功能化離子液體修飾豬胰脂肪酶的研究,生物化學(xué)論文

功能化離子液體修飾豬胰脂肪酶的研究,生物化學(xué)論文脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)主要是指一類能夠催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯的酶，廣泛應(yīng)用于水解或醇解、酯合成、酯交換、內(nèi)酯合成、多肽合成、高聚物合成及立體異構(gòu)體拆分等有機合成反響，是當前用處最廣泛的酶催化劑之一。豬胰脂肪酶(porcinepancreaslipase，PPL)是一類重要的脂肪酶，在食品、化裝品、醫(yī)藥、洗滌劑和畜牧業(yè)等領(lǐng)域中均有廣泛應(yīng)用。然而，PPL的應(yīng)用仍然存在一些缺乏，如一般具有實際應(yīng)用價值的目的化合物并不是它的天然底物;PPL活力不高，在有機溶劑、高溫、極端pH等非天然環(huán)境下極易失活等，這些不利因素限制了PPL在工業(yè)上進一步的廣泛應(yīng)用。因而，對PPL進行分子改性以強化其催化性能，為工業(yè)應(yīng)用提供活性更高層次、穩(wěn)定性更好、環(huán)境耐受性更強的新酶品種，具有重要的實際應(yīng)用價值?；瘜W(xué)修飾具有便宜、周期短、實驗室可行、容易創(chuàng)造新型的酶學(xué)性質(zhì)等優(yōu)點，是對脂肪酶進行分子改性的一種重要手段。固然化學(xué)修飾PPL已經(jīng)獲得了一定的研究進展，但仍然局限于脂肪酸、氨基酸、酸酐、聚乙二醇(PEG)和多糖等常用修飾劑的研究，修飾酶的催化活性、穩(wěn)定性、耐有機溶劑性等性能往往不能同時得到有效的改善以知足反響的需要。離子液體近年來在生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶、醇氰酶、氧化復(fù)原酶等多種酶都在離子液體中顯示出了很好的穩(wěn)定性。在離子液體中酶催化的區(qū)域、對映體選擇性往往都有所增加，尤其作為高極性底物的酶催化反響介質(zhì)，離子液體顯示出了宏大的潛力。筆者所在課題組將功能化離子液體作為酶固定化載體材料SBA-15的外表修飾劑，結(jié)果表示清楚修飾載體固定化的酶對溫度、pH等的穩(wěn)定性得到了有效提升，而且相對活力較游離酶有了較大提高。在固定化方式方法中，離子液體作為載體修飾劑。最近幾年，Bekhonche等初次提出了離子液體修飾酶的新型化學(xué)修飾方式方法，用含羥基的咪唑、吡咯等離子液體修飾甲酸脫氫酶，修飾酶的活性和穩(wěn)定性得到了顯著提升。這些研究講明離子液體不僅能夠作為反響介質(zhì)用于酶催化反響中，還能夠分別用作固定化載體及酶分子本身的修飾劑，當前還沒有其他用功能化離子液體修飾脂肪酶的報道。本文以PPL為例，希望發(fā)展一種酶分子改造的新方式方法。1材料與方式方法1.1藥品與試劑PPL購自Sigma公司并在0～4℃下保存，酶的蛋白質(zhì)含量為9.3%，以三乙酸甘油酯為底物時比酶活力為362U/g(45℃、pH7.5)。3種離子液體氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑(99%)、氯化1-羧甲基-3-乙基咪唑(99%)、氯化1-羧甲基-3-丁基咪唑(99%)購自上海成捷化學(xué)有限公司。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(98%)、N-羥基琥珀酰亞胺(98%)、嗎啉乙磺酸(97%)購自阿拉丁試劑公司。其余試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。1.2離子液體的活化取0.001mol的離子液體，參加0.0012mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺及0.1115molN-羥基琥珀酰亞胺，在5mL的嗎啉乙磺酸溶液中，室溫攪拌反響2h后停止。1.3活化的離子液體修飾PPL取2gPPL用去離子水溶解，向酶溶液中緩慢參加活化的離子液體，在0～4℃下，磁力攪拌6h后，在去離子水中透析24h備用。修飾度的測量通過三硝基苯磺酸法才測定。1.4蛋白質(zhì)含量測定根據(jù)Bradford的方式方法，以牛血清蛋白作為標準蛋白質(zhì)繪制標準曲線。測定酶液的吸光值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。1.5酶活的測定1)三乙酸甘油酯乳化液的制備將6.83g三乙酸甘油酯在強力攪動下緩慢參加磷酸緩沖液(pH7.0)，得到三乙酸甘油酯乳化液，再參加磷酸鹽緩沖液定容至100mL。2)酶活測定取10mL上述制備的三乙酸甘油酯乳化液于100mL錐形瓶中，再參加15mL磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，于50℃、150r/min下預(yù)熱5min，然后向華而不實參加酶開場反響。反響10min后取出，立即參加15mL乙醇終止反響。用0.025mol/L的NaOH溶液滴定，記錄NaOH的消耗量。在一定條件下，每分鐘酶催化三乙酸甘油酯生成1mol乙酸所需要的酶量，定義為一個酶活單位(U)。1.6最適溫度及最適pH的檢測1)最適溫度調(diào)節(jié)反響緩沖液pH為7.0，分別在30、35、40、45、50、55、60和65℃下水浴反響10min，取出測定酶活。2)最適pH調(diào)節(jié)反響液的pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，50℃下水浴反響10min，取出測定酶活。1.7酶的熱穩(wěn)定性將酶置于50℃水浴中保溫，分別在0、0.5、1、2、4、6和8h取出，冷卻至室溫，再測定酶活。酶活測定方式方法同1.5。設(shè)保溫0h時的游離酶的初始酶活為100%。1.8有機溶劑耐受性在酶活測定的反響體系中，參加不同濃度的有機溶劑，測定修飾前后PPL在有機溶劑中的催化穩(wěn)定性，設(shè)不含有機溶劑體系游離酶的初始酶活為100%。1.9紫外光譜測定室溫下，取一樣濃度的PPL、PPL-M、PPL-E和PPL-B在紫外可見分光光度計上分別測定其紫外可見吸收光譜，測定范圍為240～340nm。2結(jié)果與討論2.1水解活力的考察表1為經(jīng)修飾后的酶與PPL的表觀比酶活力的數(shù)據(jù)?！颈?】由表1可知:豬胰脂肪酶在經(jīng)過修飾之后，活力有明顯的提高，講明離子液體修飾脂肪酶的方式方法有利于水解活力的提高。華而不實離子液體修飾的酶，隨著修飾度的增加活力增大，含短鏈的修飾有更好的水解活力，是游離酶的1.74倍，而鄰苯二甲酸酐對PPL的修飾只提高了25%的水解活力。隨著修飾劑的鏈長的增大，活力呈降低的趨勢。2.2最適溫度的考察根據(jù)經(jīng)典酸堿滴定的方式方法，在不同溫度下考察酶水解三乙酸甘油酯特性，結(jié)果見圖1。由圖1可知:原酶最適反響溫度為45℃左右;經(jīng)離子液體修飾后，PPL的最適溫度向高溫方向移動至55℃。與PPL相比，修飾后的PPL對溫度的適應(yīng)范圍更廣?！緢D1】經(jīng)過修飾后的酶對在高溫區(qū)相對游離酶愈加趨于平緩，該點證明酶的離子液體修飾有助于提高溫度的耐受性。2.3最適pH的考察在不同pH條件下考察豬胰脂肪酶的三乙酸甘油酯水解特性，結(jié)果如此圖2所示。由圖2可知:修飾酶及游離酶的最適反響pH均為7.5，修飾的PPL在6.0～8.0之間對pH的敏感度明顯降低，離子液體的修飾拓寬了酶的使用范圍?！緢D2】2.4熱穩(wěn)定性的考察熱穩(wěn)定性是酶催化工業(yè)化應(yīng)用的一個重要因素。圖3為酶的熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果。由圖3可知:游離酶的熱穩(wěn)定性較差，酶活下降快。在保溫2h后，酶活僅為初始酶活的20%。PPL-M、PPL-E及PPL-B的熱穩(wěn)定性均顯著提高;在保溫8h后，殘存余留酶活仍然保持在游離酶初始酶活的60%以上，尤其是長鏈的離子液體修飾的酶，酶活降低的更緩慢，熱穩(wěn)定性更好。【圖3】2.5有機溶劑對酶活的影響2.5.1甲醇對酶活的影響在pH7.5、30℃不同甲醇體積分數(shù)的條件下，測定PPL、PPL-M、PPL-E及PPL-B的活力變化，結(jié)果見圖4。由圖4可知:反響體系中參加不同體積分數(shù)的甲醇時，游離酶的相對活力一直在降低。而3種修飾酶的活力則是先升高，在高濃度的含甲醇體系中會下降，這可能是修飾后的酶在低濃度的甲醇中仍能維持構(gòu)象穩(wěn)定，而高濃度的甲醇會毀壞部分氫鍵進而造成酶的解折疊。3種酶的變化趨勢比擬一致，且普遍高于PPL，3種修飾酶的活力大小順序(從大到小)為PPL-M、PPL-E、PPL-B，但PPL-B的活力在含低濃度的甲醇中增加幅度高于其他2種修飾酶，在含高濃度的甲醇中的活力降低程度要低于其余2種修飾酶?！緢D4】2.5.2N，N-二甲基甲酰胺(DMF)對酶活的影響在pH7.5、30℃不同DMF體積分數(shù)的條件下，測定PPL、PPL-M、PPL-E及PPL-B的活力變化，結(jié)果見圖5。由圖5可知:在反響體系中參加不同體積分數(shù)的DMF時，游離酶的活力一直在降低，而修飾酶均保持了較高的活力，在反響體系中存在80%的DMF時，3種修飾酶的活力仍然保持游離酶100%的相對活力以上。3種修飾酶在不同濃度的DMF的反響體系中，酶活變化趨勢一致，修飾酶的水解活性均高于原酶PPL。在含低濃度DMF中，PPL-M的酶活高于其他2種修飾酶，在DMF濃度不斷增加中，PPL-B的活力受影響程度最弱，在70%以上的DMF體積分數(shù)中活力下降比例低于其他2種修飾酶，PPL修飾后的耐DMF的性能明顯提高?！緢D5】2.6紫外光譜表征圖6為脂肪酶PPL、PPL-M、PPL-E及PPL-B的紫外光譜變化圖。由圖6可知:PPL經(jīng)離子液體修飾后，紫外吸收光譜峰型未發(fā)生明顯變化，講明修飾后對PPL的空間構(gòu)造沒有造成明顯的影響，但原270nm處的吸收峰發(fā)生稍微紅移，PPL-M、PPL-E及PPL-B的最大吸收波長值分別為271、272及275nm，修飾酶的紫外吸光值均有所提高。【圖6】3結(jié)論以3種陰離子的咪唑類離子液體對PPL進行化學(xué)修飾，修飾后的PPL水解活力明顯提升，修飾度越高，水解活力越高，且隨著修飾劑的鏈長的增大，活力呈降低的趨勢。與原酶相比，修飾酶的熱穩(wěn)定、有機溶劑中的催化性能等酶學(xué)性質(zhì)都得到了提高。以下為參考文獻:［1］HasanF，ShahAA，HameedA．Industrialapplicationsofmicrobiallipases［J］．EnzymeMicrobTechnol，2006，39(2):235-251．［2］YangJK，GuoDY，YanYJ．Cloningexpressionandc