基因探針的學習材料

基因探針的學習材料第1頁/共52頁基因探針

基因探針又稱核酸分子雜交技術，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的?；蛱结樖侵改芘c特定的靶分子序列發(fā)生特異性相互作用的標記分子.也就是指一段能識別(與目的序列或靶序列互補)特異性堿基序列(基因)的標記同位素等標記物的單鏈DNA或RNA的分子。第2頁/共52頁檢測DNA的技術稱為.Southernblot雜交.檢測RNA的技術稱為.Northernblot雜交.檢測蛋白質(zhì)的技術稱為.Westernblot雜交.還有dotblot,原位雜交技術等.第3頁/共52頁雜交類型

固相雜交液相雜交第4頁/共52頁核酸分子雜交

(固相雜交)

Northern雜交

Southern雜交

芯片以上方法決定雜交模板核酸性質(zhì),DNASouthern雜交.RNANorthern雜交

第5頁/共52頁探針與核酸雜交的方法

1）斑點雜交(dot-blot)2）菌落/噬菌斑：轉(zhuǎn)印篩選法3）組織/細胞(DNA或RNA)：原位雜交(insituhybridizationISH).Southern-blot(DNA)、Northern-blot(RNA)DNA和RNA操作基本一樣，只是電泳所用的膠有所不同(RNA易形成二級結(jié)構(gòu))第6頁/共52頁探針基因的分離制備同位素或非同位素標記標記基因探針的純化檢測樣品核酸制備雜交膜制備或轉(zhuǎn)印預雜交雜交洗膜圖3-3核酸探針雜交試驗全過程示意圖第7頁/共52頁（a）（b）（c）（d

）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern

凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術第8頁/共52頁RNA印跡技術（Northernblotting）

1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術十分類似,所以叫做諾賽恩RNA印跡技術（Northernblotting）。而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標記的特定蛋白質(zhì)之抗體進行反應,這種技術叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術（Westernblotting）。第9頁/共52頁斑點印跡雜交和狹線印跡雜交斑點印跡雜交（dotblotting）和狹線印跡雜交（slotblotting）是在Southern印跡雜交的基礎上發(fā)展的量種類式的快速檢測特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術。由于在實驗的加樣過程中使用了特殊設計的加樣裝置，使眾多待測樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點陣或線陣。這兩項技術更適應與核酸樣品的定量檢測。第10頁/共52頁檢測重組體克隆的菌落雜交技術菌落雜交第11頁/共52頁原位雜交

(insituhybridizationISH)原位核酸分子雜交技術簡稱原位雜交(insituhybridizationISH)是應用已知堿基順序并帶有標記物的核酸探針與組織、細胞中待檢測的核酸按堿基配對的原則進行特異性結(jié)合而形成雜交體，然后再應用與標記物相應的檢測系統(tǒng)，通過組織化學或免疫組織化學方法在被檢測的核酸原位形成帶顏色的雜交信號，在顯微鏡或電子顯微鏡下進行細胞內(nèi)定位。第12頁/共52頁一、基因探針1）DNA酶切片段2）用PCR擴增出的核酸3）直接用RNA作探針4）人工合成（含標記）1.基因探針的類型第13頁/共52頁2.基因探針的要求1）盡量避免高度重復序列：根據(jù)目的而定。最好用cDNA(要將polyA或polyT去掉)。2）G+C含量：40-60%3）探針本身不能有4個連續(xù)互補堿基，否則本身形成二級結(jié)構(gòu)。4）不主張幾個連續(xù)相同堿基5）檢測目的核酸時，要考慮模板出現(xiàn)率。（兼并性）6）探針比模板短：實際用長探針檢測短模板的也可，不影響結(jié)果。第14頁/共52頁3.核酸探針雜交所用的固相載體1）芯片：種類多，用于工業(yè)生產(chǎn)，見各公司介紹。

2）硝酸纖維膜(NC膜)：吸附單鏈DNA、RNA能力強，80-100ug/cm2；也可非特異性吸附蛋白，但吸附率比核酸低。缺點：脆、易折斷；不能吸附小片段DNA。3）尼龍膜：吸附DNA能力比NC膜強，也可吸附小至10bp的DNA。優(yōu)點：易把模板固定在膜上；可反復使用多次。4）化學活化膜：用化學試劑把NC膜處理，可吸附極少量核酸。也可用普通濾紙。5）濾紙第15頁/共52頁核酸雜交常用幾種膜的性能比較第16頁/共52頁硝酸纖維膜(NC膜)硝酸纖維膜有兩種;0.22μm孔經(jīng)0.45μm孔經(jīng)第17頁/共52頁4.基因探針的標記物1）同位素：H3、

S35、

P32最常用（缺點：不能保存）2）非同位素：①地高辛：植物中提取。商品化地高辛標記dCTP，即合成鏈時，用地高辛標記dCTP。dCTP-地高辛與酶標抗地高辛抗體反應，加底物顯色。②生物素-親和素：用酶標親和素測dCTP-生物素③熒光：送生物公司標記第18頁/共52頁5.探針標記方法1）DNA的切口平移2）隨機引物法3）單鏈DNA探針4）RNA探針5）DNA的5’或3’末端標記6）寡核苷酸標記7）PCR標記第19頁/共52頁DNA的切口平移法

雙鏈DNA分子的一條鏈有切口時，大腸桿菌DNA聚合酶I可把核苷酸殘基加到切口處的3’羥基端。且由于此酶具有5’3’外切酶活性，它還可以從切口的5’端除去核苷酸。5’端核苷酸的去除與3’端核苷酸的加入同時進行，導致切口沿著DNA鏈移動(切口平移)。第20頁/共52頁切口平移的反應體系探針DNA0.5ug10×切口平移緩沖液2.5uL10×dNTP（無dCTP）每種20nmolDNaseI(10ng/mL)2.5uLDNA聚合酶I2.5單位[α-32P]dCTP16pmol加dH2O至25uL14~16℃1~2h

加1uL0.5mol/LEDTA(pH8.0)終止反應第21頁/共52頁隨機引物法DNA聚合酶利用寡核苷酸作引物，沿單鏈模板合成DNA。如果寡核苷酸的序列不均一，它們就會在模板的許多位置上和模板雜交，因此模板上的每個核苷酸(可能要除去最靠近5’端的一些核苷酸)被拷貝進產(chǎn)物中去的頻率相同。使用[α-32P]dNTP作為前體，用此法可合成比活度非常高的標記DNA探針。第22頁/共52頁隨機引物的獲得：1）用DNA酶I消化小牛胸腺DNA或鮭精DNA產(chǎn)生大量6—12核苷酸的單鏈DNA。2）從一些廠家購買用小牛胸腺DNA制備的隨機引物。如Pharmacia、Boehringer、Mannheim等。3）在自動DNA合成儀上合成一個八聚體集群，這一分子集群在八聚體的每一個位置上都含有所有4種堿基。第23頁/共52頁單鏈DNA探針

單鏈探針僅由特定核酸序列的互補雙鏈之一組成，與傳統(tǒng)的雙鏈探針相比有很大的優(yōu)越性。由于不存在互補鏈，因此可以消除由探針的兩條鏈重退火形成無效雜交體的可能性。當用來自某一種生物中的探針去檢測另一種遠緣生物中可與之交叉雜交的序列時，單鏈探針尤為有用。由DNA模板體外制備單鏈探針有兩種方法：1）合成可與克隆于嗜菌?；騇13噬菌體載體上的序列互補的放射性標記DNA（圖3-1）2）將克隆于特定載體上的靶序列轉(zhuǎn)錄成放射性標記的RNA，在此載體上帶有可被噬菌體依賴于DNA的RNA聚合枚識別的啟動子。第24頁/共52頁將靶序列克隆于適當?shù)腗13噬菌體或噬菌粒載體中，分離出帶有靶序列的單鏈DNA通用引物利用通用引物合成與靶序列互補的放射性標記DNA大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段3種未標記dNTP1種32p標記dNTP用切點位于靶序列遠端的限制酶來消化DNA

通過凝膠電泳把標記探針與未標記的的模板分開放射性標記的標準參照物未標記的模板DNA放射性標記的DNA來自標記DNA3’端的片段利用單鏈DNA載體合成探針(從左到右)第25頁/共52頁RNA探針

在來自鼠傷寒桿菌SP6噬菌體或來自大腸桿菌T7及T3噬菌體的強啟動子下游裝置多克隆位點，組建成質(zhì)粒載體，可合成高比活度的單鏈RNA探針。RNA探針具有許多優(yōu)越性：1）放射性標記RNA的合成效率高。因為用于合成RNA的模板可被轉(zhuǎn)錄多次，所以產(chǎn)生的RNA數(shù)倍于模板。2）rNTP的濃度相對交低時(1-20umol/L)，噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶也能在體外發(fā)揮作用，所以合成高比活度全長探針的成本相對較低。3）僅用無RNA酶的DNA酶I處理就可從RNA探針中除去模板DNA。而不必用凝膠電泳進行純化。4）由于RNA雜交體的穩(wěn)定性本身就比較高，所以RNA雜交反應中產(chǎn)生的信號一般要比相同比活度的DNA探針強。5）RNA探針的使用改進了分析哺乳動物基因轉(zhuǎn)錄物的方法。可用RNA酶A來消化RNA∶RNA雜交體，而不必用難以控制的S1核酸酶來消化DNA∶RNA雜合分子。第26頁/共52頁多克隆位點SP6啟動子T7啟動子將靶序列克隆于帶有噬菌體啟動子的質(zhì)粒中，這些啟動子可被噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶所識別用切點位于靶序列遠端的限制酶消化重組質(zhì)粒產(chǎn)生平端或3’凹端SP6啟動子T7啟動子SP6噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶3種未標記rNTP1種32p標記rNTP用DNA酶I消化以去除模板DNA32p標記的RNA體外轉(zhuǎn)錄合成RNA探針(從左到右)第27頁/共52頁DNA的5’或3’末端標記

不同的末端標記用不同的酶：1）大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段：3’末端標記2）T4噬菌體多核苷酸激酶：標記DNA5’端3）T4噬菌體DNA聚合酶：標記DNA3’端第28頁/共52頁寡核苷酸標記①T4噬菌體多核苷酸激酶：合成的寡核苷酸在合成時其5’端缺少一個磷酸基，因而極易用T4噬菌體多核苷酸激酶進行磷酸化反應，從而將γ-32p從[γ-32p]ATP轉(zhuǎn)移至其5’端。②大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段：用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段合成與合成寡核苷酸互補的DNA鏈，可得到高比活度的探針。用一短引物與寡核苷酸模板結(jié)合，后者的序列互補于所用的放射性標記探針。該引物隨后在大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段的作用下延伸，從而使[α-32p]dNTP在模板指導下發(fā)生摻入。第29頁/共52頁標記基因探針的純化1）乙醇沉淀法2）CPB沉淀法：回收用磷酸鹽緩沖液從羥基磷石灰層析柱洗脫下來的DNA3）放射性標記探針的純化:19%PAGE電泳、Bio-GelP-60柱或Sep-Pak柱層析第30頁/共52頁1）探針濃度①同位素標記的探針：5-100ug/mL②非同位素標記的探針：25-1000ug/mL③原位雜交：0.5-5.0ug/mL注：2）隨機多聚體①硫酸葡聚糖：5-10%②PEG6000-8000③聚丙稀酸（鈉鹽）：2-4%第31頁/共52頁

轉(zhuǎn)印虹吸印跡法

電轉(zhuǎn)移法

DNA片段大小影響轉(zhuǎn)移速度.第32頁/共52頁

預雜交用DNA酶I消化并變性的小牛胸腺DNA或鮭精DNA封閉膜.第33頁/共52頁

雜交液5XSSC20mmol/L鱗酸緩沖液

(pH7.0)5XDenholdt氏液

10%硫酸葡聚糖

100μg/ml變性小牛胸腺DNA或鮭精DNA.50%甲酰胺第34頁/共52頁洗滌液2XSSC,0.5%SDS5min.2XSSC,0.1%XSDS15min.(室溫).0.1XSSC,0.1%XSDS37°C30min至1h.0.1XSSC,0.1%XSDS65°C洗滌30min至1h.(水浴)顯影(放射性,非放射性)第35頁/共52頁原位雜交原位雜交1969年美國耶魯大學Gall和Pardue首先創(chuàng)立的，他們用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，確定該基因定位于卵母細胞的核仁中。第36頁/共52頁原位雜交技術的基本方法：(一),雜交前探針種類選擇。(二),雜交前探針標記方法選擇。(三),探針的純化。(四),雜交前準備,包括固定、取材、玻片和組織的處理，增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等。(五),組織的前處理。(六),預雜交。(七),原位雜交。(八),雜交后處理(漂洗)。(九),雜交后顯色。第37頁/共52頁原位雜交固定目的是為了保持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，最大限度地保存細胞內(nèi)的DNA或RNA的水平；使探針易于進入細胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。RNA更易被酶降解，應考慮到取材至進入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。第38頁/共52頁固定劑最常用多聚甲醛固定組織。醋酸酒精的混合液和Bouin′s固定劑也能獲得較滿意的效果。mRNA的定位將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1~2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃切片可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。第39頁/共52頁在病理學活檢取材時多用福爾馬林固定和石蠟包埋。其它固定劑如應用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲滿意效果。各種固定劑均有各自的優(yōu)缺點，如沉淀性(Precipitating)固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件,但它們不能最大限度地保存RNA,而且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。戊二醛較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu),但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交聯(lián),從而大大地影響了核酸探針的穿透性。第40頁/共52頁雜交雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片，或采用無菌的蠟膜代替硅化的蓋玻片,加蓋片防止孵育過程中雜交液的蒸發(fā)。在蓋玻片周圍加液體石蠟封固或加橡皮泥封固。玻片進行雜交的載玻片放在盛有少量5×SSC或2×SSC(standardsalinecitrate,SSC)溶液的濕盒中進行孵育。第41頁/共52頁雜交后漂洗雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高漂洗。第42頁/共52頁顯示顯示又可稱為檢測系統(tǒng)(Detectionsystem)。根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理。第43頁/共52頁非特異性染色非特異性染色可能會來自探針、組織內(nèi)源性酶、組織細胞、顯色系統(tǒng)等;探針特異性不高以及組織細胞內(nèi)某些成分與顯示系統(tǒng)中的抗體成分非特異結(jié)合也可造成非特異性染色。組織細胞內(nèi)源性酶是原位雜交中非特異性著色的重要原因,目前最常用的酶是過氧化物酶和堿性磷酸酶,這兩種酶都廣泛存在于組織細胞中,因此用這些酶時應有消除內(nèi)源性酶的相應步驟。如過氧化物酶用3%H2O2處理5~10min;10%冰醋酸處理組切片10min,或在底物顯色液中加入1mmol/L左旋咪唑可防止內(nèi)源性堿性磷酸酶的染色。NBT/BCIP顯示堿性磷酸酶時如果在光照下顯色也會增強非特異性染色。必須根據(jù)檢測系統(tǒng)不同的標記酶作不同的內(nèi)源酶處理。第44頁/共52頁常用的對照試驗

1將cDNA或cRNA探針進行預雜交(吸收試驗)。2與非特異性(載體)序列和不相關探針雜交(置換試驗)。3將切片應用RNA酶或DNA酶進行預處理后雜交。應用同義RNA探針(Senseprobe)進行雜交。4以不加核酸探針雜交液進行雜交(空白試驗)。5組織對照用已知確定為陽性或陰性組織進行雜交對照。6應用未標記探針做雜交進行對照。第45頁/共52頁通常用地高辛(Dig),生物素,熒光素,同位素,等標記探針;(一)、地高辛(Dig)標記DNA探針在石蠟切片檢測病毒DNA的方法。(二)、生物素標記DNA探針在石蠟切片上檢測目的DNA的方法。(三)、cRNA探針檢測組織切片中的RNA原位雜交。(四)、用寡核苷酸探針檢測組織切片中的RNA原位雜交。

(五)、用cDNA探針檢測體外培養(yǎng)細胞中的RNA原位雜交。(六)、RNA原位雜交與免疫組化雙重檢測技術。(七)、多重RNA原位雜交技術。(雙重原位雜交是在同一標本或同一細胞內(nèi)同時檢測兩種或兩種以上的靶核酸序列的技術。)(八)、原位雜交的PCR增敏法。第46頁/共52頁引物原位標記技術(PrimedinsituLabeling,PRINS)

針對染色體的特異性α-衛(wèi)星DNA序列設計和合成引物。

利用未標記的寡核苷酸引物與變性后的染色體DNA特異結(jié)合,然后用熒光素標記的脫氧核苷酸(dUTP)與未標記的脫氧核苷酸一起在DNA聚合酶的作用下進行延伸反應,標記了的dUTP將以堿基配對的形式摻入到新合成的DNA單鏈中,最后用相應的熒光抗體與標記物結(jié)合以顯示檢測結(jié)果。

第47頁/共52頁原位雜交技術應用原位雜交技術已應用于基礎研究如基因組圖(Genemapping),轉(zhuǎn)基因檢測,基因表達定位(localizationofgeneexpression),核DNA和RNA的mRNA的排列和運輸(arrangementandtransportofmNA),復制(replication)和細胞的分類(Sortingofcells)。臨床研究應用在細胞遺傳學(Cytogenetics),產(chǎn)前診斷(Prenataldiagnosis),腫瘤和傳染性疾病的診斷,生物學劑量測定(biologicaldosimetry)和病毒學的病原學診斷等。第48頁/