感染泌尿生殖器及肛門部位皮膚粘膜而引起是一種復(fù)發(fā)性疾病,是一種常見的性傳播疾病。

HSV是雙鏈DNA病毒，屬人類皰疹病毒α亞科。人類是HSV的唯一自然宿主。HSV有兩種類型;單純皰疹病毒1型(SHV-1)和單純皰疹病毒2型(HSV-2)。多數(shù)生殖器皰疹是由HSV-2引起。HSV可呈慢性復(fù)法過程，尚無徹底治愈的方法。當(dāng)前65頁，總共84頁。概述生殖器皰疹的復(fù)發(fā)可給患者帶來很大的身體痛苦，影響其生活質(zhì)量，并可能引起播散性HSV感染、病毒性腦膜炎、脊髓脊神經(jīng)根病、盆腔炎綜合征等一系列并發(fā)癥。孕婦HSV感染影響生育，可引起子宮內(nèi)新生兒的感染那，導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)、新生兒死亡或發(fā)生嚴(yán)重疑癥。當(dāng)前66頁，總共84頁。概述傳染源：生殖器HSV感染者、亞臨床感染或無癥狀派讀者、未識別癥狀或不典型生殖器皰疹患者是生殖器皰疹的主要傳播源傳播途徑有水平傳播和垂直傳播。水平傳播主要是性接觸傳播，垂直傳播是指母-嬰及母-胎兒間傳播，包括子宮內(nèi)感染和經(jīng)產(chǎn)道感染。當(dāng)前67頁，總共84頁。標(biāo)本采集

復(fù)發(fā)性生殖器皰疹病程1~2周,病毒排放持續(xù)平均時間4天;原發(fā)性病程2~3周,病毒排放持續(xù)時間12天。1、皰液取材；2、潰瘍?nèi)〔模?、宮頸取材；4、其他標(biāo)本如尿道拭子，丘疹等。當(dāng)前68頁，總共84頁。標(biāo)本采集標(biāo)本運送：如不能立即檢測，應(yīng)將標(biāo)本洗入病毒運送液，置冰箱保持。如當(dāng)天檢測可置4℃保存，如不能當(dāng)天檢測，應(yīng)置-70℃保存當(dāng)前69頁，總共84頁。實驗方法1．分離培養(yǎng)法2.細胞學(xué)檢查3．直接免疫熒光法4．單純皰疹抗原酶聯(lián)免疫試驗5．HSV-DNA或基因檢測法6．血清學(xué)檢測當(dāng)前70頁，總共84頁。病毒分離培養(yǎng)原理：培養(yǎng)法分離培養(yǎng)HSV，每天觀察病毒對敏感細胞的細胞病變（CPE），初步確定病毒的存在。方法：單層細胞的準(zhǔn)備；標(biāo)本接種；細胞病變的觀察；病毒傳代；鑒定與分型。當(dāng)前71頁，總共84頁。病毒培養(yǎng)結(jié)果：培養(yǎng)超過4天后可以觀察CPE，可初步確定HSV培養(yǎng)為陽性，如要確認(rèn)需經(jīng)過免疫學(xué)方法進一步鑒定證實。注意事項：1、細胞的敏感性（選敏感性好及活力強幼齡細胞）；2、標(biāo)本取材時不應(yīng)使用消毒劑和潤滑劑及藻酸鈣拭子；3、標(biāo)本中病毒含量；4、保存；5、注意無菌操作，避免細菌和真菌污染當(dāng)前72頁，總共84頁。病毒培養(yǎng)臨床意義：培養(yǎng)法是H