免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)

標識免疫技術(shù)醫(yī)學檢驗系臨床微生物學及免疫學教研室三月免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第1頁標識免疫技術(shù)=抗原抗體反應示蹤物標識靈敏性特異性標識免疫技術(shù)主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標識技術(shù)免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第2頁標識免疫技術(shù)免疫測定技術(shù)免疫組化技術(shù)示蹤物及標識技術(shù)放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)化學發(fā)光技術(shù)金免疫技術(shù)???免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第3頁第八章放射免疫技術(shù)

類型：放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）

廣義放射免疫技術(shù)還包含放射受體分析（使用受體測量抗原）和放射配體結(jié)合分析（使用配體研究受體）。特點:靈敏度高(10-9-10-15g/L)、特異性強、重復性好等免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第4頁標識物:慣用核素有兩大類γ射線：131I、125I、57Cr和60Coβ射線：14C、3H和32P。使用最廣泛是：125I①性質(zhì)活潑、易制備標識物②對被標識物免疫活性影響?、蹨y量方法簡便、已推廣④半衰期較長、核素豐度高免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第5頁標識方法125I標識原理：取代分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上氫原子方法：直接標識法

氯胺T法和乳過氧化物酶法間接標識法

聯(lián)接標識法免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第6頁適用分子原理特點缺點直接標識肽類、蛋白質(zhì)、酶存在酪氨酸、組胺殘基等基團操作簡便、易標識、比放射性高不適于活性功效區(qū)殘基標識間接標識甾類化合物、核苷酸等小分子化合物不存在酪氨酸、組胺殘基等基團,需添加可防止氧化／還原劑對被標識物活性損傷等添加基團可能影響被標識物活性免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第7頁標識物純化

對游離125I等試劑與標識物進行分離方法：分子篩凝膠過濾；離子交換層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）；高效液相色譜（HPLC）免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第8頁標識物判定放射化學純度

單位標識物中結(jié)合在被標識物上放射性占總放射性百分率。普通要求大于95％。免疫活性

標識過程中，被標識物活性損傷程度。B/T％>80％，B/T％↑抗原損傷↓。比放射性

單位化學量標識物中所含放射性強度.慣用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等單位表示。比放射性↑方法更靈敏；過高輻射自損傷大，對標識物免疫活性影響大，儲存穩(wěn)定性差。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第9頁抗血清判定多克隆抗體抗血清是放射免疫分析主要試劑之一，其質(zhì)量直接影響方法特異性和靈敏度。親協(xié)力選取親和常數(shù)K值大(109~1012L//mol)抗血清特異性其程度可直接影響結(jié)果準確性

滴度最大稀釋度。在本技術(shù)方法中是指結(jié)合50％標識抗原時抗血清稀釋度。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第10頁放射免疫分析（RIA）基本原理

采取定量標識抗原（Ag＋）和非標識抗原（Ag）競爭性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）反應。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第11頁免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第12頁免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第13頁以未結(jié)合Ag*為F，Ag*Ab復合物為B，則B/F與Ag量變存在著函數(shù)關(guān)系。B/F60(％)50403020

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0.81.62.43.24.04.85.6Ag(ng/ml)免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第14頁測定方法與步驟1.抗原抗體反應：平衡法或非平衡法2.分離結(jié)合與游離標識物沉淀劑沉淀復合物，離心分離。如第二抗體沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分離徹底，快速；分離試劑和過程不影響反應平衡；操作簡便，重復性好且經(jīng)濟。3.放射性測定及數(shù)據(jù)處理晶體閃爍計數(shù)儀(γ射線)或液體閃爍計數(shù)儀(β射線)繪制標準曲線，計算待檢抗原濃度。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第15頁免疫放射分析（IRMA）基本原理

單位點IRMA：利用過量標識抗體與待測抗原進行反應，形成抗原抗體復合物，反應平衡后，用固相抗原結(jié)合反應液中剩下未結(jié)合標識抗體并將其分離，測定上清液放射量。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第16頁免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第17頁雙位點IRMA先用固相抗體與抗原反應結(jié)合,然后再用過量標識抗體與已結(jié)合于固相抗原另一抗原決定簇結(jié)合,形成固相抗體-抗原-標識抗體復合物,洗棄反應液中剩下標識抗體,測定固相上放射性。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第18頁免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第19頁IRMA與RIA異同點

標識物

在RIA中核素標識抗原，抗原有不一樣種類，依據(jù)其化學結(jié)構(gòu)，標識時需用不一樣核素和不一樣方法。在IRMA中核素標識抗體。抗體為蛋白質(zhì)，有利于碘化標識，不一樣抗體標識方法基本相同。標識抗體比活度高，提升了分析靈敏度。反應速率反應速度與反應物濃度呈正比，在IRMA中標識抗體是過量，而且不存在競爭性結(jié)合復雜反應，所以反應速度較RIA快。在RIA中抗體量是微量，所以一定要用高親和力多克隆抗體，而在IRMA中應用親和力較低單克隆體也能得到滿意結(jié)果。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第20頁反應原理

RIA為競爭抑制，測得放射性量與受檢抗原呈反比。IRMA為非競爭結(jié)合，劑量反應曲線為正相關(guān)直線關(guān)系。特異性

在雙位點IRMA中，普通均應用針對不一樣位點單克隆抗體，其交叉反應率低于應用多克隆抗體RIA。檢測范圍

通常RIA工作范圍為2-3個數(shù)量級，而RIMA可達3個數(shù)量級以上。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第21頁分析誤差RIA中加入抗體和標識抗原都是定量，加樣誤差可嚴重影響測定結(jié)果。IRMA中標識和固相抗體在反應中都是過量，只有受檢標本加樣誤差才會影響分析結(jié)果。所以，IRMA批內(nèi)和批間變異均比較小。其它RIA能夠測定大分子量與小分子量物質(zhì)，雙位點IRMA只能測定在分子上含有2個以上抗原表位物質(zhì)。在RIA中應用為多克隆抗體，親和力和特異性要求較高，但用量極少。IRMA中標識抗體和固相抗體用量較多，普通均用起源豐富、特異性較高單克隆抗體。

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第22頁放射免疫技術(shù)應用慣用于各種激素、微量蛋白、腫瘤標志物和藥品等微量物質(zhì)測定。問題：放射性污染、慣用核素半衰期短、試劑盒穩(wěn)定時不長不易自動化儀器分析等。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第23頁第九章免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(immunofluorescencetechnique)是標識免疫技術(shù)中發(fā)展最早一個。

是將抗原抗體反應特異性與熒光物質(zhì)檢測敏感性和直觀性結(jié)合起來一個方法。

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第24頁基本原理利用熒光素標識抗體，使之在涂片上或組織切片上與標本中待檢抗原特異結(jié)合，采取高發(fā)光效率點光源，透過濾色板發(fā)出一定波長光，使結(jié)合在標本上熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來判斷有沒有待檢抗原或抗體。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第25頁第一節(jié)熒光基本知識免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第26頁異硫氰酸熒光素（FITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，分子量為389.4，最大吸收光波長為490-495nm，最大發(fā)射光波長520-530nm，展現(xiàn)明亮黃綠色熒光，是應用最廣泛熒光素。主要優(yōu)點：①人眼對黃綠色較為敏感；②通常切片標本中綠色熒光少于紅色，降低背景干擾

。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第27頁免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第28頁四乙基羅丹明（RB200）

為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長久保留。最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595－600nm，呈橘紅色熒光。慣用于雙重標識或?qū)Ρ热旧?/p>

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第29頁四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）

最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第30頁

熒光分子輻射能力在受到激發(fā)光較長時間照射后會減弱甚至猝滅，一些化合物對熒光有猝滅作用，所以熒光物質(zhì)保留應注意防止光（尤其是紫外光）直接照射和與其它化合物接觸。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第31頁熒光抗體制備作為標識熒光素應符合以下要求：

①應含有能與蛋白質(zhì)分子形成共價健化學基團，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合色素及其降解產(chǎn)物易于去除。②熒光效率高,與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高熒光效率。③熒光色澤與背景組織色澤對比鮮明。④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有生化與免疫性質(zhì)，與蛋白質(zhì)結(jié)合物穩(wěn)定，易于保留。

⑤標識方法簡單、安全無毒。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第32頁熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學方式共價結(jié)合而成。

標識方法：攪拌法(適合大樣品)透析法(適合小樣品)標識抗體純化：透析法層析分離法

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第33頁熒光抗體判定F/P比率：將制備熒光抗體稀釋至A280≈1.0，分別測讀A280（蛋白質(zhì)特異吸收峰）和標識熒光素特異吸收峰免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第34頁F/P值越高，說明抗體分子上結(jié)合熒光素越多，反之則越少。普通用于固定標本熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用于活細胞染色以F/P＝2.4為宜。

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第35頁抗體效價：效價越大標識抗體特異性越高非特異熒光越少。效價在1:16-1:32者較為理想抗體特異性：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉淀線或沉淀峰，在紫外線照射下發(fā)出強烈熒光免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第36頁第二節(jié)免疫熒光顯微技術(shù)基本原理：使熒光抗體與標本切片中組織或細胞表面抗原進行反應，洗滌除去游離熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮特異熒光。

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第37頁直接法

熒光抗體染色免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第38頁直接法優(yōu)點：操作簡便、特異性高、非特異熒光染色原因少，缺點：靈敏度偏低，每檢驗一個抗原需制備對應特異熒光抗體免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第39頁間接法

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第40頁間接法優(yōu)點：靈敏度高，在不一樣抗原檢測中只需應用一個熒光抗體。既可檢測抗原，也可檢測抗體。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第41頁免疫熒光技術(shù)在醫(yī)學檢驗中應用在細菌學檢驗中主要用于菌種判定。免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體檢測是梅毒特異性診療慣用方法之一。用熒光抗體染色法可檢出病毒及其繁殖情況。在寄生蟲感染診療中，間接免疫熒光試驗（IFAT）是當前公認最有效檢測瘧疾抗體方法。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第42頁免疫熒光法還是檢測本身抗體好工具，在本身免疫病試驗診療中應用廣泛。其突出優(yōu)點是能以簡單方法同時檢測抗體和與抗體起特異反應組織成份，并能在同一組織中同時檢驗抗不一樣組織成份抗體。熒光抗體技術(shù)一個特殊應用是流式細胞分析（flowcytometry）?？捎糜跈z測細胞大小、折散率、粘滯度等，更慣用于T細胞亞群等檢測。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第43頁第十章酶免疫技術(shù)

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第44頁第一節(jié)酶免疫技術(shù)概述基本原理利用酶催化底物反應生物放大作用,提升特異性抗原-抗體免疫學反應檢測敏感性一個標識免疫技術(shù)。

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第45頁基本特點：①標識后保留酶和抗原(抗體)活性②酶促反應專一性，確保特異性③底物反應放大作用，提升敏感性④酶標試劑保留穩(wěn)定⑤操作簡便，安全易行免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第46頁主要試劑制備與要求免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第47頁一、酶與酶作用底物（一）用于標識酶要求：酶活性高標識后酶活性穩(wěn)定，且不影響標識抗原與抗體免疫反應性酶催化底物后信號易判定或測定酶活性不受樣品中其它成份影響酶、輔助因子及底物理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全無害，價廉免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第48頁（二）慣用酶及其底物1.辣根過氧化物酶（HRP）慣用底物：鄰苯二胺（OPD）：反應顯橙黃色，應避光，致癌性四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：反應后呈藍色，無需避光，無致癌性，但水溶性差。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第49頁免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第50頁2.堿性磷酸酶（AP）

慣用底物為對硝基苯磷酸酯（p-NPP），產(chǎn)物為黃色。

*AP靈敏性高與HRP，但不易取得純品，穩(wěn)定性及酶標識物收率低于HRP，且價高，故應用不如HRP普及。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第51頁二、酶標識抗體或抗原基本要求：酶標識抗原純度要高，抗原性完整；抗體特異性好，效價高，親和力強，比活性高以及易于批量生產(chǎn)和分離純化免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第52頁酶標識方法

1.交聯(lián)法以雙功效交聯(lián)劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結(jié)合物。如戊二醛交聯(lián)法。2.直接法

用過碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體（抗原）結(jié)合。僅適合用于含糖蛋白分子酶（如HRP）標識物制備。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第53頁三、固相載體基本要求結(jié)合容量高，結(jié)合穩(wěn)定；可與抗原抗體復合物等大分子蛋白結(jié)合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡便易行、快捷經(jīng)濟。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第54頁固相載體種類與選擇1.塑料制品材料經(jīng)濟，操作簡便，易于自動化，最慣用。2.微顆粒結(jié)合容量大，反應快速，逐步普遍用于自動化分析。3.膜載體硝酸纖維素膜（NC）、尼龍膜等微孔濾膜，廣泛應用于定性或半定量斑點ELISA。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第55頁四、免疫吸附劑原理：非共價鍵吸附或共價鍵化學偶聯(lián)（包被）。普通采取偏堿性（pH9.6）碳酸鹽溶液（ELISA板）。封閉：1％－5％牛血清白蛋白或5％－20％小牛血清。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第56頁酶免疫技術(shù)分類

酶免疫組化用于檢測組織切片或細胞涂片中抗原和抗體

酶免疫技術(shù)均相酶免疫測定酶免疫測定固相酶免疫測定異相酶免疫測定（ELISA）液相酶免疫測定免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第57頁均相酶免疫測定Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E基本原理：利用酶標抗體結(jié)合抗原形成復合物后，標識酶活性發(fā)生改變原理，在不將復合物與游離酶標抗體分離情況下，直接測定系統(tǒng)中總標識酶活性改變，進而推算出待檢樣品中抗原量。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第58頁異相酶免疫測定（enzymeimmunoassay,EIA）基本原理：在抗原抗體反應后，先將抗原抗體復合物與游離酶標抗體分離，再測定酶標識復合物催化底物顯色活性，最終推算出樣品中抗原含量。液相EIA：分離劑分離游離和結(jié)合標識物。固相EIA：固相載體結(jié)合酶標復合物，經(jīng)洗滌去除游離酶標抗體。如ELISA。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第59頁

第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第60頁基本原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性在測定時，把受檢標本（測定其中抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不一樣步驟與固相載體表面抗原或抗體起反應免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第61頁用洗滌方法使固相載體上形成抗原抗體復合物與其它物質(zhì)分開，最終結(jié)合在固相載體上酶量與標本中受檢物質(zhì)量成一定百分比。加入酶反應底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物量與標本中受檢物質(zhì)量直接相關(guān)，故可依據(jù)顏色反應深淺進行定性或定量分析免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第62頁ELISA技術(shù)類型：

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，在這種測定方法中有3種必要試劑：固相抗原或抗體，酶標識抗原或抗體，酶作用底物。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第63頁免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第64頁1．雙抗體夾心法

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第65頁免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第66頁特點：非競爭結(jié)合反應慣用于抗原檢測適合用于分子中含有最少兩個抗原決定簇多價抗原，而不能用于小分子半抗原檢測所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子不一樣抗原決定簇

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第67頁2．間接法

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第68頁免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第69頁3.競爭法

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第70頁特點：用于抗原和半抗原定量測定，也可反抗體進行測定。酶標Ag（Ab）與樣品或標準品中非標識Ag（Ab）含有相同與固相Ab(Ag)結(jié)合能力。反應體系中，固相Ab（Ag）和酶標Ag（Ab）是固定限量，且前者結(jié)合位點少于酶標識與非標識Ag（Ab）分子數(shù)量和。反應后，結(jié)合與固相載體上復合物中被測定酶標Ag（Ab）量（酶活性）與樣品中非標識Ag（Ab）濃度成反比。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第71頁4.捕捉法（反向間接法）

主要用于血清中某種抗體亞型成份（如IgM）測定。基本原理：

固相抗IgM待檢標本(IgM)抗原(與特異抗體結(jié)合)酶標抗體底物免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第72頁

第三節(jié)膜載體酶免疫測定固相膜免疫測定與ELISA相類似,其特點是以微孔膜作為固相.標識物可用酶和各種有色微粒子,如彩色乳膠、膠體金等。慣用固相膜為硝酸纖維素膜。類型：免疫滲濾試驗：穿流形式免疫層析試驗：橫流形式斑點酶免疫吸附試驗（dot-ELISA）免疫印跡法(Westernblot)免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第73頁免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT）亦被稱為Westernblot分三個階段進行:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）電轉(zhuǎn)移酶免疫定位

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第74頁SDS抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）

免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第75頁免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第76頁電轉(zhuǎn)移將在凝膠中已經(jīng)分離條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選取低電壓（100V）和大電流（1-2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此分階段分離蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第77頁酶免疫定位將印有蛋白質(zhì)條帶硝酸纖維素膜（相當于包被了抗原固相載體）依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物酶反應底物，使區(qū)帶染色。陽性反應條帶清楚可辨，并可依據(jù)SDA加入分子量標準，確定各組分分子量。免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第78頁免疫學及免疫學檢驗標記技術(shù)第79頁免疫學及免疫