實(shí)驗(yàn)四 過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)四過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)(糖原染色)

[目的要求]1．掌握本實(shí)驗(yàn)的原理和臨床意義。2．熟悉本實(shí)驗(yàn)的操作方法及注意事項(xiàng)。[實(shí)驗(yàn)原理]糖原中的1，2-乙二醇基經(jīng)高碘酸氧化后產(chǎn)生醛基，此醛基進(jìn)而與雪夫(Schiff)液作用，使無(wú)色品紅變?yōu)榧t色的化合物，定位于胞漿中。[實(shí)驗(yàn)器材和試劑]1．10g／L高碘酸液2．雪夫(Schiff)染液3．亞硫酸液4．20g／L甲綠5．染色架、洗耳球、接水盤及吸水紙。6．光學(xué)顯微鏡、香柏油、乙醚和擦鏡紙。當(dāng)前1頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前2頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前3頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前4頁(yè)，總共28頁(yè)。[實(shí)驗(yàn)步驟]

1．新鮮血片或骨髓片用95％乙醇固定10min，蒸餾水沖洗，待干。2．10g／L高碘酸氧化15～20min，蒸餾水沖洗，待干。3．置雪夫試液室溫染色30～60min。4．用亞硫酸溶液沖洗3次后，以自來(lái)水沖洗2～3min，待干。5．20g／L甲綠復(fù)染10～20min。6．水洗，待干，鏡檢。7．結(jié)果(1)陽(yáng)性反應(yīng)：在細(xì)胞漿內(nèi)染紅色，呈彌漫狀、顆?；驂K狀。胞核染成綠色。陰性反應(yīng)，胞漿無(wú)色。(2)反應(yīng)強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)：①中性粒細(xì)胞的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：(－)胞漿無(wú)紅色顆粒。(+)胞漿內(nèi)呈淡紅色有極少顆粒。(++)胞漿呈紅色，厚而不透明，或有較少顆粒。(+++)胞漿呈深紅色，顆粒緊密，但尚有空隙。(++++)胞漿呈深紫紅色，顆粒緊密，無(wú)空隙。

當(dāng)前5頁(yè)，總共28頁(yè)。②淋巴細(xì)胞分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：(－)胞漿內(nèi)無(wú)顆粒。(+)胞漿內(nèi)呈彌散淡紅或有少數(shù)細(xì)顆粒(<9個(gè))。(++)胞漿內(nèi)呈彌散較深的紅色或有多數(shù)細(xì)顆粒(>10個(gè))。(+++)胞漿內(nèi)有較粗顆?；蛏贁?shù)小塊狀。(++++)胞漿內(nèi)呈多數(shù)粗顆粒并有大塊紅色物質(zhì)。

③幼紅細(xì)胞的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：(－)胞漿內(nèi)無(wú)顆粒。(+)胞漿內(nèi)有少數(shù)分散細(xì)小顆?；驕\紅色彌漫物質(zhì)。(++)胞漿內(nèi)有1～10個(gè)中等顆?；驈浡募t色。(+++)胞漿內(nèi)有11～20個(gè)較粗顆?；虺噬罴t色。(++++)胞漿顆粒較多，20個(gè)以上，并且粗，致密且呈紫紅色。當(dāng)前6頁(yè)，總共28頁(yè)。④巨核細(xì)胞的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：(－)細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有糖原，但細(xì)胞漿內(nèi)有彌散性著色，此系其它多糖類物質(zhì)。(+)含少量糖原，即含數(shù)小塊或一大塊糖原，糖原常定位于近核膜處。(++)胞漿內(nèi)含有中等糖原，即含許多小塊或少數(shù)大塊糖原，約占胞質(zhì)的1/3。(+++)胞漿內(nèi)含有大量糖原，呈大塊狀，其總面積約占胞漿面積的1/2以上。（＋＋＋＋）胞漿內(nèi)充滿糖原。(3)陽(yáng)性率和陽(yáng)性積分：根據(jù)不同情況的需要，觀察同一類細(xì)胞100個(gè)，求出陽(yáng)性率的百分比，將百分率與分級(jí)數(shù)的積相加，其總和即為積分。當(dāng)前7頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前8頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前9頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前10頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前11頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前12頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前13頁(yè)，總共28頁(yè)。實(shí)驗(yàn)五過(guò)氧化物酶(POX)染色[目的要求]1．

掌握本實(shí)驗(yàn)的原理和臨床意義。2．

熟悉本實(shí)驗(yàn)的操作方法及注意事項(xiàng)。[實(shí)驗(yàn)原理]

細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物酶能將底物的過(guò)氧化氫分解，產(chǎn)生新生態(tài)氧。后者將試劑中的聯(lián)苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍(lán)，它是一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，再與亞硝基鐵氰化鈉結(jié)合進(jìn)而生成藍(lán)黑色化合物沉淀于酶的所在部位。當(dāng)前14頁(yè)，總共28頁(yè)。[實(shí)驗(yàn)器材和試劑]1.0.3％聯(lián)苯胺乙醇溶液聯(lián)苯胺0.3g88％乙醇加至100ml2.360g／L亞硝基鐵氰化鈉飽和液

3.稀過(guò)氧化氫液（新鮮配制）3％過(guò)氧化氫0.3ml蒸餾水25ml

4.瑞氏染液、PH6.4～6.8磷酸鹽緩沖液。5.光學(xué)顯微鏡、香柏油、乙醚和擦鏡紙。6.染色架、洗耳球、接水盤及吸水紙。當(dāng)前15頁(yè)，總共28頁(yè)。[實(shí)驗(yàn)步驟]

1ml，360g／L亞硝基鐵氰化鈉飽和液10μl，混勻。2.于新鮮干燥血涂片或骨髓片上滴加上述混合液0.5ml，使蓋滿整個(gè)血膜，作用1～2min。3.滴加等量的稀過(guò)氧化氫液，混勻，染4～8min。4.勿傾去染液，直接用水沖洗。5.干燥后再用瑞氏染液復(fù)染。6.結(jié)果在細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)黑色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。

陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度的判斷：陰性：無(wú)顆粒。弱陽(yáng)性：顆粒小，分布稀疏。陽(yáng)性：顆粒略粗，分布較密集。強(qiáng)陽(yáng)性：顆粒粗大。當(dāng)前16頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前17頁(yè)，總共28頁(yè)。實(shí)驗(yàn)六堿性磷酸酶（NAP）染色

[目的要求]1．

掌握本實(shí)驗(yàn)的原理和臨床意義。2．

熟悉本實(shí)驗(yàn)的操作方法及注意事項(xiàng)。[實(shí)驗(yàn)原理]中性粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的堿性磷酸酶在PH9.6的堿性條件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀定位于胞漿中的酶活性處。當(dāng)前18頁(yè)，總共28頁(yè)。[實(shí)驗(yàn)步驟]

1．取新鮮血片自然干燥后放入95％乙醇液固定10min，用流水沖洗，待干。2．取基質(zhì)液，預(yù)溫至37℃，將血片置入，繼續(xù)溫育4～6h。3．滴加20g／L硝酸鈷，作用5min，蒸餾水沖洗。4．滴加20g／L硫化銨，作用5min，蒸餾水沖洗。5．用20g／L甲綠水溶液復(fù)染2～3min或用10g／L伊紅復(fù)染3～5min。6．水洗，待干，鏡檢。7．結(jié)果(1)正常人的血細(xì)胞堿性磷酸酶除中性成熟粒細(xì)胞(桿狀核及分葉核)可見(jiàn)陽(yáng)性外，其它細(xì)胞均呈陰性。(2)判斷標(biāo)準(zhǔn)及分級(jí)：(-)0分：胞漿呈淡紅色，無(wú)任何棕黑色顆粒。(+)1分：胞漿呈均勻淺色，無(wú)顆?；蛴猩倭孔睾谏w粒，但不超過(guò)胞漿總面積的1／4。(++)2分：全部胞漿呈均勻棕黑色或出現(xiàn)較粗的黑色顆粒，不超過(guò)胞漿1／2。(+++)3分：胞漿中已基本充滿棕黑色顆粒，但密度較低。(++++)4分：全部胞漿充滿粗大棕黑色顆粒而呈深黑色甚至掩蓋其胞核。(3)計(jì)算積分值：油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)中性桿狀核、分葉核粒細(xì)胞，分別記錄其分級(jí)情況，全部陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞之和即陽(yáng)性率。將得出各種積分的百分率乘以該積分?jǐn)?shù)，然后相加即為總積分。當(dāng)前19頁(yè)，總共28頁(yè)。實(shí)驗(yàn)七鐵染色

[目的要求]1．掌握本實(shí)驗(yàn)的原理和臨床意義。2．熟悉本實(shí)驗(yàn)的操作方法及注意事項(xiàng)。[實(shí)驗(yàn)原理]

骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細(xì)胞外鐵，其中的三價(jià)鐵與分子中的蛋白質(zhì)結(jié)合不牢，經(jīng)稀鹽酸處理后而游離，并能在酸性亞鐵氰化鉀溶液中產(chǎn)生普魯士藍(lán)反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)鐵也可用此法顯示。根據(jù)反應(yīng)的強(qiáng)弱了解骨髓中鐵的含量。[實(shí)驗(yàn)器材和試劑]1.甲醇2．200g/L亞鐵氰化鉀溶液3．濃鹽酸4.2g/L核固紅-硫酸鋁溶液當(dāng)前20頁(yè)，總共28頁(yè)。[實(shí)驗(yàn)步驟]1．選髓粒豐富的骨髓片，用甲醇固定10min。配制酸性亞鐵氰化鉀溶液：200g/L亞鐵氰化鉀溶液5份濃鹽酸1份3．玻片上滴滿酸性亞鐵氰化鉀溶液，染色30min。4．用蒸餾水沖洗后用2g/L核固紅-硫酸鋁溶液復(fù)染10～15min。5．流水沖洗、待干、鏡檢。6．結(jié)果(1)在紅色背景下鐵粒呈藍(lán)綠色。(2)細(xì)胞外鐵：用低倍鏡觀察涂片，特別是涂片尾部和髓粒附近，注意翠藍(lán)色顆粒的存在，可分五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。(-)：無(wú)顆粒所見(jiàn)。(+)：有少數(shù)鐵顆?；蚺家?jiàn)鐵小珠。(++)：有較多的鐵顆粒和小珠。(+++)：有很多的鐵顆粒、小珠和少數(shù)小塊狀。(++++)：有極多鐵顆粒、小珠，有很多的小塊，密集成堆。當(dāng)前21頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前22頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前23頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前24頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前25頁(yè)，總共28頁(yè)。當(dāng)前26頁(yè)，總共28頁(yè)。(3)細(xì)胞內(nèi)鐵：用油鏡計(jì)數(shù)100個(gè)中、晚幼紅細(xì)胞，記錄胞漿中含有藍(lán)色鐵粒的細(xì)胞(鐵粒幼紅細(xì)胞)的百分率。