普通微生物第十章微生物與基因工程演示文稿

普通微生物第十章微生物與基因工程演示文稿當前1頁，總共81頁。（優(yōu)選）普通微生物第十章微生物與基因工程當前2頁，總共81頁。

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載體（Vector）：能容忍外源DNA片段插入，可在細胞間轉(zhuǎn)移并在宿主細胞內(nèi)自主復(fù)制的DNA分子。當前3頁，總共81頁。

不同來源的DNA片段共價連接、通過重新組合構(gòu)成了具有兩個DNA分子遺傳信息的新重組體DNA分子的過程。DNA重組（recombination)：當前4頁，總共81頁。轉(zhuǎn)化(transformation)：

以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的載體DNA，在一定條件下引入受體細胞的過程?；蛑窪NA分子進入宿主細胞的過程。當前5頁，總共81頁。

基因工程核心是構(gòu)建重組體DNA的技術(shù)，因此，基因工程和重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechnology)有時為同義詞

基因工程的出現(xiàn)使得生物科學迅猛發(fā)展，并帶動了生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的興起！當前6頁，總共81頁?；蚬こ痰奶攸c可設(shè)計性穩(wěn)定性遠緣性風險性當前7頁，總共81頁。一、基因工程發(fā)展歷史基因工程三大理論基礎(chǔ)基因工程三大技術(shù)發(fā)現(xiàn)§1 基因工程概述當前8頁，總共81頁。20世紀40年代：證明了遺傳物質(zhì)是DNA20世紀50年代：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)20世紀60年代：確定了遺傳信息的傳遞方式

基因工程理論基礎(chǔ)

當前9頁，總共81頁。

(A)注射有莢膜（S型）的致病性肺炎雙球菌，小鼠死亡

(B)注射突變的（R型）非致病性肺炎雙球菌，小鼠存活。

(C)注射加熱殺死的S型，小鼠存活。

(D)注射活的R型與加熱殺死的S型的混合物，小鼠死亡。

圖1-1肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗當前10頁，總共81頁。

基因工程學重大的技術(shù)發(fā)現(xiàn)基因工程酶技術(shù)

1970年限制性核酸內(nèi)切酶的分離和純化（HindIII）分子克隆

1972年Berg首次實現(xiàn)基因重組

1973年Cohen重組DNA轉(zhuǎn)化DNA測序

1975年Sanger實驗室建立酶法DNA測序技術(shù)

1977年Gilbert實驗室又建立化學法DNA測序技術(shù)

1980年諾貝爾化學獎授予Berg、Sanger、Gilbert

DNA的分子克隆+DNA測序

—使重組DNA技術(shù)系統(tǒng)得以產(chǎn)生當前11頁，總共81頁。相關(guān)理論的復(fù)習基因的概念和特性DNA的結(jié)構(gòu)與性能DNA的復(fù)制與表達基因組當前12頁，總共81頁。

一基因的概念遺傳學概念：

基因:

是DNA分子中攜帶特定遺傳信息的最小功能單位，控制遺傳性狀分子生物學定義：編碼功能性蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列，負載特定的遺傳信息并在一定條件下調(diào)節(jié)、表達遺傳信息，指令蛋白質(zhì)合成。

當前13頁，總共81頁?；虻墓δ芊诸惤Y(jié)構(gòu)基因（structuregene)：決定蛋白質(zhì)/多肽鏈或酶分子結(jié)構(gòu)的基因調(diào)控基因(regulatorygene)：調(diào)節(jié)控制結(jié)構(gòu)基因表達功能當前14頁，總共81頁。基因的一般特性半保留自我復(fù)制決定生物表型或性狀基因突變新的生物性狀當前15頁，總共81頁。DNA的結(jié)構(gòu).兩條脫氧核苷酸鏈成反向平行排列，.一條呈5‘3’方向.另一條呈3‘5’方向。.以堿基配對形成氫鍵而形成雙螺旋結(jié)構(gòu).遵循互補配對原則即：

A＝TG≡C基本單位：核苷酸（堿基、五碳糖、磷酸）雙螺旋結(jié)構(gòu)(A)腺嘌呤(G)鳥嘌呤(C)胞嘧啶(U)尿嘧啶(T)胸腺嘧啶當前16頁，總共81頁。當前17頁，總共81頁。DNA的三種構(gòu)型：

-超螺旋：共價閉環(huán)（CCC）

-開環(huán)：單鏈缺口（OC）

-線型：雙鏈斷裂（L）LC

cccoc當前18頁，總共81頁。DNA的性能吸收光譜高峰為260nm

溴化乙啶（EB）嵌入DNA雙鏈配對堿基之間，紫外線照射，可顯示DNA位置在電場中的遷移率與分子量大小、構(gòu)象有關(guān)DNA變性：在物理或化學因素作用下，氫鍵斷裂成單鏈的過程DNA復(fù)性：變性因素去除后在適當條件下恢復(fù)成雙鏈的過程。當前19頁，總共81頁。DNA變性(DNADenature)

指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，但不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，均可引起核酸分子變性。解鏈溫度:TmTm=69.3＋0.41(%G+C)當前20頁，總共81頁。DNA復(fù)性

(DNARenature)是DNA變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性后的DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱之為退火(annealing)。最佳復(fù)性條件一般認為是比Tm低25℃左右的溫度復(fù)性時溫度下降必須緩慢，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下)，復(fù)性幾乎是不可能的，核酸實驗中經(jīng)常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態(tài)。當前21頁，總共81頁。DNA的復(fù)制與表達半保留復(fù)制（semi-conservativereplication）基因表達（geneexpression）mRNA蛋白

轉(zhuǎn)錄翻譯當前22頁，總共81頁。基因組（genome)概念：細胞或生物體的全套遺傳物質(zhì)常見基因組特點：病毒基因組原核生物基因組真核生物基因組當前23頁，總共81頁。1.病毒基因組基因組小，基因數(shù)少帶有重疊基因大部分為編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因當前24頁，總共81頁。HBV基因組當前25頁，總共81頁。2原核生物基因與表達特點

——細菌基因表達

1）基因組較小2）基因是連續(xù)的3）沒有轉(zhuǎn)錄后加工過程和翻譯后加工過程。4）轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)，可同時進行。當前26頁，總共81頁。

2.原核生物基因組細菌染色質(zhì)質(zhì)粒（plasmid）：

細菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，是環(huán)狀閉合的雙鏈DNA?？勺灾鲝?fù)制編碼生物學形狀基因工程常用載體當前27頁，總共81頁。

當前28頁，總共81頁。真核生物基因組基因組龐大3×106bp、染色質(zhì)、染色體.基因不連續(xù)性斷裂基因、內(nèi)含子、外顯子（大部分基因含有內(nèi)含子）含有大量重復(fù)序列非編碼區(qū)域多于編碼區(qū)域非編碼區(qū)較多多于編碼序列(9:1）轉(zhuǎn)錄和翻譯不偶聯(lián)當前29頁，總共81頁。二、基因工程的基本過程一、目的基因的制備(donorDNA)二、體外DNA重組(DNArecombination)三、重組DNA導(dǎo)入宿主細胞(Transformation)四、重組體的篩選鑒定(identification)五、控制外源基因的表達(geneexpression)當前30頁，總共81頁。基因工程過程示意圖①從細胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因/使其表達③③當前31頁，總共81頁。三、微生物學與基因工程的關(guān)系1.提供豐富而獨特的基因資源2.工具酶3.克隆載體4.基因克隆的宿主5.基因表達的反應(yīng)器6.有關(guān)基因結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和表達調(diào)控的理論主要來自對微生物的研究一切基因工程操作都離不開微生物—操作技術(shù)和理論指導(dǎo)當前32頁，總共81頁。一、從基因文庫或cDNA文庫分離目的基因二、酶法或化學方法人工合成基因三、PCR擴增基因四、基因的定位誘變§2 基因的分離、合成和定位誘變當前33頁，總共81頁?；蛭膸旎蚪MDNA片段的全部克隆

一、從基因文庫或cDNA文庫分離目的基因建立基因文庫步驟：1、提取基因組DNA2、DNA片段化3、選擇合適載體4、DNA與載體連接5、重組體轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染當前34頁，總共81頁。當前35頁，總共81頁。cDNA文庫：生物體全部mRNA的cDNA的克隆總體mRNA的提取利用逆轉(zhuǎn)錄酶以寡聚dT或隨機寡聚核苷酸為引物合成cDNA的第一條鏈利用DNA聚合酶Ⅰ，以cDNA的第一條鏈為模板，用適當引物合成cDNA的第二條鏈，常用RNA酶H在雜交分子的mRNA鏈上造成缺口和切口，產(chǎn)生一系列引物，或是除去雜交分子的mRNA后，加入隨機引物合成第二條鏈其它同基因文庫的構(gòu)建當前36頁，總共81頁。當前37頁，總共81頁。適于遺傳背景清楚的細菌染色體

酶切電泳分離DNA化學方法人工合成基因應(yīng)用：1、合成基因2、合成核酸探針

探針(probe)：用同位素或其它非放射物質(zhì)標記的一段特定的DNA或RNA片段3、合成DNA引物

二、酶法或化學方法人工合成基因當前38頁，總共81頁。聚合酶鏈式反應(yīng)

PolymeraseChainReaction,PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法高溫變性92～96℃低溫復(fù)性（退火）40～60℃中溫延伸70～72℃三、PCR擴增基因當前39頁，總共81頁。PCR基本原理當前40頁，總共81頁。當前41頁，總共81頁。所用DNA聚合酶：Klenow聚合酶1988年Saiki等從水生棲熱菌(Thermusaquaticus)分離到TaqDNA聚合酶火球菌(Pyrococcusfuriosus)分離到PfuDNA聚合酶;從Thermococcuslitoralis分離到VentDNA聚合酶從Thermusthermophilus中分離TthDNA聚合酶校正功能當前42頁，總共81頁。PCR注意事項：引物的設(shè)計2.退火溫度3.實驗操作當前43頁，總共81頁。PCR應(yīng)用1、基因擴增和制備DNA探針2、臨床醫(yī)學上傳染病的檢測等3、法醫(yī)上判定親緣關(guān)系4、定性、定量檢測基因表達水平當前44頁，總共81頁。qRT-PCR(quantitativereal-timePCR)當前45頁，總共81頁。四、基因的定位誘變

在基因精確限定的位點引入突變1、寡核苷酸指導(dǎo)的定位誘變2、盒式誘變3、PCR定位誘變當前46頁，總共81頁。1.寡核苷酸指導(dǎo)的定位誘變當前47頁，總共81頁。2.盒式誘變(cassettemutagenesis)

較大片段的誘變當前48頁，總共81頁。PCR定位誘變3.PCR誘變1）變異部位位于基因的末端引物5‘端限制位點的引入2）變異部位位于基因的中間

重組PCR(recombinantPCR)—Higuchi,1988年當前49頁，總共81頁?！? 微生物與克隆載體

克隆載體(cloningvector)：

以擴增外源DNA為目的的載體

到目前為止，基因工程中使用的載體基本上均來自微生物當前50頁，總共81頁。克隆載體的基本要求應(yīng)是一個獨立的復(fù)制子(replicon)具有多克隆位點具有選擇標記安全性當前51頁，總共81頁。載體的種類一、質(zhì)粒克隆載體二、λ噬菌體克隆載體三、柯斯質(zhì)粒載體(cosmidvector—黏粒載體)四、M13噬菌體載體五、噬菌質(zhì)粒載體(phagemid/phasmid)當前52頁，總共81頁。一、質(zhì)?？寺≥d體1.質(zhì)?？寺≥d體的特性：具有獨立的復(fù)制起點含有多種限制酶的單一識別位點具有較小的相對分子質(zhì)量1~200kbp外源DNA<15kbp具有較高拷貝數(shù)具有便于選擇的標記易于導(dǎo)入細胞具有安全性當前53頁，總共81頁。2.質(zhì)粒pBR322的結(jié)構(gòu)特點1977年Bolivar構(gòu)建環(huán)狀雙鏈DNA4,361bp外源DNA5kbp左右松弛型質(zhì)粒，一個復(fù)制起點兩個抗性基因Tetr

Ampr多克隆位點（multiplecloningsite;polylinker;24）插入失活(insertionalinactivation):

因外源DNA的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象當前54頁，總共81頁。當前55頁，總共81頁。3.其它質(zhì)粒載體pUCpGEM系列當前56頁，總共81頁。二、λ噬菌體克隆載體λ噬菌體克隆載體的優(yōu)點分子遺傳學背景十分清楚容量較大（23kbp）具有較高的感染率λ噬菌體克隆載體的構(gòu)建刪除基因組中非必需區(qū)除去多余的限制酶切位點當前57頁，總共81頁。λ噬菌體克隆載體的種類插入型載體(insertvector)取代型載體(replacementvector)78%~105%當前58頁，總共81頁。三、柯斯質(zhì)粒載體(cosmidvector—黏粒載體)由λ噬菌體的粘性末端(cos位點)和質(zhì)粒構(gòu)建而成黏粒的優(yōu)點具有噬菌體的高效感染率，以質(zhì)粒形式存在具有質(zhì)粒的復(fù)制方式具有克隆大片段外源DNA的能力(45kbp)當前59頁，總共81頁。四、M13噬菌體載體

E.coli絲狀噬菌體環(huán)狀ssDNA6,407bp感染雄性菌后變成復(fù)制型dsDNA,以滾環(huán)方式復(fù)制出ssDNA特點：

1.間隔區(qū)插入β-半乳糖苷酶N端一小段編碼序列，編碼β-半乳糖苷酶的α肽，可與E.coli

lacZ突變基因產(chǎn)物ΔM15進行α互補，產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶。在含有異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和顯色物5-

溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(X-gal)的平板上時出現(xiàn)藍色噬菌斑

2.在α肽的編碼區(qū)插入多克隆位點，外源基因插入這一區(qū)段，破壞

α互補作用，使β-半乳糖苷酶失活，重組體產(chǎn)生白色噬菌斑當前60頁，總共81頁。M13噬菌體載體克隆能力較小300~400bp特別適合用于制備單鏈DNA模板、單鏈DNA探針、定位誘變模板當前61頁，總共81頁。五、噬菌粒載體(phagemid/phasmid)

又稱噬粒，由噬菌體M13的基因間隔區(qū)和質(zhì)粒載體共同構(gòu)建的載體

pUC118將野生型M13的基因間隔區(qū)插入質(zhì)粒載體

pUC18構(gòu)建而成在宿主細胞內(nèi)以質(zhì)粒形式存在，產(chǎn)生雙鏈DNA；當輔助噬菌體M13感染宿主細胞后，以滾環(huán)方式復(fù)制，產(chǎn)生單鏈DNA特點：分子小容量大10kbp可制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達外源基因當前62頁，總共81頁。幾類大腸桿菌克隆載體比較載體類型 克隆容量 主要用途質(zhì)粒載體 <15kbp 克隆和表達外源基因，DNA測序λ噬菌體載體<23kbp 構(gòu)建基因文庫和cDNA文庫柯斯質(zhì)粒載體<45kbp 構(gòu)建基因文庫M13載體 300~400bp 制備單鏈DNA，定位誘變，噬菌體展示噬菌質(zhì)粒載體<10kbp 制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達外源 基因當前63頁，總共81頁。六、真核生物的克隆載體1.酵母質(zhì)粒載體

利用酵母的2μm質(zhì)粒和其他染色體組分與pBR322構(gòu)建而成，為穿梭質(zhì)粒附加體質(zhì)粒（episomalplasmid)復(fù)制質(zhì)粒(replicatingplasmid)整合質(zhì)粒(integratingplasmid)當前64頁，總共81頁。附加體質(zhì)粒（episomalplasmid)具有較高拷貝數(shù)當前65頁，總共81頁。酵母染色體的自主復(fù)制序列復(fù)制質(zhì)粒(replicatingplasmid)中等拷貝數(shù)當前66頁，總共81頁。整合質(zhì)粒(integratingplasmid)當前67頁，總共81頁。2.真核生物病毒載體哺乳動物病毒載體—SV40、腺病毒、牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒昆蟲病毒載體—桿狀病毒：高容量（100kbp)、高表達效率(25%)、安全植物病毒載體—花椰菜花葉病毒載體，Ti質(zhì)粒載體當前68頁，總共81頁。七、人工染色體

酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC) Murray1983年構(gòu)建，Burke等1987年用以構(gòu)建成YAC克隆庫，1000kbp容量細菌人工染色體(BAC)-120-300kb當前69頁，總共81頁。§4微生物與基因工程工具酶

基因工程所用到的工具酶大多數(shù)是從不同微生物中獲得的當前70頁，總共81頁。一、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性酶(restrictionenzyme)：能識別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識別位點或其附近特異切割DNA的一類內(nèi)切酶1.命名與分類EcoRⅠHpaⅠ,HpaⅡ(Haemophilusparainfluenzae，副流感嗜血桿菌)HphⅠ(Haemophilusparahaemolyticus，副溶血嗜血桿菌)Ⅰ、Ⅱ

、Ⅲ三種類型當前71頁，總共81頁。2.限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性

識別序列通常由4~8bp組成，具有二重旋轉(zhuǎn)對稱軸，序列呈回文結(jié)構(gòu)(paliindromicstructure)

切割片段理論大小為4nA.黏性末端(cohesiveend)HindⅢ5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’PstⅠ 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’當前72頁，總共81頁。B.平末端HpaⅠ 5’-GTTAAC-3’ 3’-CAATTG-5’同裂酶(isoschizomers)同尾酶(isocaudomers)Mun

ⅠEcoRⅠ5’-CAATTG-3’ 5’-GAATTC-3’3’-GTTAAC-5’ 3’-CTTAAG-5’表10-2

常用限制酶當前73頁，總共81頁。二、DNA連接酶(DNAligase)T4DNA連接酶：Mg2+和ATP能催化平端連接大腸桿菌DNA連接酶：Mg2+和NAD+其它酶當前74頁，總共81頁?！?外源基因?qū)胨拗骷毎?、外源基因與載體的體外連接

1.黏性末端連接法

2.接頭或銜接物連接法

3.