熒光探針和分子傳感器

熒光探針和分子傳感器第一頁，共六十五頁，2022年，8月28日200507051郭祥群博士，博士生導(dǎo)師全國高?；瘜W(xué)教育研究中心第四屆學(xué)術(shù)委員會副主任，教育部高等學(xué)校本科教學(xué)工作水平評估專家，中國化學(xué)會理事先后獲得國家級獎2項，省部級獎4項，發(fā)表科研與教學(xué)研究論文100余篇。研究興趣：熒光光譜分析的原理與技術(shù)，在研項目涉及生物活性自由基的熒光表征，海洋污染生物監(jiān)測技術(shù)研究，食品安全等。聯(lián)系方式L),2187288(O),2182355(H)第二頁，共六十五頁，2022年，8月28日200507052FluorescentProbesIntroductionFluorescentSensor

熒光傳感FluorescentTracer熒光示蹤

FRET

共振能量轉(zhuǎn)移熒光Application

1.Radicalprobes2.Ionprobes3.NIRFFluorescenceimage4.DNAsequence5.Proteinprobes6.DNAprobes7.Membraneprobes8.pHprobes第三頁，共六十五頁，2022年，8月28日200507053ThankyouThankyou

第四頁，共六十五頁，2022年，8月28日200507054FluorescenceresearchKeyword:Fluorescen*Period:Jan/2005-Jun/2005Database:

美國化學(xué)會(ACS)數(shù)據(jù)庫3566篇WPS電子期刊全文數(shù)據(jù)庫206篇SDOS全文數(shù)據(jù)庫（上交鏡像）1890篇英國皇家化學(xué)會（RSC)數(shù)據(jù)庫120篇研究與應(yīng)用領(lǐng)域涉及：生命環(huán)境材料等講座要求了解：熒光探針表征應(yīng)用研究意義第五頁，共六十五頁，2022年，8月28日200507055MolecularProbeMolecularreporterFromJ.Fluorescence第六頁，共六十五頁，2022年，8月28日200507056Molecularprobes第七頁，共六十五頁，2022年，8月28日200507057JablonskidiagramT1hAhAAbsorption10-15sVibrational

relax,VR,10-1210-14sInternalconversion,IC,10-1110-13sIntersystemcrossing,ISC,10-210-6sFluorescencePhosphorescenceICISCS0S1S2321010-8s10-3100shFhPHOMOLUMO第八頁，共六十五頁，2022年，8月28日200507058CharacteristicsofFluorophoreExcitationwavelength激發(fā)波長

exEmissionwavelength發(fā)射波長

emExtinction(absorption)coefficient吸光系數(shù)Stoke’sshiftFluorescencelifetime熒光壽命Fluorescencequantumyield熒光量子產(chǎn)率

FluorescenceAnisotropy各項異性rFluorescencePolarization熒光偏振p第九頁，共六十五頁，2022年，8月28日200507059Excitationandemissionspectra1ExcitationspectrumEmissionspectraFemFexemex第十頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070510Fluorescencelifetimerelaxation(10-12s)S0S1S1hvAhvFknrSimplifiedJablonskidiagram

:EmissionrateKnr:nonradiativedecayrateDefinitionAveragelifetime:theaveragetimethemoleculespendsintheexcitedstatepriortoreturntothegroundstate.Expression第十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070511FluorescenceQuantumYieldDefinition

ThefluorescencequantumyieldistheratioofthenumberofphotonsemittedtothenumberabsorbedExpression

第十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070512Sensor(1)+SRTS信號單元，R識別單元，T靶分子hvhvhv自由基傳感Z.-Y.Bian,X.-Q.Guo*,AnalyticalScience,21553-559,2005第十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070513Sensor(2)DDhue

-hvhvhvPETPhotoinducedElectronTransferhvHg2+E.M.Nolan,etal.,J.Am.Chem.Soc.,2003,125:14270-14271SRT第十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070514Sensor(3)RShvhvFRETFD,exD,emA,exA,emFD,exD,emA,exA,emT+hvhv’FluorescenceResonanceEnergyTransfer第十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070515ProbingDNAMolecularbeacons分子信標(biāo)ADQFTargetDNAssDNAbindingproteinDenaturingreagentQFFQ第十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070516Sensor(4)+S-RThvhvAl3+hv第十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070517Sensor(5)+S-RT+競爭型+S-RT催化劑中間體+hvhv催化型第十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070518TheFusionofIntegalMembraneProtein熒光素標(biāo)記鼠蛋白質(zhì)羅丹明標(biāo)記人蛋白質(zhì)鼠細胞人細胞37°C15°C融合異核體FromInstantnotes,Biochemistry,E2Tracer膜內(nèi)蛋白側(cè)向運動第十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070519CelltracerA30μm–thicksectionofazebrafishembryostainedwithCellTrackerCM-DiI(C7000,C7001)priortoimmunohistochemicalanalysis.Aone-day-oldzebrafishembryowasimmobilizedandimpaledinthehindbrainwithamicroelectrodefilledwith1mg/mLCellTrackerCM-DiIin95%ethanol.Onedaylater,thebrainwasfixed,embedded,frozeninliquidnitrogenandsectionedonacryostat.Afterblockingwith0.1%TritonX-100inPBScontaining2%BSAand2%normalgoatserum,the30μm–thicksectionwasincubatedwithprimaryanti-glialantibodyinconjunctionwithfluoresceingoatanti–mouseIgGantibody.Thissectionwasthenviewedsequentiallythroughopticalfiltersetsappropriateforrhodamineandfluorescein,andtheresultingimagesweresuperimposed.TheimagewascontributedbyWilliamTrevarrow,BeckmanInstitute,CaliforniaInstituteofTechnology.C7000C68H105Cl2N3O熒光染色的斑馬魚胚胎第二十頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070520TracerAgF-AgAb抗體在免疫反應(yīng)前后熒光探針自身的熒光量子產(chǎn)率不發(fā)生變化的情況測反應(yīng)剩余的標(biāo)記抗原，熒光正比抗原量測固相熒光，熒光反比抗原量測固相洗脫，熒光反比抗原量F標(biāo)記抗原待測抗原?—F?—F熒光分子F????—F?—F?第二十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070521FRET

FluorescenceResonanceEnergyTransfer第二十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070522PrincipleofFRETRateofenergytransferDquantumyieldofDDlifetimeofDr

distancebetweenAandDnrefrcativeindexNAvogadro’snumberk

orientationfactorJ

overlapintegral

FD,exD,emA,exA,em第二十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070523Orientationfactork=2/3randomizebyrotationaldiffusionpriortoenergytransfer第二十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070524FRETsensordesignbasedondonorandacceptordistancechangesK.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413第二十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070525FRETprobingcAMPK.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413cAMPcyclicadenosinemonophosphate環(huán)腺苷酸環(huán)腺苷酸依賴蛋白激酶支架結(jié)構(gòu)四聚體表征cAMP第二十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070526FRETprobingPDE磷酸二酯酶BeforehydrolysisAfterhydrolysisK.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413BeforeAfter香豆素phosphodiesterasehvhvhv第二十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070527EmissionspectraPDE第二十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070528FRETsensordesignbasedonmodulationofspectraloverlapFD,exD,emA,exA,emFD,exD,emA,exA,em有利于能量轉(zhuǎn)移不利于能量轉(zhuǎn)移第二十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070529Probingphosphatase磷酸酶LFabsQFabsDonorEmiLF(內(nèi)酯）QF(醌型）K.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413PTP蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶香豆素?zé)晒馑氐谌?，共六十五頁?022年，8月28日2005070530生物活性自由基研究的重要性?OHO2-?RO?ROO?NO活性氧自由基其他R?GS?為維持生命所必須過量產(chǎn)生會導(dǎo)致生物大分子損傷生命過程中所產(chǎn)生的自由基，是行使生理功能及介導(dǎo)其生化反應(yīng)所必需的。如在線粒體呼吸鏈上電子傳遞過程中產(chǎn)生的自由基在線粒體能量代謝中起著重要的作用。第三十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070531?OH抽氫導(dǎo)致DNA斷裂第三十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070532硫中心自由基引起細胞損傷第三十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070533順磁標(biāo)記熒光探針-ProbingfreeradicalParamagnetic(Lowfluorescence)Diamagnetic(Highfluorescence)產(chǎn)物抗磁性，穩(wěn)定自由基之間的反應(yīng)快速多功能探針：ESR；熒光（強度、偏振、壽命等）熒光顯微技術(shù)應(yīng)用于細胞、組織的自由基作用研究第三十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070534比率型熒光分子-ProbingNOSoh,N.etal.,Chem.Commun.,2002,2250-2251NO?FRETex=360nmem=470nmem=410nmex=360nm熒胺香豆素第三十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070535?OH比率型熒光探針-Probing?OHSoh,N.etal.,Chem.Commun.,2004,496-497以與自由基作用的特征靶分子或官能團作為識別基團熒光素羅丹明脫氧胸腺嘧啶核苷二聚體第三十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070536Ca2+indicatorFura-2Fura-Ca2+Fura鈣具有使原生質(zhì)膠體穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)細胞膜的結(jié)構(gòu)和通透性的作用。對各種細胞的興奮性具有正負效應(yīng)。ExcitationEmission第三十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070537Ca2+indicatorIndo-1Indo-1-Ca2+第三十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070538ICTprinciple第三十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070539ImageofFura-2-Ca2+False-colorimage（假色成像）offreeCa2+concentrationinaPurkinjeneuron（梨狀神經(jīng)元）fromembryonicmousecerebellum（胚鼠小腦）Thecompositeimage,whichrepresentstheratioofimagesobtainedwithexcitationat340nmand380nm,revealsthemobilizationofinternalCa2+storeswithoutcontributionfromCa2+influx.Fura-2-Ca2+胚鼠小腦梨狀神經(jīng)元中游離Ca2+濃度熒光成像第四十頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070540ImageofspiralCa2+waveFluo-3(F1240)confocalimageofaspiralCa2+waveinitiatedbyinjectionofanonhydrolyzableanalogofinositol1,4,5-triphosphate（肌醇三磷酸非水解模擬物）inaXenopuslaevisoocyte（瓜蟾卵母細胞）.TheimagewascontributedbyDavidClapham,HarvardUniversity,andreproducedwithpermissionfromCell69,283(1992).瓜蟾卵母細胞中螺旋Ca2+波共焦熒光成像Fluo-3第四十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070541Na+indicatorSBFISBFISBFI-Na+海馬切片CA1錐形神經(jīng)元Na+成像第四十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070542Cd2+indicatorFluorescenceemissionspectraofamixtureof1μMBTC-5N(B-6845)and1μMTCPPinsolutionscontainingzeroto1.0μMCd2+.BTC-5N,tetrapotassiumsalt第四十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070543Zn2+indicatorAPTRA-BTC,tripotassiumsaltFluorescenceexcitationspectraofAPTRA-BTC(A-6895)insolutionscontainingzeroto25μMZn2+.第四十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070544pHindicator5-sulfofluoresceindiacetate,sodiumsalt(SFDA)第四十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070545DNA-basedpHsensorTatsuoOhmishietal.,Biochemistry2005,447125-7130第四十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070546TatsuoOhmishietal.,Biochemistry2005,447125-7130DNA-basedpHindicator表征MCF-7乳腺癌細胞編程性死亡過程ApoptosisMCF-7乳腺癌細胞第四十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070547熒光成像通過靜脈注射或腹腔注射到生物體內(nèi)的近紅外熒光探針吸著并聚集于腫瘤等組織中，腫瘤中存在特異的細胞、蛋白質(zhì)、酶等，這些物質(zhì)可與熒光探針結(jié)合或反應(yīng)而發(fā)出熒光，可根據(jù)熒光的位置、強度得知腫瘤的位置、大小，是否轉(zhuǎn)移、擴散及腫瘤的陰性、陽性等一系列信息.第四十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070548近紅外成像為什么選擇近紅外？第四十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070549GFP綠色熒光蛋白Endostatin內(nèi)生抑制素Cy5.5花菁熒光染料NIR1,NIR2,GFP不同濾光片CY5.5標(biāo)記的內(nèi)生抑制素特異識別腫瘤第五十頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070550第五十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070551第五十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070552Self-quenchingprobeRalphWissleder,et.al.NatureAmerica1999,17:375-378酶活化酶作用位點C-PGC腫瘤伴生溶酶體蛋白酶特異識別自猝滅熒光探針（或細胞成像）多甲氧基聚乙烯乙二醇-聚賴氨酸-cy5.5(C-PGC),第五十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070553第五十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070554Phasecontrastimage相差成像NIRFimage腫瘤細胞成像NIRFNIRFLysosomalcompartment溶酶體分隔第五十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070555NIRFimage第五十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070556Template3’CCGGTAGCAACT5’Primer5‘GG3’GGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGGGCCATCGTTGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTdATPdCTPdGTPdTTPddATPdATPdCTPdGTPdTTPddCTPdATPdCTPdGTPdTTPddGTPdATPdCTPdGTPdTTPddTTPF1--AF2--CF3--GF4--TDNApolymerasedATP脫氧腺苷dCTP脫氧胞苷dGTP脫氧鳥苷dTTP脫氧胸苷ddATP雙脫氧腺苷ddCTP雙脫氧胞苷ddGTP雙脫氧鳥苷ddTTP雙脫氧胸苷FDNAsequence第五十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070557近紅外成像熒光探針七次甲基花菁素類(圖2，a)第五十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070558Proteinprobes蛋白質(zhì)熒光探針RG對牛血清白蛋白（BSA）的響應(yīng)圖第五十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070559DNAprobeAbsorptionandfluorescenceemissionspectraofethidiumbromdeboundtoDNAEthidiumbromide溴化乙錠第六十頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070560DNAprobeHoechst33258(bis-benzimide)AbsorptionandfluorescenceemissionspectraofHoechst33258boundtoDNA.第六十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日2005070561Normalandcamptothecin-treatedbovinepulmonaryarteryendothelialcells(BPAEC)werestainedwithC4-BODIPY500/510C9(B-3824andHoechst33258(H-1398,H-3569).BODIPYandHoechstfluorescencewererecordedusinglongpassfiltersappropriateforfluoresceinandDAPI,respectively.AnoverlayoftheimagesindicatesthataredshiftinBODIPYfluorescenceissignificantinnormalcells(leftpanel)comparedtothatinapoptoticcells(rightpanel,asindicatedbythefragmentednu