臨床微生物學(xué)檢驗：厭氧菌

厭氧菌anaerobicbacteria掌握厭氧菌的種類、標(biāo)本要求、實驗室檢查掌握常見厭氧芽孢梭菌的生物學(xué)特征重點概述一、厭氧菌的概念、種類與人體分布：概念：對氧氣敏感，一般在有充足氧環(huán)境中不能生長，無氧或低氧分壓環(huán)境中才能生長一類細(xì)菌。（缺乏完善的酶系統(tǒng)，只能以無氧發(fā)酵進(jìn)行能量代謝）分布：自然界廣泛分布，是人體正常菌群，其中口腔、腸道中厭氧菌量最多。

部位

細(xì)菌總數(shù)

比率

(CFU/mlormg)

厭氧菌:需氧菌UpperAirway

鼻洗液

103-104 3-5:1

口水 108-109 1:1

牙齒表面 1010-1011 1:1

牙齦縫隙

1011-1012 1000:1

GastrointestinalTract

胃 102-105 1:1

小腸 102-104 1:1

回腸 104-107 1:1

結(jié)腸 1011-1012 1000:1

FemaleGenitalTract

子宮頸 108-109 3-5:1

陰道 108-109 3-5:1

概述種類：1.根據(jù)革蘭染色分類:

(1)革蘭陽性有芽胞桿菌(梭狀芽孢桿菌屬）

破傷風(fēng)芽孢桿菌產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌

肉毒梭狀芽孢桿菌艱難梭狀芽孢桿菌

(2)革蘭陽性無芽胞桿菌（正常菌群）

乳酸桿菌、雙歧桿菌、優(yōu)桿菌屬、丙酸桿菌屬(3)革蘭陰性無芽胞桿菌

類桿菌屬、普雷沃菌屬、卟啉單胞菌屬、梭桿菌屬(4)革蘭陽性厭氧球菌消化球菌屬、消化鏈球菌屬(5)革蘭陰性厭氧球菌韋榮球菌屬2.根據(jù)對氧耐受程度分類:對氧極端敏感的厭氧菌：在0.5%的氧分壓或在空氣中暴露10mins即死亡的細(xì)菌。中度厭氧菌：能在2%--8%的氧分壓環(huán)境中或空氣暴露60mins—90mins或在膿液標(biāo)本中72h還可以分離出來的細(xì)菌。耐氧厭氧菌：可以在剛配制出來的固體厭氧培養(yǎng)基上生長，但生長不良，無氧條件下生長更好的細(xì)菌。二、臨床意義感染普遍，以混合感染為主。內(nèi)源性感染＞外源性，無芽胞厭氧菌＞芽胞厭氧菌感染危險因素（條件）

1.局部組織血液供給障礙：局部缺氧

2.機體局部屏障作用破壞：組織氧張力↓

3.機體免疫功能↓

4.長期應(yīng)用氨基糖苷類等藥物可誘發(fā)厭氧菌感染二、臨床意義厭氧菌感染的臨床及細(xì)菌學(xué)指征：1.局部氣體產(chǎn)生2.深部外傷感染3.有惡臭的分泌物4.口腔、胃腸和生殖道手術(shù)后感染、流產(chǎn)后發(fā)生的感染，常規(guī)血培養(yǎng)陰性的心內(nèi)膜炎，并發(fā)膿毒癥血栓靜脈炎等5.其它：鏡檢有菌而培養(yǎng)陰性，或在液體及半固體培養(yǎng)基深部長的細(xì)菌等

臨床標(biāo)本肉眼觀察分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)及直接鏡檢厭氧培養(yǎng)

2-7d確定厭養(yǎng)培養(yǎng)

需氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)生長無生長生長

兼性厭氧菌專性厭氧菌保存菌種分類鑒定藥物敏感試驗形態(tài)與染色菌落特性生化反應(yīng)藥敏性鑒定氣液相色譜厭氧菌的檢驗引起人類疾病的各種常見梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）

細(xì)菌名稱所致疾病破傷風(fēng)梭菌破傷風(fēng)產(chǎn)氣莢膜梭菌氣性壞疽、毒血癥、壞死性腸炎、食物中毒等肉毒梭菌食物中毒、嬰兒肉毒梭菌癥、創(chuàng)傷肉毒癥艱難梭菌抗生素相關(guān)性腹瀉、抗生素相關(guān)性偽膜性腸炎厭氧菌中唯一有芽孢菌屬厭氧或微需氧的粗大革蘭陽性桿菌。廣泛分布在自然界。

梭狀芽胞桿菌屬（一）臨床意義致病因素--痙攣毒素（外毒素），臨床癥狀:牙關(guān)緊閉角弓反張等

一、破傷風(fēng)梭菌（C.tetani）下列情況易致破傷風(fēng)梭菌感染傷口窄而深（如刺傷），有泥土或異物污染大面積創(chuàng)傷、燒傷，壞死組織多，局部組織缺血有需氧菌或兼性厭氧菌混合感染的傷口無侵襲力，僅在局部繁殖，外毒素致病1.對氧敏感的破傷風(fēng)溶血毒素(tetanolysin)2.質(zhì)粒編碼的破傷風(fēng)痙攣毒素(tetanospasmin)屬神經(jīng)毒(neurotoxin)，毒性極強(對人致死量<1μg)蛋白質(zhì)（可脫毒成類毒素），不耐熱：輕鏈（A鏈）-S-S-重鏈（B鏈）

B鏈：神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的單位

A鏈：毒性作用致病因子

(二)生物學(xué)性狀

1.形態(tài)染色:革蘭陽性芽胞圓形，比菌體大，位于菌體頂端呈鼓槌狀，無莢膜，有鞭毛。

2.培養(yǎng)特性:專性厭氧，在血平板上有遷徙生長，菌落呈羽毛狀。庖肉培養(yǎng)基輕度變濁，肉渣部分消化，微變黑，惡臭，產(chǎn)少量氣體。(三)微生物學(xué)檢查

癥狀典型者，一般不作細(xì)菌檢查。懷疑感染：直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、鑒定鑒別3.生化反應(yīng)：不發(fā)酵分解糖類，硝酸鹽－，H2S＋，

明膠＋4.抵抗力：芽胞耐熱、耐干燥，對青霉素、紅霉素、四環(huán)素等敏感，氨基糖苷類耐藥。二、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌（C.perfringens）1.莢膜、外毒素和侵襲性酶類－引起氣性壞疽

的臨床表現(xiàn)

（水腫、皮下捻發(fā)音）

α毒素（卵磷脂毒素）產(chǎn)生量最大引起血管通透性增加伴大量溶血、組織壞死、肝臟、心功能受損在氣性壞疽的形成中起主要作用β、γ、ε等其他毒素引起組織壞死、血管通透性增加、水腫、產(chǎn)氣（一）臨床意義2.腸毒素－食物中毒（壞死性腸炎）。下列情況易導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌感染：開放性骨折大塊肌肉撕裂組織嚴(yán)重壞死

（二）生物學(xué)性狀

1.形態(tài)染色：革蘭陽性粗短大桿菌，兩端鈍圓，芽胞圓形位于菌體中央或次極端，直徑不大于菌體，但較少形成，有莢膜，無鞭毛。

2.培養(yǎng)特性：非嚴(yán)格厭氧，繁殖迅速，血平板上雙層溶血環(huán)，皰肉培養(yǎng)基中“洶涌發(fā)酵”。3.生化反應(yīng)：H2S＋，明膠＋，葡萄糖＋，乳糖＋，麥芽糖＋，蔗糖＋，卵磷脂酶＋

卵磷脂酶陽性（三）微生物學(xué)檢查法直接涂片鏡檢深部創(chuàng)口取材涂片革蘭陽性大桿菌白細(xì)胞少且不典型伴有其他雜菌早期診斷可避免病人最終截肢或死亡

分離培養(yǎng)及動物實驗接種血平板或庖肉培養(yǎng)基，鏡檢及生化反應(yīng)鑒定動物實驗如懷疑食物中毒，在發(fā)病后一日內(nèi)，檢出大于105CFU/克食品或106CFU/克糞便可確立診斷三、肉毒梭菌（C.botulinum

[,bɑt??'la?n?m]）（一）生物學(xué)性狀：1.形態(tài)染色：革蘭陽性大桿菌,芽胞橢圓形位于菌體次極端,比菌體粗,呈網(wǎng)球拍狀。無莢膜,有鞭毛。2.培養(yǎng)特性：嚴(yán)格厭氧，普通培養(yǎng)基生長，血平板上β溶血環(huán)，庖肉培養(yǎng)基肉渣消化，變黑，惡臭。3.生化反應(yīng)：H2S＋,明膠＋,葡萄糖＋,麥芽糖＋,乳糖－,

吲哚－,卵磷脂酶－

（二）臨床意義肉毒毒素--毒性極強嗜神經(jīng)性，使神經(jīng)麻痹；食物中毒。劇毒（對人致死量為0.1μg)（三）微生物學(xué)檢查

毒素檢測和分離培養(yǎng)鑒定四、艱難梭菌（一）生物學(xué)性狀：1.形態(tài)染色：革蘭陽性大桿菌，芽胞橢圓形或長方形，位于菌體次極端不大于菌體，無莢膜，有鞭毛。2.培養(yǎng)特性：嚴(yán)格厭氧，血平板無溶血環(huán)，CCFA平板呈黃色菌落，在紫外燈下可見黃綠熒光。3.生化反應(yīng)：H2S－,蔗糖－,葡萄糖＋,乳糖－,麥芽糖－,

吲哚－,脂酶－（二）臨床意義正常菌群。醫(yī)院感染的重要病原菌。產(chǎn)生A、B兩種毒素，即腸毒素和細(xì)胞毒素，引起假膜性腸炎。（三）微生物學(xué)檢查

毒素檢測和分離培養(yǎng)鑒定艱難梭菌在CCFA平板上菌落（培養(yǎng)48h)

革蘭陰性無芽胞厭氧桿菌臨床厭氧菌感染中最常見的病原菌一、類桿菌屬

BBE平板上有黑色暈圈二、普雷沃菌屬

KVLB出現(xiàn)黑色菌落三、卟啉單胞菌屬四、梭桿菌屬

革蘭陽性無芽胞厭氧桿菌革蘭陽性無芽胞厭氧桿菌有6個屬，幾十個菌種，臨床常見的有丙酸桿菌、優(yōu)桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、蛛網(wǎng)菌和放線菌。它們多是人和動物皮膚、口腔、腸道等部位的重要生理菌群，在體內(nèi)起到調(diào)節(jié)和維持人體微生態(tài)平衡的重要作用。它們的菌落、生化反應(yīng)、菌體形態(tài)等都很相似，鑒定較難。應(yīng)用氣液相色譜法（GLC），根據(jù)其代謝產(chǎn)物不同，可對菌屬做出初步判定。厭氧球菌厭氧性球菌(Anaerobiccocci)是臨床厭氧感染的重要病原菌，約占臨床厭氧菌分離株的25％主要包括革蘭陽性:消化球菌屬消化鏈球菌屬

革蘭陰性:韋榮球菌屬消化球菌屬黑色消化球菌(Peptococcusniger)是消化球菌屬中唯一的菌種。革蘭陽性球菌。直徑0.3～1.3μm，單個、成雙、短鏈或成堆排列。無芽胞，無莢膜。專性厭氧菌，生長緩慢，厭氧培養(yǎng)2～4天形成黑色不溶血的小菌落。標(biāo)本黑色有臭味是該細(xì)菌感染的重要特點。

消化鏈球菌屬代表菌為厭氧消化鏈球菌（P.anaerobius）革蘭陽性球形或卵圓形，大小不等，菌體直徑0.3～1μm，常成雙或呈短鏈狀排列。無鞭毛，無芽胞，無莢膜。消化鏈球菌培養(yǎng)特性專性厭氧，營養(yǎng)要求較高，需羊血和血清培養(yǎng)基才能生長。在厭氧血平板上，菌落直徑0.5～1mm、灰白色、凸起、不透明、邊緣整齊，一般不溶血，偶有α或β溶血。生化反應(yīng)不活潑，在硫乙醇酸鈉液體培養(yǎng)基中，呈顆粒狀沉淀生長。在其平板上生化反應(yīng)較為明顯，吐溫-80可促進(jìn)其生長。韋榮球菌屬

韋榮球菌屬細(xì)菌形態(tài)相似，為革蘭陰性球菌。直徑0.3～0.5μm，多排列成對、近似奈瑟球菌。無鞭毛、無芽胞。專性厭氧，血瓊脂平板上生長良好，培養(yǎng)48h后，形成直徑1～2mm圓形、凸起、灰白色或黃色混濁、不溶血菌落；在硫乙醇酸鹽肉湯中混濁生長，產(chǎn)生小氣泡。新鮮培養(yǎng)物立即置紫外線下照射，菌落可顯紅色熒光，接觸空氣后熒光消失。生化反應(yīng)不活潑，不分解糖類，還原硝酸鹽。革蘭陰性無芽胞厭氧桿菌這是一群不形成芽胞的厭氧桿菌，是人體正常菌群的重要組成成員，部分菌株可作為條件致病菌引起感染。常見菌屬有：類桿菌屬普雷沃菌屬卟啉（紫）單胞菌屬梭桿菌屬類桿菌屬類桿菌屬(Bacteroides)是臨床上最重要的革蘭陰性無芽胞厭氧桿菌，臨床標(biāo)本中以脆弱類桿菌（B.fragilis）最常見。脆弱類桿菌為革蘭陰性，大小為(0.8～1.3μm)×(1.6～8μm)，著色不均，兩端鈍圓而濃染，中間不著色染色較淺似空泡。在陳舊培養(yǎng)物或含糖的液體培養(yǎng)基中呈明顯多形性，無鞭毛、無芽胞，多數(shù)有莢膜。普雷沃菌屬普雷沃菌屬(Prevotella)是從類桿菌屬分出的一個新菌屬，代表菌種是產(chǎn)黑色素普雷沃菌(P.melaninogenica)。革蘭陰性球桿狀，大小約0.8～1.5μm×1.0～3.5μm，排列成雙或短鏈，兩端鈍圓，有濃染和空泡。產(chǎn)黑色素普雷沃菌培養(yǎng)特性專性厭氧菌，在厭氧平板上2～3天培養(yǎng)后，菌落直徑為0.5～3mm，圓形、凸起、不透明，許多菌株呈β-溶血。菌落在紫外光（波長366nm）照射下有磚紅色熒光，逐漸轉(zhuǎn)為褐黑色和棕色菌落，5～7天轉(zhuǎn)為黑色菌落，色素出現(xiàn)后熒光即消失。卟啉（紫）單胞菌屬

紫單胞菌屬(Porphyromonas)又稱卟啉單胞菌屬。代表菌種是不解糖紫單胞菌。革蘭陰性桿菌或球桿菌，大小約1.5～3.5μm×0.8～1.5μm，兩端鈍圓，著色不均勻。35～37℃厭氧培養(yǎng)3～5d可形成1～2mm圓形、凸起、表面光滑、邊緣整齊、棕色或黑色菌落。維生素K1和氯化血紅素可促進(jìn)本菌生長及黑色素的產(chǎn)生。梭桿菌屬

梭桿菌屬（Fusobacterium）是臨床常見的革蘭陰性無芽胞厭氧桿菌，形態(tài)細(xì)長，兩端尖細(xì)如梭。壞死梭桿菌是毒力很強的梭桿菌，常引起急性扁桃體炎，有時并發(fā)單核細(xì)胞增多癥，是兒童和青年人扁桃體周圍膿腫中最常分離到的厭氧菌。局部癥狀還包括頸間隙感染和頸靜脈膿毒性血栓靜脈炎，尚可引起胸膜滲出性膿胸、增生性轉(zhuǎn)移膿腫和菌血癥。壞死梭桿菌形態(tài)習(xí)題關(guān)于厭氧菌，錯誤的是

A采集時注意不被正常菌群污染，盡量避免接觸空氣

B產(chǎn)氣莢膜梭在強化血平板上出現(xiàn)雙層溶血環(huán)

C美藍(lán)指示劑在有氧時變藍(lán)色

D齒齦、咽喉拭子、痰液或氣管吸出物等標(biāo)本不宜厭氧培養(yǎng)

E局部組織的氧化還原電勢上升有利厭氧菌生長EThankyou

標(biāo)本采集原則：采集時注意不被正常菌群污染，盡量避免接觸空氣下列易污染標(biāo)本不宜厭氧培養(yǎng)齒齦、咽喉拭子，痰液（呼吸道），胃和腸道內(nèi)容物或肛拭子、糞便（消化道），陰道或?qū)m頸拭子（生殖道），中段尿或?qū)蛞海谀虻溃?，皮膚表面或傷口邊緣等標(biāo)本適合厭氧菌檢測的標(biāo)本：①一級標(biāo)本：正常無菌性體液標(biāo)本或活檢標(biāo)本②二級標(biāo)本：氣管引流液、支氣管灌洗液、膀胱穿刺液等。③三級標(biāo)本：人體口腔、腸道等有固有菌群存在部位附近感染性膿腫穿刺液等。不同部位標(biāo)本采集法針筒抽取、穿刺術(shù)等

厭氧標(biāo)本運送即送即檢，避免標(biāo)本干燥、接觸空氣和低溫保存1.針筒運送法：各種液體標(biāo)本，簡便易行2.無菌厭氧袋法：注射器、組織標(biāo)本3.已排氣不含氧的管或瓶（內(nèi)含厭氧指示劑）：

檢驗方法分離培養(yǎng)1.初代培養(yǎng)：

1）培養(yǎng)基：新鮮、預(yù)還原

非選擇性培養(yǎng)基：強化BAP(血、維生素、氯化血紅素等),幾乎所有厭氧菌均可生長。

選擇培養(yǎng)基：KVLB、BBE、EYA、CCFA…

2）標(biāo)本接種固體和液體培養(yǎng)基同時接種

檢驗方法3）培養(yǎng)方法

4）結(jié)果觀察

2.次代培養(yǎng)和厭氧菌再確定

3.厭氧菌培養(yǎng)失誤的原因

采集運送培養(yǎng)基厭氧環(huán)境時間等因素

厭氧罐培養(yǎng)法厭氧氣袋培養(yǎng)法厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)法厭氧罐法－以物理或化學(xué)方法造成無氧環(huán)境

美藍(lán)指示劑（有氧藍(lán)色、無氧無色）刃天青指示劑（有氧紅色、無氧無色）抽氣換氣法：

10%H2、10%CO2、80%N2、鈀粒

冷觸媒法：

鈀粒硼氫化鉀、碳酸氫鈉、枸櫞酸藥片C2O+H2↑

H2O

O2

氣袋法：

原理同上冷觸媒法，簡單方便。

厭氧手套箱：

最好的厭氧菌培養(yǎng)設(shè)備

其他：

OxyplatesTM（氧凈）厭氧培養(yǎng)皿－－可反復(fù)打開，Oxyrase酶系統(tǒng)能使培養(yǎng)基中O2去除，并產(chǎn)生CO2。

鑒定試驗

形態(tài)與染色：

用24h內(nèi)幼齡菌，多染色性，多形性菌落性狀：

色素、溶血、熒光等生化試驗：糖發(fā)酵試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、觸酶試驗等

抗生素敏感鑒定：

滅滴靈（厭氧菌S）、卡那霉素（梭桿S）、萬古霉素等鑒定試驗氣液相色譜技術(shù)（GLC）厭氧菌產(chǎn)生大量的有機酸（揮發(fā)性和非揮發(fā)性脂肪酸），過柱分析，定性定量。厭氧菌快速發(fā)酵試驗：

利用厭氧菌產(chǎn)生的胞外酶與少量的生化基質(zhì)迅速反應(yīng)，4h內(nèi)可觀察到生化反應(yīng)結(jié)果。無需厭氧環(huán)境，只需濃厭氧菌液即可。質(zhì)譜技術(shù)藥物敏感試驗

考慮做厭氧菌體外藥敏試驗的臨床情況：①明確厭氧菌