高效液相色譜法 PPT

關(guān)于高效液相色譜法PPT第1頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日216-1高效液相色譜法的特點1.

特點：高壓、高效、高速、自動化與氣相色譜比較：適合于分子量大、高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣，離子型化合物和高聚物的分離分析。液體流動相參與分離過程，選擇性高。固定相類型多，分析選擇余地大。較低的柱溫，有利于色譜分離。液體擴散性小，縱向擴散可忽略。試樣易于制備及回收。儀器復(fù)雜昂貴。第2頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日液相色譜高柱效的原因:以特殊方法用小粒徑的填料（3～5um球形）制備色譜柱H=He+Hd+Hm+Hs+Hsm=A+B/u+Cmu+Csu+Csmu

由于溶質(zhì)分子在溶劑中的擴散系數(shù)很小，縱向擴散可以忽略。因此B項可以略去。H=A+（Cm+Cs+Csm）uA=2λdp

2.液相色譜中速率理論0.01k＇2(1+k＇)2

Cm=×dp2

Dm

第3頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日416-2高效液相色譜儀

流程及主要部件

流程組成系統(tǒng)：高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測和記錄系統(tǒng)第4頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日516-2-1高壓輸液系統(tǒng)

（1）高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性第5頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日6(2)梯度淋洗裝置內(nèi)梯度:利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。外梯度:

一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。梯度淋洗：在分離過程中使用兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們的比例，使流動相的強度、極性、pH或離子強度相應(yīng)地變化，以提高分離效果，縮短分析時間的目的。第6頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日716-2-2進樣系統(tǒng)

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：第7頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日816-2-3分離系統(tǒng)

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。第8頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日916-2-4檢測器

a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。特點：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；

對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

第9頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日10b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，可檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖。第10頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日11c.示差折光檢測器

（differentialrefractiveindexdetector）

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對溫度、流速敏感、不能用于梯度洗脫；

第11頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日12d.熒光檢測器

（fluorescencedetector）高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；第12頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日13高效液相色譜檢測器UV熒光示差折光蒸發(fā)光散射信號吸光度熒光強度折光率散射光強流速影響無無無無溫度影響小小大小檢測限(g/ml)10-1010-1310-710-9梯度洗脫適宜適宜不宜適宜細管徑柱難難難適宜樣品破壞無無無無通用型否否是是第13頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日14高效液相色譜的固定相和流動相（－）固定相

高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。

第14頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日151.表面多孔型固定相基體是實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。

這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達平衡，較適合做常規(guī)快速分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。2．全多孔型固定相

由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相.

這類固定相由于顆粒很細（5～10μm），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速分析。柱容量大，最大允許樣品量是表面多孔型的5倍，特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析.第15頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日16（二）流動相

流動相對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：（1）溶劑對待測樣品須具有合適的極性和較好的選擇性。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)

溶劑強度指溶劑將組分從色譜柱上洗脫下來的能力。溶劑強度與溶劑的極性有關(guān)。正向色譜中溶劑極性越大溶劑強度越大。反相色譜反之。

第16頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日17（2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達最高靈敏度。（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50～1OOnm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。避免與樣品或固定相發(fā)生反應(yīng)或聚合。（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。（6）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，若試樣組分的分配比K’值范圍很廣，則采用梯度洗脫。第17頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日18一、液-固吸附色譜二、液-液分配色譜三、化學(xué)鍵合相色譜四、離子交換色譜五、排阻色譜六、親和色譜(AC)主要分離類型與原理第18頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日1916-3液-固吸附色譜

liquid-solidadsorption

chromatography

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有不同官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；第19頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日2016-4液-液分配色譜

liquid-liquidpartition

chromatography固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相

normalphase），流動相的極性大于固定液的極性（反相

reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：（1）全多孔型載體

（2）表面多孔型載體（薄殼型微珠擔體）（3）固定液極性：β，β-氧二丙腈，聚乙二醇非極性：十八烷（ODS），角鯊?fù)?/p>

第20頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日2116-5化學(xué)鍵合相色譜

bonded-phasechromatography1．鍵合固定相類型

用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機分子成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類（1）疏水基團

如不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等（2）極性基團

如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）離子交換基團

如作為陰離子交換基團的胺基，季銨鹽；作為陽離子交換基團的磺酸等.第21頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日22C18硅膠填料結(jié)構(gòu)第22頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日2316-5化學(xué)鍵合相色譜

bonded-phasechromatography

2.化學(xué)鍵合固定相特點：（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；（3）耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；（4）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫；適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；第23頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日243．反相健合相色譜法

固定相：極性較小的鍵合固定相，如硅膠-C18H37、硅膠-苯基等；流動相：極性較強的溶劑，如甲醇、乙睛-水、水和無機鹽的緩沖溶液等。多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點。分離機理：疏溶劑作用。把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強的疏水特性。當用極性流動相來分離含有極性官能團的有機化合物時，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用。兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。第24頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日254.正相鍵合相色譜法固定相:極性的有機基團，CN、NH2雙羥基等（表16-4）鍵合在硅膠表面；流動相:而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為分離極性化合物。主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。5.離子性鍵合相色譜法固定相:當以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團，如一SO3H一CH2NH2、－C00H、一CH2N（CH3）等；

流動相:一般采用緩沖溶液。分離原理與離子交換色譜類同。第25頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日2616-6離子交換色譜

ion-exchange

chromatography流動相：陰離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；陽離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。第26頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日27離子交換色譜分離固定相

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團）

樹脂類別（表16-6）：（1）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）第27頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日2816-7排阻色譜色譜

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴散（滲透）到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離

第28頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日29空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠；非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶颍哂泻愣讖胶驼６确植?。第29頁，共34頁，2023年，2月20日，星期日3016-8親和色譜(AC)

Affinitychromatograph原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。

先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。第30頁，共34頁，2023年，2月20日，