單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)

單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)第一頁，共五十頁，2022年，8月28日一、單細(xì)胞藻類的特性單細(xì)胞藻類(Unicelluleralgae)，簡稱單胞藻。因藻體微小，又稱微藻（Microalgae）。單胞藻具有利用太陽光能效率高、營養(yǎng)豐富、生長繁殖迅速、對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)和容易培養(yǎng)等重要特性，因而受到重視。第二頁，共五十頁，2022年，8月28日通過研究人們發(fā)現(xiàn)單胞藻在下列6個方面，可以開發(fā)利用：1、作為植物生理研究的試驗材料。2、單胞藻的營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，氨基酸的種類組成及配比合理。脂肪含量高，富含動物需要的不飽和脂肪酸。還含有各種維生素和藥用成分?？衫脼槿祟惖臓I養(yǎng)食品和健康食品。3、可作為水產(chǎn)動物的餌料和禽、畜飼料添加劑。第三頁，共五十頁，2022年，8月28日4、可利用單胞藻提取色素、藥物及甘油等化學(xué)產(chǎn)品。5、叢粒藻（BotryococcusbrauniiKutzing）含油量一般為干藻重的30%-50%，最高可達(dá)80%，是作為能源開發(fā)的對象。6、可利用單胞藻光合作用放出的大量氧氣和吸收水中的富營養(yǎng)化成分來凈化污水和保持良好的水環(huán)境條件。第四頁，共五十頁，2022年，8月28日

目前，有關(guān)海水藻類的培養(yǎng)較多，我國在海水養(yǎng)殖方面，已大規(guī)模展開了某些浮游植物的培養(yǎng)，如扁藻（Platymonasspp）、中肋骨條藻（Skeletonemacostatum）、三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）、鹽藻（Dunaliellaspp.）、新月菱形藻（Nitzschiaclostertum）、牟氏角毛藻（Chaetocerosmuelleri）及球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）等，已解決貝類人工養(yǎng)殖的早期幼體餌料問題。在淡水養(yǎng)殖方面，我國只進(jìn)行了螺旋藻、魚腥藻、小球藻、柵列藻等的培養(yǎng)。第五頁，共五十頁，2022年，8月28日

今后，隨著養(yǎng)殖事業(yè)的發(fā)展，對一些新品種的養(yǎng)殖以及解決某些品種幼魚的餌料，必然涉及到藻類的培養(yǎng)。因此，有必要了解藻類培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識。先僅就藻類、主要是單細(xì)胞藻類的一般培養(yǎng)方法及有關(guān)理論加以簡述。

第六頁，共五十頁，2022年，8月28日二、單胞藻的生長模式單細(xì)胞藻類在培養(yǎng)過程中，生長繁殖的速度，出現(xiàn)一定的起伏，這種生長模式可劃分為五個時期（延緩期、指數(shù)生長期、相對生長下降期、靜止期、死亡期）第七頁，共五十頁，2022年，8月28日三、單胞藻的培養(yǎng)方式

單胞藻的培養(yǎng)方式，以藻類培養(yǎng)的目的要求而各種各樣。但可分為密閉式培養(yǎng)和開放式培養(yǎng)兩大類。第八頁，共五十頁，2022年，8月28日1．密閉式培養(yǎng)

密閉式培養(yǎng)的目的是不使外界雜藻、菌類及其他有機(jī)體混入培養(yǎng)物中。將培養(yǎng)液密封在與外界完全隔離的透明容器中，由此通氣、攪拌、輸送培養(yǎng)液及調(diào)節(jié)水溫和取樣等設(shè)備，也都要與外界隔離。培養(yǎng)容器多為管狀、也有池狀，用有機(jī)玻璃或透明的聚乙烯塑料做成水平管道，直立或斜立在地上，暴露陽光或人工光照下。這種培養(yǎng)方式，成本高，好控制，產(chǎn)量亦穩(wěn)定。第九頁，共五十頁，2022年，8月28日2．開放式培養(yǎng)

將藻類培養(yǎng)于敞開的容器（如水泥池、管道、木盆等）中。方法設(shè)備較簡便，可進(jìn)行小量或大面積的培養(yǎng)。該法培養(yǎng)物中易發(fā)生敵害生物污染，但成本低，使用較普遍，也是今后藻類培養(yǎng)所應(yīng)采取的方式。第十頁，共五十頁，2022年，8月28日開放式培養(yǎng)可分如下幾種類型：⑴開放循環(huán)培養(yǎng)：其特點是培養(yǎng)液借助循環(huán)水泵而不斷循環(huán)流動。培養(yǎng)物能循環(huán)，就可省卻攪拌工作。⑵開放非循環(huán)培養(yǎng)：其特點是培養(yǎng)液不循環(huán)流動，而定時由小管通入CO2和空氣到培養(yǎng)液中；同時也起攪拌作用。此法在大面積培養(yǎng)中使用較普遍。優(yōu)點是設(shè)備簡單，無需動力，水泵及大量的CO2及通氣設(shè)備。⑶半開放循環(huán)培養(yǎng)：半開放培養(yǎng)是指培養(yǎng)容器或池、槽等場所雖仍敞開，但有些部分密閉，或用塑料布覆蓋。這種培養(yǎng)方式，利用管道，依靠動力，使培養(yǎng)液流動和通入含二氧化碳的空氣。該方式設(shè)備復(fù)雜，但效果較好。第十一頁，共五十頁，2022年，8月28日四、培養(yǎng)液的配制及舉例

在實驗條件下培養(yǎng)單胞藻有多種培養(yǎng)基配方。這些配方大多數(shù)是早先發(fā)表過的配方的修改方，有些則從分析天然生境的水而得到，有些是從生態(tài)角度考慮的。第十二頁，共五十頁，2022年，8月28日發(fā)展藻類培養(yǎng)的營養(yǎng)配方時主要考慮的問題是：a、鹽的總濃度：大多是取決于有機(jī)體的生態(tài)來源。b、主要離子組分的組成及濃度：他們是鉀、鎂、鈉、鈣、硫酸鹽和磷酸鹽。第十三頁，共五十頁，2022年，8月28日c、氮源：硝酸鹽、氨和尿素常用作配方中的氮源，根據(jù)藻中的性能和pH的最適點而定。藻類的生長主要依賴氮的可利用性。大多數(shù)單胞藻干物中含有7～9％的氮。因此在1L培養(yǎng)液中生產(chǎn)10g細(xì)胞就至少需要500～600mg/LKNO3。第十四頁，共五十頁，2022年，8月28日d、碳源：無機(jī)碳通常是用含1～5％CO2的空氣來供應(yīng)的，碳的另一種供應(yīng)辦法是用碳酸氫鹽。選用何種辦法主要是根據(jù)藻類生長的pH最適點而定。

e、pH：通常用偏酸的pH值來避免鈣鎂和其它微量元素發(fā)生沉淀。

第十五頁，共五十頁，2022年，8月28日f、微量元素：培養(yǎng)基中的微量元素通常是用早已證明有效濃度的混合溶液來提供的（濃度在ug/L級范圍）。然而，這些微量元素的組分對藻類生長是否必須卻不能總能顯示。為增加微量元素的穩(wěn)定性，常用檸檬酸鹽和EDTA作為螯合劑。維生素：許多藻類要求有硫胺素和維生素B12的供應(yīng)。第十六頁，共五十頁，2022年，8月28日幾種常用的單胞藻培養(yǎng)液1、單細(xì)胞綠藻（柵列藻）培養(yǎng)液水生4號（NH4）2SO40.200gCa(H2PO4)2·H2O+2（CaSO4·H2O）0.030gMgSO4·7H2O0.080gNaHCO30.100gKCl0.025gFeCl3（1％）0.150mL

土壤浸出液0.500mL

水1000mL第十七頁，共五十頁，2022年，8月28日水生6號

NH2CONH20.133gH2PO40.033mLMgSO4·7H2O0.100gNaHCO30.100gKCl0.033gFeSO4（1％水溶液）0.200mLCaCl20.050mL

土壤浸出液0.500mL

水1000mL第十八頁，共五十頁，2022年，8月28日水生四號培養(yǎng)液中，藻類呈深綠色，生長繁殖速率較低。水生6號培養(yǎng)液中，藻類呈草綠色，色素不夠正常，但生長繁殖迅速。土壤浸出液是用田園土壤按水與土2:1的比例，攪勻浸泡后的上層清液，用前煮一小時后鏡檢，發(fā)現(xiàn)污染生物，應(yīng)再加溫消毒后使用。第十九頁，共五十頁，2022年，8月28日2．浮游硅藻培養(yǎng)液水生硅1（mg/Ｌ）硝酸氨120硫酸鎂70磷酸氫二鉀40磷酸二氫鉀80氯化鈣20氯化鈉10硅酸鈉100檸檬酸鐵5土壤浸出液20硫酸錳2水1000mLpH

7.0第二十頁，共五十頁，2022年，8月28日水生硅2（mg/Ｌ）尿素150氯化鉀30過磷酸鈣50硅酸鈣100硫酸鎂50碳酸氫鈉3硫酸錳3土壤浸出液4mL

EDTA－鐵1mL水1000mL第二十一頁，共五十頁，2022年，8月28日水生硅2號是用化肥尿素過磷酸鈣為氮磷來源，適于大量培養(yǎng)硅藻時選用，生長適溫為20～30℃；光強(qiáng)為2,000～5,000米燭光。第二十二頁，共五十頁，2022年，8月28日3．朱氏10號培養(yǎng)液：適用于培養(yǎng)硅藻、藍(lán)綠藻等。

H2O1000mLCa(NO3)20.04gK2HPO40.01gMgSO4·7H2O0.025gNa2CO30.02gNa2SiO30.025gFeCl30.008g

使用時按1/2、1/4、1/10稀釋使用。第二十三頁，共五十頁，2022年，8月28日4．f/2培養(yǎng)液硝酸鈉（NaNO3）75mg

磷酸二氫鈉（NaH2PO4）4.4mgf/2微量元素溶液1mLf/2維生素溶液1mL

海水1000mL

本配方適應(yīng)與目前生產(chǎn)上使用的各種微藻的培養(yǎng)，但用于硅藻培養(yǎng)時，應(yīng)再加50mgNa2SiO3。第二十四頁，共五十頁，2022年，8月28日附I：f/2微量元素溶液配方：硫酸鋅（ZnSO4·4H2O）23mg

硫酸銅（CuSO4·5H2O）10mg

氯化錳（MnCl2·4H2O）178mg

檸檬酸鐵（FeC6H5O7·5H2O）3.9g

鉬酸鈉（NaMoO4·5H2O）7.3mg

乙二銨四乙酸鈉（Na2EDTA）4.35g

六水氯化鈷（CoCl2·6H2O）12mg

純水1000mL第二十五頁，共五十頁，2022年，8月28日附II：f/2維生素溶液配方：維生素B120.5mg

維生素H（生物素）0.5mg

維生素B1100mg

純水1000mL第二十六頁，共五十頁，2022年，8月28日五、藻種的分離培養(yǎng)

為了要進(jìn)行某種藻類的科學(xué)研究和大量培養(yǎng)，有必要把某種藻類與其他生物分離。分離培養(yǎng)藻種，可分為兩大類:1、單種培養(yǎng)，即藻類雖只有一種，但還混雜細(xì)菌。

2、純培養(yǎng)，即不僅藻類只有一種，亦無其它任何生物。純培養(yǎng)比較困難，一般的分離培養(yǎng)往往只能做到單種培養(yǎng)。第二十七頁，共五十頁，2022年，8月28日

決定培養(yǎng)哪一種藻類，主要根據(jù)培養(yǎng)的目的要求，及某一種類的生物學(xué)特征。藻類的分離主要有以下幾種常用方法。

1、離心法：將混合液用離心機(jī)離心，水中不同藻體及細(xì)菌就以不同的速度下沉，因此得以分開。這樣將不同時間下從導(dǎo)管底的藻體取出，經(jīng)鏡檢選定某種藻類最多的沉積物，再加清水，繼續(xù)離心，如此反復(fù)就可得到比較單純的藻體，在接種相應(yīng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。該法可消除細(xì)菌，并增加純粹分離的可能性，至少可作為藻種平板培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作。另外，在水液中藻體含量較少時，可用此法集中藻體。但此法不能做到使不同藻類完全分離。第二十八頁，共五十頁，2022年，8月28日

2、稀釋法：該法源于中野治房（1933）的方法。用已消毒試管5只，在第一管盛蒸餾水10mL，第2～5管都裝5mL，用高壓蒸汽消毒，待冷卻后，第1管用滴管滴入混合藻液1～2滴，充分振蕩，使均勻稀釋。次用消毒吸管，從第1管中吸取5mL滴入第二管中如前振蕩，使均勻稀釋。以后依次同樣滴入第3～5管，并都充分均勻稀釋。然后把五個已盛又消毒的瓊膠培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，加熱使之溶解，待冷卻而尚未凝固時，分別滴入五個試管的藻液各一滴，用力振蕩，使藻液充分混于培養(yǎng)基中。待冷凝后，把五個培養(yǎng)皿放在受著漫射光窗口，一直到出現(xiàn)藻群時為止。在20℃左右時，約10天即出現(xiàn)藻群。用消過毒的白金絲取些藻群，進(jìn)行瓊膠固體培養(yǎng)基的不通氣培養(yǎng)。此過程反復(fù)多次，直至得到完全分離的純藻種群為止。此法稀釋要使用較多容器分組培養(yǎng)，比較麻煩，但較易成功。第二十九頁，共五十頁，2022年，8月28日

3、微吸管法：將水樣在載玻片上滴成綠豆粒大小的一些水滴，這樣可使每個水滴中有很少生物而便于分離；在解剖鏡下用微吸管（口徑小至0.008～0.16mm，圓口，可自行拉制）。將要分離的藻體吸出，用蒸餾水或平衡礦物質(zhì)溶液沖洗數(shù)次，然后主導(dǎo)成有培養(yǎng)基的小培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待生長旺盛后，再擴(kuò)大培養(yǎng)。此法較適用于能運動的藻類。第三十頁，共五十頁，2022年，8月28日

4、趨向反應(yīng)法：利用藻類的特殊趨向性（如向光、向地等）不同而分離藻體。此過程反復(fù)幾次就可得到一定純度的藻體。分離效果較好，只是不能應(yīng)用于不運動的藻體。第三十一頁，共五十頁，2022年，8月28日

5、平板分離法：在培養(yǎng)液中加入占培養(yǎng)液1.5％的瓊膠，加溶解后，注入培養(yǎng)皿中，加蓋后用15磅壓力121℃滅菌20分鐘，即制成膠質(zhì)培養(yǎng)基（也可用硅酸膠和明膠制備）。在瓊膠培養(yǎng)基放在40℃以下的水浴鍋內(nèi)，開蓋用吸管注入混合藻液，搖勻，使之分散在培養(yǎng)基平面上。之后，可放在恒溫箱內(nèi)，用熒光燈照射，使藻群生長。再經(jīng)鏡檢，反復(fù)此法不斷提純，即可分離出較純的藻種。第三十二頁，共五十頁，2022年，8月28日

6、固氮藍(lán)藻分離培養(yǎng)法：將一小片藻絲群接種到培養(yǎng)基上，幾天后再用滅菌白金絲挑取生出的新藻絲接種到平板培養(yǎng)基上。這樣經(jīng)幾次分離接種就得到較純的藻種。

第三十三頁，共五十頁，2022年，8月28日六、藻種的選擇、接種和保存1．藻種的選擇：雖然藻類種類較多，但其中僅少數(shù)經(jīng)過人工培養(yǎng)。應(yīng)該研究在室外培養(yǎng)其他藻種的可能性和他們生產(chǎn)的潛力，所選擇的生物種應(yīng)具有下列特征：⑴生長迅速；⑵對極端的溫度和輻射條件的耐性范圍大；⑶蛋白質(zhì)，脂類和糖類含量高，或有選擇地積累一種特殊的代謝產(chǎn)物（如甘油）；⑷無毒性，且易于收獲。根據(jù)系統(tǒng)的要求和特殊的方法，還可有其他要求。第三十四頁，共五十頁，2022年，8月28日2．接種：在分離到單純藻群后，就可接種到培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)而移養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)。接種方法有液體接種和干藻接種。前者是將藻液直接加入培養(yǎng)液中進(jìn)行攪拌，加入的藻種分量視水溫而定，水溫較低（10℃以內(nèi)）時，多加；約占培養(yǎng)液總量的30～40％左右，水溫適宜時（25～30℃左右），可加5～8％左右。后者若用干藻的藻體接種，接種量為0.1～0.2％。第三十五頁，共五十頁，2022年，8月28日3．藻種的保存：

一旦藻種分離得到，就要保存好以便在一定的時間內(nèi)供接種用。為此，要將藻種消毒，避免其他來源的污染。給以適當(dāng)?shù)墓庹蘸蜏囟?。在液體培養(yǎng)中，為了快速增殖，可用5400lx。再得到良好生長后（1～2周），培養(yǎng)液移到更低的光照條件（540～1100lx），以求緩慢生長及儲藏。第三十六頁，共五十頁，2022年，8月28日

藻類在瓊脂培養(yǎng)基上接種后的藻種，先給予2700lx光照6～7天，直到得到良好生長，然后移到540～800lx光強(qiáng)的地方。大多數(shù)藻類保存在室溫下（15～20℃）即可，少數(shù)藻種存活需較高溫度。第三十七頁，共五十頁，2022年，8月28日

藻種接代一次的頻率視物種及貯存條件而不同，單胞藻及絲狀不運動的物種可以每六個月到十二個月移種一次，有鞭毛的物種移種次數(shù)要更頻繁些。某些藻種曾成功地做到了在液氮下長期保存。

第三十八頁，共五十頁，2022年，8月28日七、管理及采收方法

1、管理藻類培養(yǎng)的管理包括培養(yǎng)基養(yǎng)料的補(bǔ)給、光照及溫度調(diào)節(jié)、CO2的補(bǔ)給、攪拌、防污等。在培養(yǎng)過程中，補(bǔ)給的養(yǎng)料，要選擇肥效速，并有持久性，來源較廣，價格低廉的種類。一般都以有機(jī)肥料為補(bǔ)肥。第三十九頁，共五十頁，2022年，8月28日光照、溫度的調(diào)節(jié)視種類及季節(jié)而定。室內(nèi)照光一般都采用白熾電燈和熒光管。溫度調(diào)節(jié)一般采用室內(nèi)用白熾燈照射培養(yǎng)物或用溫室、安裝電熱管等升溫，室外冬季升溫較困難，主要采用玻璃棚；用冷水管道降溫，或經(jīng)通風(fēng)遮陽降溫。第四十頁，共五十頁，2022年，8月28日CO2的補(bǔ)給一般通過空氣壓縮機(jī)或橡皮管將含5％CO2的空氣通過培養(yǎng)物中。攪拌是藻類培養(yǎng)不可少的一道工序。攪拌可使培養(yǎng)物均勻分布，水溫均勻，利于藻類生長。攪拌的方法一般為人力攪拌、風(fēng)力攪拌、空氣攪拌和磁力攪拌。此外還有循環(huán)流動法。第四十一頁，共五十頁，2022年，8月28日防污在藻類培養(yǎng)中很重要，對雜藻及細(xì)菌的防治主要采用石灰、漂白粉、硫酸銅等試劑。用1～0.5ppmCuSO4防止雜藻的效果較好。當(dāng)有浮游動物污染時，可施用化學(xué)試劑、殺蟲劑等殺滅，如硫酸銅1～2ppm可殺滅輪蟲、纖毛蟲；漂白粉4ppm對各種蟲類均有效；食鹽9‰，可殺滅輪蟲；碘液5‰，再稀釋到十萬分之一，可殺滅纖毛蟲。第四十二頁，共五十頁，2022年，8月28日2、采收方法培養(yǎng)物的采收的時間要適當(dāng)，主要根據(jù)其密度大小決定。采收的方法有：（1）物理濃縮：①離心法：國外使用最普遍。它利用離心力來把藻體與水液分離，是藻體下沉達(dá)到濃縮目的。主要工具是離心機(jī)。②重力沉降法：利用重力使培養(yǎng)物下沉而得到濃縮物。使用的工具是沉淀器。③遮光法和降溫法：對趨光性強(qiáng)的藻類，如衣藻等進(jìn)行遮蔽光線，使培養(yǎng)物下沉而得到濃縮物。低溫使藻類也有下沉現(xiàn)象。第四十三頁，共五十頁，2022年，8月28日（2）化學(xué)濃縮法：用沉淀劑如明礬、石灰等，使培養(yǎng)物下沉，而得到濃縮物。明礬0.3～0.4‰，將之研碎，加入培養(yǎng)物中攪