微生物工程(發(fā)酵)第三章培養(yǎng)基制備與滅菌

思考題：培養(yǎng)基有哪些化學(xué)成分組成？這些成分的來(lái)源有哪些（尤其是C、N源）？各成分的作用是什么？前體物質(zhì)、抑制劑、促進(jìn)劑的概念發(fā)酵工業(yè)原料的選擇原則有哪些發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的基本原則有哪些發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)和優(yōu)化步驟常用的滅菌方法有哪些？發(fā)酵工程培養(yǎng)基滅菌的主要滅菌方法及其各自的優(yōu)缺點(diǎn)；當(dāng)前1頁(yè)，總共55頁(yè)。按純度合成培養(yǎng)基

:原料其化學(xué)成分明確、穩(wěn)定

適合于研究菌種基本代謝和過(guò)程的物質(zhì)變化規(guī)律

培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)單一，價(jià)格較高，不適合用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)

天然培養(yǎng)基:采用天然原料

原料來(lái)源豐富(大多為農(nóng)副產(chǎn)品)、價(jià)格低廉、適于工業(yè)化生產(chǎn)

原料質(zhì)量等方面不加控制會(huì)影響生產(chǎn)穩(wěn)定性

培養(yǎng)基概述當(dāng)前2頁(yè)，總共55頁(yè)。固體培養(yǎng)基

:適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應(yīng)用于有子實(shí)體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產(chǎn)

半固體培養(yǎng)基:即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%～0.8%,主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營(yíng)養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。當(dāng)前3頁(yè)，總共55頁(yè)。根據(jù)生產(chǎn)流程和作用來(lái)區(qū)分斜面培養(yǎng)基或孢子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基當(dāng)前4頁(yè)，總共55頁(yè)。3.1發(fā)酵培養(yǎng)基組成及來(lái)源五大元素：水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子當(dāng)前5頁(yè)，總共55頁(yè)。3.1.1五大營(yíng)養(yǎng)要素及其主要來(lái)源3.1.1.1水分：占細(xì)胞重量的80-90%；

對(duì)于發(fā)酵工廠來(lái)說(shuō)，恒定的水源是至關(guān)重要的，因?yàn)樵诓煌粗写嬖诘母鞣N因素對(duì)微生物發(fā)酵代謝影響甚大

水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。當(dāng)前6頁(yè)，總共55頁(yè)。3.1.1.2碳源可以作為微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳素來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；當(dāng)前7頁(yè)，總共55頁(yè)。a.純糖原料葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖等當(dāng)前8頁(yè)，總共55頁(yè)。b.淀粉質(zhì)原料直鏈淀粉（聚合度100-6000）支鏈淀粉（1000-3000000）當(dāng)前9頁(yè)，總共55頁(yè)。薯類原料：紅薯、木薯；谷物原料：玉米野生植物原料：橡果、葛根、蕨根輔助原料：麩皮、米糠當(dāng)前10頁(yè)，總共55頁(yè)。②淀粉、糊精使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點(diǎn)：難利用、發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時(shí)加入一定的α-淀粉酶，成分比較復(fù)雜等等。優(yōu)點(diǎn)：來(lái)源廣泛、價(jià)格底可以解除葡萄糖效應(yīng)當(dāng)前11頁(yè)，總共55頁(yè)。c.糖蜜原料：制糖工業(yè)中的副產(chǎn)物；甘蔗、甜菜當(dāng)前12頁(yè)，總共55頁(yè)。糖蜜使用的注意點(diǎn)：除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，許多都會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進(jìn)行預(yù)處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物資：膠體成分（起泡、結(jié)晶）、鈣鹽（結(jié)晶）生物素（發(fā)酵控制）例：檸檬酸發(fā)酵有害物質(zhì)：鐵離子含量高（導(dǎo)致異檸檬酸的生成）當(dāng)前13頁(yè)，總共55頁(yè)。d.纖維質(zhì)原料：農(nóng)作物秸稈；纖維素、半纖維素、木質(zhì)素當(dāng)前14頁(yè)，總共55頁(yè)。3.1.1.3氮源被微生物利用以構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中的氮素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；當(dāng)前15頁(yè)，總共55頁(yè)。a.無(wú)機(jī)氮源氨水、硝酸鹽、銨鹽特點(diǎn)：吸收快，速效氮源。但無(wú)機(jī)氮源的迅速利用常會(huì)引起pH的變化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH滿足菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中的pH當(dāng)前16頁(yè)，總共55頁(yè)。b.有機(jī)氮源玉米漿、豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、魚(yú)粉、酵母浸出液成分復(fù)雜：除提供氮源外，有些有機(jī)氮源還提供大量的無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子。例玉米漿：①可溶性蛋白、生長(zhǎng)因子（生物素）、苯乙酸②較多的乳酸③硫、磷、微量元素等當(dāng)前17頁(yè)，總共55頁(yè)。

有機(jī)氮源成分復(fù)雜可以從多個(gè)方面對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行影響，而另一方面有機(jī)氮源的來(lái)源具有不穩(wěn)定性。所以在有機(jī)氮源選取時(shí)和使用過(guò)程中，必須考慮原料的波動(dòng)對(duì)發(fā)酵的影響當(dāng)前18頁(yè)，總共55頁(yè)。3.1.1.4無(wú)機(jī)鹽酶活中心的組成部分維持生物大分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)并維持細(xì)胞的滲透壓平衡控制細(xì)胞的氧化還原電位作為某些微生物生長(zhǎng)的能源物質(zhì)當(dāng)前19頁(yè)，總共55頁(yè)。3.1.1.5生長(zhǎng)因子凡是微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量的有機(jī)物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長(zhǎng)因子。有機(jī)氮源是生長(zhǎng)因子的重要來(lái)源；當(dāng)前20頁(yè)，總共55頁(yè)。3.1.1.6前體物質(zhì)、抑制劑和促進(jìn)劑

前體物質(zhì)指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接彼微生物在生物合成過(guò)程中合成到產(chǎn)物物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136當(dāng)前21頁(yè)，總共55頁(yè)。前體一般都有毒性，濃度過(guò)大對(duì)菌體的生長(zhǎng)不利苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%

前體相對(duì)價(jià)格較高，添加過(guò)多，容易引起揮發(fā)和氧化當(dāng)前22頁(yè)，總共55頁(yè)。3、產(chǎn)物促進(jìn)劑產(chǎn)物促進(jìn)劑是指那些非細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑當(dāng)前23頁(yè)，總共55頁(yè)。

促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的機(jī)制還不完全清楚，其原因是多方面的。有些促進(jìn)劑本身是酶的誘導(dǎo)物；有些促進(jìn)劑是表面活性劑，可改善細(xì)胞的透性，改善細(xì)胞與氧的接觸從而促進(jìn)酶的分泌與生產(chǎn)，也有人認(rèn)為表面活性劑對(duì)酶的表面失活有保護(hù)作用；有些促進(jìn)劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。當(dāng)前24頁(yè)，總共55頁(yè)。抑制劑：能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白質(zhì)變性的物質(zhì)；

可用透析或超濾的方式去除；

在培養(yǎng)基中添加抑制劑會(huì)抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時(shí)會(huì)使另一代謝途徑活躍，從而獲得人們所需要的某一終產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間產(chǎn)物積累起來(lái);

當(dāng)前25頁(yè)，總共55頁(yè)。3.1.2發(fā)酵工業(yè)原料的選擇原則因地制宜，就地取材；營(yíng)養(yǎng)豐富，濃度恰當(dāng)；資源豐富，容易收集；易于儲(chǔ)藏；理化性質(zhì)穩(wěn)定，成分間無(wú)反應(yīng)；不影響通氣、攪拌、產(chǎn)物分離，廢物處理方便不含毒副作用的物質(zhì)價(jià)格低廉當(dāng)前26頁(yè)，總共55頁(yè)。3.1.4原料的預(yù)處理和加工淀粉質(zhì)原料的預(yù)處理和加工預(yù)處理：原料除雜、粉碎；加工：液化淀粉→糊精、低聚糖

糖化產(chǎn)生葡萄糖當(dāng)前27頁(yè)，總共55頁(yè)。加工：糊化、液化淀粉→糊精、低聚糖

糖化產(chǎn)生葡萄糖淀粉顆粒受熱并吸水膨脹，體積迅速增大，固態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，形成粘稠的液體，稱為糊化；糊化的淀粉在酶的作用下，分子鏈被切斷，相對(duì)分子量變小，粘度迅速降低的過(guò)程稱為液化；經(jīng)液化后的料液中加入一定量的糖化酶（葡萄糖淀粉酶），使糊精或低聚糖水解為葡萄糖，稱之為糖化。當(dāng)前28頁(yè)，總共55頁(yè)。當(dāng)前29頁(yè)，總共55頁(yè)。糖蜜原料的預(yù)處理去除雜質(zhì)、膠體、灰分（鈣質(zhì)）及產(chǎn)酸細(xì)菌；方法：加酸酸化；

加熱滅菌；

靜止沉淀；

脫鈣；當(dāng)前30頁(yè)，總共55頁(yè)。纖維素原料的預(yù)處理及加工：預(yù)處理：用化學(xué)、物理、生物學(xué)的方法，去除半纖維素和木質(zhì)素，破壞纖維素的結(jié)構(gòu)；加工：酸水解酶水解當(dāng)前31頁(yè)，總共55頁(yè)。3.2發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和優(yōu)化目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來(lái)推斷和計(jì)算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗(yàn)配方，再結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基當(dāng)前32頁(yè)，總共55頁(yè)。發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的基本原則根據(jù)生產(chǎn)菌株的營(yíng)養(yǎng)特征配置培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)成分的配比適當(dāng)；滲透壓適宜pH值適當(dāng)各成分的加入次序及步驟適當(dāng)；當(dāng)前33頁(yè)，總共55頁(yè)。3.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)和優(yōu)化步驟③各成分最適的濃度（正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)）①根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)和培養(yǎng)基成分初步確定可能的培養(yǎng)基成分；②通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；當(dāng)前34頁(yè)，總共55頁(yè)。類胡蘿卜素高產(chǎn)菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營(yíng)養(yǎng)保健當(dāng)前35頁(yè)，總共55頁(yè)。原培養(yǎng)基:當(dāng)前36頁(yè)，總共55頁(yè)。

初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)當(dāng)前37頁(yè)，總共55頁(yè)。

通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進(jìn)一步：乙酸鈉的濃度2%比較好當(dāng)前38頁(yè)，總共55頁(yè)。結(jié)果：碳源：乙酸鈉0.2%氮源：氯化銨0.2%

酵母膏0.03%無(wú)機(jī)鹽:復(fù)合無(wú)機(jī)鹽0.05%當(dāng)前39頁(yè)，總共55頁(yè)。

正交設(shè)計(jì)確定優(yōu)化的配方當(dāng)前40頁(yè)，總共55頁(yè)。當(dāng)前41頁(yè)，總共55頁(yè)。改進(jìn)后培養(yǎng)基的發(fā)酵結(jié)果當(dāng)前42頁(yè)，總共55頁(yè)。例：青霉素發(fā)酵發(fā)酵搖瓶：玉米漿4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%

輕質(zhì)碳酸鈣1%發(fā)酵罐:葡萄糖流加控制總量10-15%，玉米漿總量4-8%

補(bǔ)加硫酸、前體等搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)差別很大當(dāng)前43頁(yè)，總共55頁(yè)。搖瓶?jī)?yōu)化配方：菌種篩選，反應(yīng)器研究的基礎(chǔ)當(dāng)前44頁(yè)，總共55頁(yè)。3.3培養(yǎng)基及設(shè)備的滅菌常見(jiàn)滅菌方法：加熱滅菌過(guò)濾滅菌輻射滅菌化學(xué)滅菌熏蒸滅菌當(dāng)前45頁(yè)，總共55頁(yè)。1）干熱滅菌烘箱內(nèi)熱空氣滅菌火焰灼燒干熱滅菌160℃，2小時(shí)1、高溫滅菌當(dāng)前46頁(yè)，總共55頁(yè)。2）濕熱滅菌1）巴斯德消毒2）煮沸消毒3）丁達(dá)爾滅菌4）常規(guī)高壓滅菌121℃，15分鐘；115℃，30分鐘；135-150℃，5-15秒，工業(yè)上發(fā)酵培養(yǎng)基135-150℃，2-6秒，牛奶或其它液態(tài)食品當(dāng)前47頁(yè)，總共55頁(yè)。過(guò)濾除菌對(duì)不耐熱液體培養(yǎng)基和空氣滅菌進(jìn)行過(guò)濾除菌；硝酸纖維素膜和醋酸纖維素膜（0.220.45μm）核孔濾器（聚碳酸膠片）當(dāng)前48頁(yè)，總共55頁(yè)。

紫外滅菌紫外線：誘導(dǎo)核酸形成胸腺嘧啶二聚體，從而干擾了核酸的復(fù)制；X射線和γ射線能使其它物質(zhì)氧化或產(chǎn)生自由基破壞和改變生物大分子的結(jié)構(gòu)，以抑制或殺死微生物。當(dāng)前49頁(yè)，總共55頁(yè)?；瘜W(xué)藥品滅菌：殺菌劑、消毒劑、防腐劑；高錳酸