大腸埃希菌耐藥因子傳遞實驗影響因素的探究

大腸埃希菌耐藥因子傳遞實驗影響因素的探究吳佳軒;高陽;鄭群【摘要】目的利用第二課堂實驗平臺，探究耐藥因子傳遞實驗的影響因素，摸索最佳接合條件，提高大腸埃希菌接合效率.方法通過耐鏈霉素大腸埃希菌和耐卡那霉素大腸埃希菌接合傳遞實驗，摸索最佳接合條件，包括接合時間、細菌濃度、供受體配比等結果時間因素對接合效率的影響很大,隨著時間的延長接合效率不斷提高，經(jīng)統(tǒng)計學分析90min為最佳時間.濃度因素也有影響，供受體2:5的配比優(yōu)于其他兩組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05).結論濃度和時間是最大的兩個影響因素，供受比2:5,時間90min為接合效率最高的條件.【期刊名稱】《繼續(xù)醫(yī)學教育》【年(卷)，期】2019(033)002【總頁數(shù)】2頁(P137-138)【關鍵詞】大腸埃希菌;耐藥因子;接合【作者】吳佳軒;高陽;鄭群【作者單位】首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，北京100069;首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，北京100069;首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學實驗教學中心，北京100069【正文語種】中文【中圖分類】G642抗生素的問世，為細菌感染性疾病提供了最有力的治療手段，但隨著抗菌藥物的大量出現(xiàn)和抗生素的濫用，耐藥菌株逐漸增多，細菌耐藥性甚至多重耐藥性愈發(fā)嚴重并引起人們的關注［1］。細菌耐藥性通常表現(xiàn)為交叉耐藥和多重耐藥兩種特性，細菌從單一耐藥發(fā)展為多重耐藥，是不同藥物分別作用或耐藥基因隨質粒等傳播的結果［2-3］。遺傳學研究揭示，細菌耐藥尤其多重耐藥性是由于一種染色體以外的遺傳因子一R質粒(resistanceplasmid)所致，這種耐藥性可以通過接合(conjugation)轉移給敏感菌株，使后者獲得耐藥性［4］。以大腸埃希菌為例，引起多重耐藥的一個重要原因是大腸埃希菌獲取外源性耐藥基因，其中最主要的一種方式是細菌接合，而接合性質粒作為一種可以獨立復制也可以移動的基因元件，在細菌接合中起到關鍵的作用［5］，因此細菌接合實驗對探究細菌多重耐藥性機制十分重要。本實驗室是基礎醫(yī)學教學實驗室，承擔病原生物學與免疫學的實驗教學任務，長期以來一直致力于拓寬思路，更好的培養(yǎng)學生的綜合能力與科研素質，利用第二課堂開辟實驗平臺，培養(yǎng)本科生的科學思維和科研能力。本研究小組將耐藥因子傳遞實驗進行更深層次的改良和探索，摸索最佳接合條件，包括接合時間、細菌濃度、供受體菌的不同配比等，通過對大腸埃希菌接合效率的影響因素探索，獲得更高的接合效率，更深刻地了解細菌的耐藥機制及耐藥基因的傳播機制。1材料與方法1.1材料1.1.1細菌?？箍敲顾氐拇竽c埃希菌為實驗供體菌，抗鏈霉素的大腸埃希菌為實驗受體菌，前者含有R質粒，供受體菌均購自中科院微生物研究所，保存于本實驗室-80°C冰箱內。常規(guī)復蘇細菌，傳代三次，取對數(shù)生長期的細菌進行測定，調整細菌濃度至0.8x109/ml備用。1.1.2培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：稱量普通瓊脂培養(yǎng)基干粉9.9g，瓊脂1.0g，并加入300ml蒸餾水，進行滅菌，待培養(yǎng)基60^左右，加入鏈霉素-卡那霉素混合液1.95ml（鏈霉素1.5ml，卡那霉素0.45ml，二者為2.5萬單位/ml），倒入平皿中，待冷卻后進行無菌試驗。普通肉湯管：稱量2g干粉肉湯培養(yǎng)基，加入100ml蒸餾水并混勻，然后微波爐高溫加熱，使其融化，立即分裝于5ml試管中，每試管2ml,滅菌，進行無菌試驗后存放于4°C冰箱備用。含卡那霉素固體培養(yǎng)基：制作方法同LB培養(yǎng)基，僅加入卡那霉素液（卡那霉素0.45ml,2.5萬單位/ml）。含鏈霉素固體培養(yǎng)基：制作方法同LB培養(yǎng)基，僅加入鏈霉素液（鏈霉素1.5ml,2.5萬單位/ml）。1.1.3儀器。生物安全柜（Escoclassbsc），高壓蒸汽滅菌鍋（MSL-3780），恒溫培養(yǎng)箱（Memmert500），分光光度儀，水浴箱，微波爐等。1.1.4抗生素與生化制劑?？敲顾兀?00萬單位/干粉，購自華北制藥股份有限公司），鏈霉素（50萬單位/注射液/2ml,購自江蘇東臺市制藥廠），普通瓊脂培養(yǎng)基干粉，營養(yǎng)瓊脂，干粉肉湯培養(yǎng)基，生理鹽水等。1.2方法1.2.1菌株初篩。取凍存于-80C冰箱的大腸埃希菌供體菌、大腸埃希菌受體菌，接種于普通肉湯管中復蘇，36C培養(yǎng)16-24小時，常規(guī)傳代三次，調整細菌濃度至0.8x109/ml。供體菌接種于含卡那霉素固體培養(yǎng)基，受體菌接種于含鏈霉素固體培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)16-24小時，分別挑選出單個生長旺盛的菌落接種于普通肉湯管，繼續(xù)傳代。1.2.2R因子接合傳遞實驗。供體菌與受體菌分別按體積量1:5、2:5、3:5共計3個比例混合，同時把每個配比設置6個時間點30min、45min、60min、90min、120min、24h于37C恒溫培養(yǎng)，進行接合傳遞實驗，在設定的時間點將對應配比混合液均勻涂在LB上，于37C恒溫箱中培養(yǎng)16-24小時，最后用無菌生理鹽水沖洗菌落于測量管中，利用分光光度計測量其OD值，實驗重復4次，結果取實驗平均值。2結果2.1供體菌與受體菌接合時間對傳遞實驗的影響如圖（圖1）所示，供體菌與受體菌三個不同濃度配比均隨接合時間的延長，接合效率越高，24小時重組菌達到高峰。對各時間點的實驗結果進行統(tǒng)計分析，結果表明，各組的60min和90min比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）,24h與120min比較，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01），其余各時間點比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），考慮到實驗教學過程中受學時限制，因此接合90min為最佳接合時間。2.2供體菌與受體菌濃度比例對傳遞實驗的影響如圖（圖1）所示，1:5、2:5、3:5三個不同的供體菌與受體菌濃度配比，在90min、120min、24h三個時間點的結果顯示，2:5的配比優(yōu)于其他兩組，經(jīng)組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而1:5、3:5兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明最佳的供受體菌濃度配比為2:5。圖1大腸埃希菌接合傳遞實驗結果3討論細菌接合是細菌間基因轉移和多重耐藥菌產(chǎn)生的一種重要方式，研究細菌接合能夠更深入的了解耐藥菌的產(chǎn)生機制［5］。本實驗主要是通過對耐鏈霉素大腸埃希菌和耐卡那霉素大腸埃希菌進行接合傳遞實驗，探究影響接合效率的因素。結果發(fā)現(xiàn)，時間因素對接合效率的影響很大，接合時間少于45min培養(yǎng)不出接合子，推測可能是由于時間過短，耐藥質粒無法完成從供體菌到受體菌的轉移，因此沒有接合子的形成。隨著接合時間的延長，接合效率不斷提高，24h時達到高峰，但此時間點的菌落生長過于旺盛，無法得到單一接合子菌落進行測量。推測可能是由于單耐藥菌在24h里繁殖過多，導致抗生素選擇能力下降。供體菌受體菌的濃度比例也對接合效率產(chǎn)生一定影響，發(fā)生接合的必要條件之一就是供體菌和受體菌間的接觸［6］，合適的濃度配比可以達到最佳的接合效率。供受比在2:5時，接合子最多，達到3:5時，接合效率反而下降，推測可能是由于供體菌的生長會對接合菌產(chǎn)生生存壓力而降低效率，具體機制有待進一步研究。綜上所述，對于耐鏈霉素和耐卡那霉素大腸埃希菌的接合實驗來說，濃度和時間是最大的兩個影響因素，供受比為2:5,時間為90min為最佳條件，實驗結果對于后續(xù)的細菌接合機制、耐藥因子傳遞機制、多重耐藥機制的研究可以提供一些基礎數(shù)據(jù)。本實驗研究是利用第二課堂項目由本科學生自主完成，第二課堂既是第一課堂的有效補充，也是提高學生綜合能力的有效途徑［7-8］。通過第二課堂實踐，讓醫(yī)學生參與科研訓練和科學實驗，有助于醫(yī)學生科學思維的培養(yǎng)、科研能力的提升、專業(yè)知識的拓寬，從而全面提高能力和素質。同時，本實驗研究對實驗課的教學效果也產(chǎn)生了影響，本研究可以作為設計性實驗在課堂教學中展開，整個實驗貫穿基本的科研設計，實驗結果清晰，對于教學效果的改善，學生們的理解都有很大的幫助。參考文獻【相關文獻】［1］朱陣，曹明澤，張吉麗，等.細菌耐藥性研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2015,42(12):33713376.［2］徐春泉，周翠，徐琦煜，等.大腸埃希菌毒力因子檢測及其與耐藥相關性研究［J］.疾病監(jiān)測，2010,25(7):542-545.［3］高璐琰，楊鐘，武瑞兵，等.細菌耐藥性研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2013,40(7):162-166.［4］李明遠，徐志凱.醫(yī)學微生物學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2015:51-54,62-64.ThomasCM.Paradigmsofplasmidorganization[J].MolecularMicrobiology,2000,37(3):485-491.翁夢薇，計徐，鄭衛(wèi)江，等