基因工程重組蛋白的分離純化放映

基因工程重組蛋白的分離純化放映第1頁/共33頁意義？？生物工程以基因工程為核心，主要產(chǎn)品為蛋白質(zhì)或多肽。通過多年的努力，我國基因工程“上游”已與國外差距縮小，但“下游”技術(shù)，尤其是蛋白質(zhì)純化處理與先進國家相比，仍有很大差距。第2頁/共33頁目錄一．獲得基因工程產(chǎn)品的特點二．建立蛋白質(zhì)純化工藝的依據(jù)三．蛋白質(zhì)分離純化應(yīng)遵順的原則四．分離純化的基本過程五．幾種主要蛋白質(zhì)分離純化的方法優(yōu)缺點對比第3頁/共33頁一．獲得基因工程產(chǎn)品的特點

⑴

目的產(chǎn)物在初始物料中含量低，而且往往在細胞內(nèi)。含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜，除了目的產(chǎn)物外，還含有大量的細胞、代謝物、殘留培養(yǎng)基、無機鹽等，特別是產(chǎn)物降解酶、產(chǎn)物類似物等對目的產(chǎn)物的分離影響很大。⑵.目的產(chǎn)物一般是大分子物質(zhì)，穩(wěn)定性差，具有生物活性的物質(zhì)對pH值、溫度、金屬離子、有機溶劑等十分敏感，容易失活、變性；⑶.種類繁多，包括有大、中、小分子，結(jié)構(gòu)簡單或復(fù)雜的有機化合物以及結(jié)構(gòu)復(fù)雜又性質(zhì)各異的生物活性物質(zhì)。對這些大分子基因工程產(chǎn)品的純化缺乏必要的數(shù)據(jù)，似乎每種蛋白都有其獨自的純化方案，放大也往往憑經(jīng)驗，不像抗生素等小分子物質(zhì)有很多數(shù)據(jù)可指導(dǎo)放大。⑷.應(yīng)用面廣，往往是注射用，對其質(zhì)量、純度要求高，無菌、無病毒、無熱原。

第4頁/共33頁二．建立蛋白質(zhì)純化工藝的依據(jù)

2.1目標蛋白的各種性質(zhì)①分子量大小，大的蛋白質(zhì)先過凝膠柱；②分子形狀，球蛋白易擴散人凝膠過濾柱填料顆粒的小孔內(nèi)，較遲洗脫出來；③電荷與電荷分布，與離子交換緊密相關(guān)；④疏水性，與疏水層析、反相高壓色譜有關(guān)；⑤.溶解度，影響因素有pH值、離子強度、離子的性質(zhì)、濕度和溶劑極性等，可用于沉淀分離；⑥密度，磷蛋白等密度大，可用密度梯度法分離；⑦配體結(jié)合能力，用于親和層析；⑧金屬結(jié)合能力，用于鰲合有金屬離子的親和柱；⑨翻譯后修飾，如連有糖基的蛋白可用于含有外源凝集的親和柱，磷蛋白質(zhì)在某些糖基下能與鰲合有FeZ'的柱子結(jié)合。第5頁/共33頁2.2物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)

包括雜質(zhì)的種類和含量、化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、相對分子量、電荷性及數(shù)量、生物學(xué)特性、穩(wěn)定性(對于熱、pH值、鹽、有機溶劑等)、溶解度、吸附性能等。第6頁/共33頁2.3初始物料的特點

①菌種類型及其代謝特性，包括菌種表達方式(是否以包含體形式)、副產(chǎn)物種類、產(chǎn)物類似毒素、蛋白酶種類、原材料和培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量；②生產(chǎn)工藝和條件，包括滅菌方法和條件、生產(chǎn)方式(連續(xù)、批式、半連續(xù))、生產(chǎn)周期、生產(chǎn)能力、工藝控制條件、因素及方式等；③初始物料的各種性質(zhì)，包括產(chǎn)物濃度、雜質(zhì)種類、濃度變化、鹽的種類、濃度、溶解度、pH值、粘度等。第7頁/共33頁2.4產(chǎn)品質(zhì)量的要求

產(chǎn)品質(zhì)量標準和用途對產(chǎn)品純度、生物活性、比活的要求。包括允許雜質(zhì)種類和最大允許含量，特殊雜質(zhì)種類和最大允許量。以及雜質(zhì)對使用的影響、產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性等。

第8頁/共33頁三．蛋白質(zhì)分離純化應(yīng)遵順的原則

①具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。盡量不變或少受發(fā)酵工藝、條件及原材料來源的影響，使產(chǎn)品規(guī)格統(tǒng)一。必須明確嚴格控制的步驟和技術(shù)，以及允許的變化范圍。②步驟之間盡量能銜接，減少工藝的步驟，同時工藝與設(shè)備也要相互適應(yīng)，一般分離原理相同的技術(shù)在工藝中不要重復(fù)使用，既可減少周期，又能提高純度和得率。③技術(shù)條件要溫和，溫度低，PH值適中，能保持目的產(chǎn)物的生物活性。④工藝過程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟或干擾產(chǎn)品質(zhì)盆。⑤周期盡量短，因穩(wěn)定性差的產(chǎn)物隨工藝時間增加，收率、質(zhì)量會下降。⑥目的蛋白質(zhì)選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中將目的產(chǎn)物有效地分離出來，達到較高純化倍數(shù)。⑦工藝和技術(shù)必須快速高效、收率高、易操作、對設(shè)備條件要求低、能耗低。⑧具有較高的安全性。在選擇處理技術(shù)，工藝和操作條件時，要確保去除有危險的雜質(zhì)，保證產(chǎn)品質(zhì)量和作用安全以及生產(chǎn)過程的安全，藥品生產(chǎn)必須保證安全、無菌、病毒、熱原。第9頁/共33頁四．分離純化的基本過程

樣品的固液分離與預(yù)處理基因工程藥物多為胞內(nèi)產(chǎn)物，分離提取這類物質(zhì)時，需要經(jīng)細胞收集細胞破碎細胞碎片分離等步驟層析純化細胞收集細胞破碎細胞碎片收集第10頁/共33頁細胞破碎針對這種結(jié)構(gòu)，細胞破碎方法有機械破碎法和非機械破碎法，可以根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模和活性蛋白在細胞中的位置，選擇適當?shù)姆椒?。機械破碎法是常用的方法，速度快，處理量較大，不會帶人其他化學(xué)物質(zhì)，但在處理過程中產(chǎn)生熱量，必要時要采取冷卻措施，以防止目的產(chǎn)物失活?，F(xiàn)常用方法有高壓勻漿法、超聲破碎法、高速珠磨法、高壓擠壓法。非機械破碎法包括酶溶法、化學(xué)滲透法、熱處理法、滲透壓沖擊法。酶溶法就是利用生物酶將細胞壁和細胞膜溶解的方法。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖昔酶、膚鏈內(nèi)切酶、殼多糖酶等。溶菌酶對細菌類作用效果好，其他酶對酵母作用效果好。利用酶溶法處理細胞時必須根據(jù)細胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇合適的酶.并確定相應(yīng)的使用次序，控制好溫度、pH值和酶量?；瘜W(xué)滲透法利用一些有機溶劑(苯、甲苯)等可以改變細胞壁或細胞膜的通透性，從而使內(nèi)含目的產(chǎn)物有選擇地滲透出來。細胞壁是由堅固的多聚糖、乙酸葡萄糖胺和乙酞胞壁酸所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有一定的韌性。第11頁/共33頁分離細胞碎片分離細胞碎片是比較困難的，可以用離心、膜過濾或雙水相分配的方法，使細胞碎片分配在一相(通常為下相)而分離，同時也起部分純化作用；得到的上清液可以通過硫酸氨分級沉淀、有機溶劑沉淀、等電點沉淀、超濾濃縮脫鹽等進行預(yù)處理，有些可以進行特殊處理，如加熱、三氯乙酸處理等除去雜蛋白。以枯草桿菌、畢赤酵母等作為基因工程菌的話，由于都是外分泌，直接用離心、過濾等方法進行分離，可以加人一些助濾劑等利于分離。第12頁/共33頁層析純化預(yù)處理的產(chǎn)物可能仍與大量的雜質(zhì)混合在一起，這類雜質(zhì)可能有病毒、熱原質(zhì)、氧化產(chǎn)物、核酸、多聚體、雜蛋白、與目的物類似的異構(gòu)體等。進一步純化主要依賴色譜分離方法，其優(yōu)點是具有多種多樣的分離機制，便于自動化控制和分離過程中無發(fā)熱等有害效應(yīng)。層析純化方法設(shè)計應(yīng)根據(jù)目的蛋白和雜蛋白的物理、化學(xué)和生物學(xué)方面性質(zhì)的差異，尤其重要的是表面性質(zhì)差異，例如表面電荷密度、對一些配基的生物學(xué)特異性、表面疏水性、表面金屬離子、糖含量、自由疏基數(shù)目、分子大小和形狀(相對分子質(zhì)量)，pl，和穩(wěn)定性等。選用的方法應(yīng)能充分利用目的蛋白和雜蛋白間上述差異離子交換色譜(ionexchangechromatography,IEC)疏水色譜(hydrophobicinteractionchromatography,HIC)親和色譜(affinitychromatography,AC)。凝膠過濾色譜第13頁/共33頁五.幾種主要蛋白質(zhì)分離純化的方法優(yōu)缺點對比

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方法原理優(yōu)點缺點特點基于分子大小差異的分離技術(shù)凝膠層析（又稱凝膠過濾、分子篩層析或排阻層析）利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子大小差異分離混合物的方法。條件溫和、簡便、分離范圍廣、回收率高,對生化物質(zhì)的分離十分適宜

該法上樣量有限常用在純化的最后一步，與其他分離方法(如離子交換)組合使用超濾利用加壓膜分離技術(shù)，在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制薄膜，大分子溶質(zhì)滯留，從而使大分子物質(zhì)得到部分的純化超濾技術(shù)作為一種典型的膜分離技術(shù)，則具有高效率、低能耗、無相變、無需添加任何化學(xué)試劑、操作簡便、條件溫和等諸多優(yōu)點超濾膜缺乏選擇性以及在超濾過程中易

產(chǎn)生濃差極化與膜污染在超濾過程中，所用超濾膜的孔徑約為1～100nm，截留相對分子質(zhì)量(molecularweight

為3×105～1×106，能用于蛋白質(zhì)、細菌、膠體、病毒、熱原、多糖等的分離

透析透析是利用小分子經(jīng)過半透膜擴散到水(或緩沖液)的原理，將無機鹽等小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)，常和鹽析、鹽溶等方法聯(lián)合使用透析結(jié)果表明，大的蛋白質(zhì)

分子和小的氨基酸分子得到初步分離。必須利用不同型號透析袋，通用性不好

根據(jù)目的蛋白的分子大小來選

擇透析袋的型號。

基于溶解度差異的分離純化技術(shù)等電點法利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低且各種蛋白質(zhì)等電點不同的特點進行分離的方法該法具有操作簡單，提取率高產(chǎn)率高等優(yōu)點，提取率有時可達80%以上不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點可能會發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時，必須注意調(diào)整pH值。為了沉淀目的蛋白，把溶液的pH調(diào)到目的蛋白的等電點即可溶劑法溶劑提取法包括水溶液提取法和有機溶劑提取法，其中緩沖溶液對蛋白質(zhì)的溶解度大、穩(wěn)定性好，最為常用;而乙醇、丁醇和丙酮等有機溶劑具有一定的親水性和較強的親脂性，主要用于一些脂質(zhì)結(jié)合較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶乙醇提取法溶解性能較好、溶出的水溶性雜質(zhì)少、可回收反復(fù)利用。丁醇在一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶提取中更加優(yōu)越，溶解脂的能力強，兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會引起酶的變性失活。缺點是對具有生物活性大分子易引起變性失活，操作要求在低溫下進行。

總體來說，蛋白質(zhì)的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。

雙水相萃取法它把兩種聚合物與一種鹽的水溶液混合在一起，由于聚合物與聚合物之間或聚合物與鹽之間的不溶性形成兩相與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相比，具有操作條件溫和、處理量大、易連續(xù)操作等優(yōu)點，同時克服了常規(guī)萃取有機溶劑對生物物質(zhì)的變性作用，在粗提過程中保持了生物物質(zhì)的活性及構(gòu)象等優(yōu)勢。該技術(shù)現(xiàn)已成功地應(yīng)用于分離蛋白質(zhì)、抗生素微生物離子、電泳分離氨基酸等采用雙水相系統(tǒng)濃縮目的蛋白，受聚合物分子量及濃度、溶液pH、離子強度、鹽類型及濃度的影響雙水相萃取技術(shù)是一種新型的分離技術(shù)反膠團萃取指膠團內(nèi)可溶解少量水而形成微型水池，利用膠團對外界有機溶劑的屏蔽作用，實現(xiàn)生物物質(zhì)的溶解和分離具有選擇性高、萃取過程簡單，正萃、反萃同時進行，能有效防止大分子失活、變性普通離子型表面活性劑可能對產(chǎn)品產(chǎn)生污染;常用的離子型表面活性劑容易造成蛋白質(zhì)的變性和失活，雖然活性損失較少其影響因素主要包括表面活性劑種類以及濃度、離子強度、助表面活性劑、水相pH和溫度等。反膠團萃取法還可提取蛋白質(zhì)、酶、核酸、氨基酸和多肽。

鹽溶法及鹽析法許多蛋白質(zhì)在純水或低鹽溶液中溶解度較低，若稍加一些無機鹽則溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶，而當鹽濃度繼續(xù)增加時，蛋白質(zhì)又會自動析出，該現(xiàn)象稱為鹽析。鹽溶和鹽析主要是通過影響蛋白質(zhì)分子表面的電荷而分離、純化蛋白質(zhì)鹽析法是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一，常用硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽。硫酸鈉具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、溶解度大等優(yōu)點，現(xiàn)在所指的鹽析法實際上多為硫酸銨鹽析法該法受蛋白質(zhì)濃度、離子強度、鹽的性質(zhì)、pH及溫度等因素影響上述兩種方法分離純化蛋白質(zhì)后，都要采用凝膠過濾或透析除鹽基于電荷不同的分離技術(shù)離子交換層析離子交換層析以纖維素或交聯(lián)葡聚糖凝膠等物質(zhì)的衍生物為載體，在某一pH條件下，這些載體帶有正電荷或負電荷，當待分離蛋白質(zhì)分子通過載體時，離子交換使蛋白質(zhì)分子分離純化機械強度大、柱效高、孔徑和顆粒大小易于控制，但應(yīng)用范圍窄不能進行快速淋洗，且分離時間長，易造成生物

分子的變性、失活離子交換層析是發(fā)展最早的層析技術(shù)之一，目前已成為蛋白質(zhì)分離純化最常用的手段電泳技術(shù)電泳技術(shù)作為分離純化蛋白質(zhì)的手段之一，可分為變性電泳、常規(guī)電泳、等電聚焦電泳和毛細管電泳。無論是單向凝膠電泳還是雙向凝膠電泳，分離度都是極高的。毛細管電泳中蛋白質(zhì)易被石英毛細管表面所吸附，且一次只能測一個試樣。

獲得分離的蛋白質(zhì)，均可用電洗脫或電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上直接進行序列分析基于對配體親和力差異的分離技術(shù)親和層析親和層析是一種以樣品的生物活性為依據(jù)的分離技術(shù)；當?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過層析柱時，其中可與親和載體配基相互作用的受體被吸附劑結(jié)合，不被吸附的無關(guān)成分則可隨流出液通過柱體，從而將吸附蛋白與其他蛋白質(zhì)分開，而后利用高濃度的底物溶液或親和力更強的底物衍生溶液洗脫目標蛋白，即可脫離層析柱上的載體只需要一步處理即可使某種待分離的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白

質(zhì)混合物中分離出來,達到千倍以上的純化,并保持較高的活性

如果目的蛋白作為藥品，處理后的產(chǎn)品中存在微量染料或金屬都會對機體造成損害

親和層析技術(shù)是基于蛋白質(zhì)可與另一種稱做配體的分子能發(fā)生特異的可逆結(jié)合

基于選擇性吸附差異的分離方法疏水層析利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合的特性進行分離。在高鹽溶液中，蛋白質(zhì)會與疏水配基相結(jié)合，其他的雜質(zhì)蛋白則無此種性質(zhì)，從而使蛋白質(zhì)初步分離與離子交換層析應(yīng)用互補，可以作用于分離離子交換很難或不能分離的物質(zhì)。該方法具有使蛋白質(zhì)變性、僅適合部分蛋白質(zhì)等缺點疏水作用層析多用于大分子蛋白質(zhì)的分離純化其他方法反相高效液相色譜法一種以疏水作用為基礎(chǔ)的色譜分離法具有分辨率高、重復(fù)性好、回收率高等優(yōu)點操作繁瑣、難放大、成本高，在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制

分子印跡一種識別聚合物特殊結(jié)合位點的技術(shù)，是將生物大分子從凝膠轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)的過程。制備容易，成本低廉，強穩(wěn)定性模板易流失隨著分離蛋白質(zhì)印跡聚合物的成功合成，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)已成為研究熱點高效毛細管電泳是20世紀80年代問世的一種高效液相分離技術(shù)，是經(jīng)典電泳技術(shù)與現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。目前，它已成為分析科學(xué)中最具活力的方法之一其分離效率高、分析速度快、樣品用量少、抗污染能力強和易自動化等特點儀器設(shè)備精密，成本高被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)以及高分子等多個領(lǐng)域柱層析通常采用固定床間歇操作方式柱層析具有很高的分離效率，且操作簡單但存在著載體利用率低和過程效率低的問題是蛋白質(zhì)產(chǎn)品分離純化的主流技術(shù)之一連續(xù)逆流操作層析基于液液分配機理，，可采用專門的逆流層析裝置。分離效率和產(chǎn)率均有提高操作量不大，過程慢對于難分離體系，逆流層析過程是一種有效分離手段第15頁/共33頁基于分子大小差異的分離技術(shù)第16頁/共33頁凝膠層析利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子大小差異分離混合物的方法。缺點：該法上樣量有限優(yōu)點：條件溫和、簡便、分離范圍廣、回收率高,對生化物質(zhì)的分離十分適宜特點：常用在純化的最后一步，與其他分離方法(如離子交換)組合使用第17頁/共33頁超濾原理：利用加壓膜分離技術(shù)，在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制薄膜，大分子溶質(zhì)滯留，從而使大分子物質(zhì)得到部分的純化超濾膜缺乏選擇性以及在超濾過程中易產(chǎn)生濃差極化與膜污染超濾技術(shù)作為一種典型的膜分離技術(shù)，則具有高效率、低能耗、無相變、無需添加任何化學(xué)試劑、操作簡便、條件溫和等諸多優(yōu)點特點：在超濾過程中，所用超濾膜的孔徑約為1～100nm，截留相對分子質(zhì)量(為3×105～1×106，能用于蛋白質(zhì)、細菌、膠體、病毒、熱原、多糖等的分離第18頁/共33頁透析透析是利用小分子經(jīng)過半透膜擴散到水(或緩沖液)的原理，將無機鹽等小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)，常和鹽析、鹽溶等方法聯(lián)合使用必須利用不同型號透析袋，通用性不好透析結(jié)果表明，大的蛋白質(zhì)分子和小的氨基酸分子得到初步分離。根據(jù)目的蛋白的分子大小來選擇透析袋的型號。第19頁/共33頁基于溶解度差異的分離純化技術(shù)第20頁/共33頁等電點法利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低且各種蛋白質(zhì)等電點不同的特點進行分離的方法該法具有操作簡單，提取率高產(chǎn)率高等優(yōu)點，提取率有時可達80%以上不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點可能會發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時，必須注意調(diào)整pH值。為了沉淀目的蛋白，把溶液的pH調(diào)到目的蛋白的等電點即可第21頁/共33頁溶劑法溶劑提取法包括水溶液提取法和有機溶劑提取法，其中緩沖溶液對蛋白質(zhì)的溶解度大、穩(wěn)定性好，最為常用;而乙醇、丁醇和丙酮等有機溶劑具有一定的親水性和較強的親脂性，主要用于一些脂質(zhì)結(jié)合較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶乙醇提取法溶解性能較好、溶出的水溶性雜質(zhì)少、可回收反復(fù)利用。丁醇在一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶提取中更加優(yōu)越，溶解脂的能力強，兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會引起酶的變性失活。缺點是對具有生物活性大分子易引起變性失活，操作要求在低溫下進行?？傮w來說，蛋白質(zhì)的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。第22頁/共33頁雙水相萃取法它把兩種聚合物與一種鹽的水溶液混合在一起，由于聚合物與聚合物之間或聚合物與鹽之間的不溶性形成兩相具有操作條件溫和、處理量大、易連續(xù)操作等優(yōu)點，同時克服了常規(guī)萃取有機溶劑對生物物質(zhì)的變性作用，在粗提過程中保持了生物物質(zhì)的活性及構(gòu)象等優(yōu)勢采用雙水相系統(tǒng)濃縮目的蛋白，受聚合物分子量及濃度、溶液pH、離子強度、鹽類型及濃度的影響雙水相萃取技術(shù)是一種新型的分離技術(shù)第23頁/共33頁反膠團萃取指膠團內(nèi)可溶解少量水而形成微型水池，利用膠團對外界有機溶劑的屏蔽作用，實現(xiàn)生物物質(zhì)的溶解和分離具有選擇性高、萃取過程簡單，正萃、反萃同時進行，能有效防止大分子失活、變性普通離子型表面活性劑可能對產(chǎn)品產(chǎn)生污染;常用的離子型表面活性劑容易造成蛋白質(zhì)的變性和失活，雖然活性損失較少反膠團萃取法還可提取蛋白質(zhì)、酶、核酸、氨基酸和多肽。第24頁/共33頁鹽溶法及鹽析法鹽溶和鹽析主要是通過影響蛋白質(zhì)分子表面的電荷而分離、純化蛋白質(zhì)硫酸鈉具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、溶解度大等優(yōu)點，現(xiàn)在所指的鹽析法實際上多為硫酸銨鹽析法該法受蛋白質(zhì)濃度、離子強度、鹽的性質(zhì)、pH及溫度等因素影響上述兩種方法分離純化蛋白質(zhì)后，都要采用凝膠過濾或透析除鹽第25頁/共33頁基于電荷不同的分離技術(shù)第26頁/共33頁離子交換層析在某一pH條件下，載體帶有正電荷或負電荷，當待分離蛋白質(zhì)分子通過載體時，離子交換使蛋白質(zhì)分子分離純化機械強度大、柱效高、孔徑和顆粒大小易于控制，但應(yīng)用范圍窄不能進行快速淋洗，且分離時間長，易造成生物分子的變性、失活離子交換層析是發(fā)展最早的層析技術(shù)之一，目前已成為蛋白質(zhì)分離純化最常用的手段第27頁/共33頁電泳技術(shù)電泳技術(shù)作為分離純化蛋白質(zhì)的手段之一，可分為變性電泳、常規(guī)電泳、等電聚焦電泳和毛細管電泳。無論是單向凝膠電泳還是雙向凝膠電泳，分離度都是極高的。毛細管電泳中蛋白質(zhì)易被石英毛細管表面所吸附，且一次只能測一個試樣。獲得分離的蛋白質(zhì)，均可用電洗脫或電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上直接進行序