第二章基因工程的酶學(xué)演示文稿

第二章基因工程的酶學(xué)演示文稿當(dāng)前1頁，總共114頁。優(yōu)選第二章基因工程的酶學(xué)當(dāng)前2頁，總共114頁。當(dāng)前3頁，總共114頁。當(dāng)前4頁，總共114頁。第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)Enzymes當(dāng)前5頁，總共114頁。當(dāng)前6頁，總共114頁。當(dāng)前7頁，總共114頁。(II類)限制性內(nèi)切酶

限制性內(nèi)切酶的存在給沒給基因工程操作帶來麻煩？限制性內(nèi)切酶在基因工程操作中有哪些具體用途？當(dāng)前8頁，總共114頁。首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。(II類)限制性內(nèi)切酶

分離的第一個酶是HindⅡ當(dāng)前9頁，總共114頁。一、限制性內(nèi)切酶的基本特性

是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。（1）識別位點4—8bp，回文結(jié)構(gòu)思考題1、在序列5’-CGAACATATGGAGT-3’中含有一個6bp的II類限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，該位點的序列可能是什么？2、下面幾種序列中你認為哪一個（哪些）最有可能是II類限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列：GAATCG,AAATTT,GATATC,ACGGCA?為什么？當(dāng)前10頁，總共114頁。（2）內(nèi)切酶與識別序列的結(jié)合模式1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。GAATTCCTTAAG當(dāng)前11頁，總共114頁。（3）切割位點EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生？末端EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生？末端切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識別位點處。當(dāng)前12頁，總共114頁。（4）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有幾個核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5’端凸出（如EcoRI切點）GAATTC

CTTAA

GG

AATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’當(dāng)前13頁，總共114頁。CTGCAG

②3’端凸出（如PstI切點）GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

G

ACGTC當(dāng)前14頁，總共114頁。

①連接便利（5）粘性末端的意義只要粘性末端堿基互補就可以連接。這比連接兩個平齊末端容易的多。當(dāng)前15頁，總共114頁。當(dāng)前16頁，總共114頁。凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端標記，3’末端加尾凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標記。當(dāng)前17頁，總共114頁。識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切酶。（6）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’當(dāng)前18頁，總共114頁。XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’識別位點相同，但切點不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：當(dāng)前19頁，總共114頁。識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（7）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。當(dāng)前20頁，總共114頁。5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A當(dāng)前21頁，總共114頁。二、DNA末端長度對限制酶切割的影響

限制酶切割DNA時對識別序列兩端的非識別序列有長度的要求，也就是說在識別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。當(dāng)前22頁，總共114頁。

在設(shè)計PCR引物時，如果要在末端引入一個酶切位點，為保證能夠順利切割擴增的PCR產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。另外，了解末端長度對切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點時選擇酶切秩序。溫馨提示——Becareful當(dāng)前23頁，總共114頁。表2-4：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測）限制酶

待測的寡核苷酸序列待測的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0表2-4：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測）限制酶

待測的寡核苷酸序列待測的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0限制酶待測的寡核苷酸序列待測的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0表1：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測）

當(dāng)前24頁，總共114頁。

某些限制酶對同一介質(zhì)中的有些位點表現(xiàn)出偏愛性切割，即對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點偏愛。三、位點偏愛（Sitepreference）當(dāng)前25頁，總共114頁。

λ噬菌體DNA為48502bp，含12bp粘端。EcoRⅠ酶切割噬菌體中的5個位點時并不是隨機的，靠近右端的位點比分子中間的位點切割快10倍；

某些噬菌體DNA中的某些相同的酶切位點對酶的敏感性是不同的。如：當(dāng)前26頁，總共114頁。四、在實驗室條件下進行酶切20微升反應(yīng)體系當(dāng)前27頁，總共114頁。五、酶切反應(yīng)條件終止酶切的方法緩沖液反應(yīng)溫度反應(yīng)時間當(dāng)前28頁，總共114頁。緩沖液(Buffer)（1）緩沖液的化學(xué)組成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。當(dāng)前29頁，總共114頁。不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI504525溫度當(dāng)前30頁，總共114頁。

EcoRⅠ若反應(yīng)16小時，所需酶量為正常酶切時間的1/8，即若反應(yīng)時間為16小時，則所用酶量為只切1小時的1/8。

反應(yīng)時間

反應(yīng)時間通常為1小時或更多，許多酶延長反應(yīng)時間可減少酶的用量。例如：當(dāng)前31頁，總共114頁。終止酶切的方法苯酚加熱EDTA當(dāng)前32頁，總共114頁。

EDTA可鏊合鎂離子，從而可終止酶切反應(yīng)，終止?jié)舛葹?0mM；

加熱是常用的方法，對于最佳反應(yīng)溫度為37℃的酶，在65℃或80℃處理20分鐘可使酶活性大部分喪失。

對于在80℃作用20分鐘也有不失活的酶可用苯酚抽提去除蛋白，或用試劑盒純化DNA。當(dāng)前33頁，總共114頁。與酶切反應(yīng)條件相關(guān)的兩個現(xiàn)象當(dāng)前34頁，總共114頁。

在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱。星號（*）活性。1、星號（*）活性當(dāng)前35頁，總共114頁。EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時候要特別注意！當(dāng)前36頁，總共114頁。內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。2、完全消化與局部消化123412341）、完全消化當(dāng)前37頁，總共114頁。只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。2）、局部消化123414當(dāng)前38頁，總共114頁。

請確定XbaI,XhoI和KpnI位點在DNA上的相對位置。當(dāng)前39頁，總共114頁。當(dāng)前40頁，總共114頁。六、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素外因內(nèi)因

外因是可預(yù)見和控制的，如反應(yīng)條件、底物的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽酚的污染）、何時加酶、操作是否恰當(dāng)、反應(yīng)體積的選擇以及反應(yīng)時間的長短等等

內(nèi)因包括位點偏愛性、甲基化底物、底物的構(gòu)象。構(gòu)象的影響主要指切割線性DNA和超螺旋DNA時的活性，如與切割DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶來切割pBR322的超螺旋DNA當(dāng)前41頁，總共114頁。從細菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二節(jié)DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷口。當(dāng)前42頁，總共114頁。（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。二、DNAligase的特點（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。當(dāng)前43頁，總共114頁。（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個磷酸基團（P）。（3）需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件當(dāng)前44頁，總共114頁。1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、連接反應(yīng)的機理2.ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。3.AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi當(dāng)前45頁，總共114頁。4.AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP當(dāng)前46頁，總共114頁。5.3‘-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。當(dāng)前47頁，總共114頁。連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。四、連接反應(yīng)的溫度1.最佳溫度但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。2.實用溫度所以一般采用4~16C。當(dāng)前48頁，總共114頁。增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。1.插入片段與載體的濃度比例2.反應(yīng)溫度12.5℃。五、影響連接反應(yīng)的因素10~20倍。一般14~16℃當(dāng)前49頁，總共114頁。第三節(jié)DNA聚合酶(自學(xué))一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶當(dāng)前50頁，總共114頁。1.共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。當(dāng)前51頁，總共114頁。DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常用DNA聚合酶的特性比較當(dāng)前52頁，總共114頁。三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I主要用來制備帶放射性標記的DNA探針。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的性質(zhì)①一條單鏈多肽。②5’3’外切酶活性位于N端。③用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。當(dāng)前53頁，總共114頁。①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③帶有3’—OH游離端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反應(yīng)條件-OH5’3’dNTPs當(dāng)前54頁，總共114頁。標記①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制備探針已知序列的核酸片斷顯示位置與互補的待測序列雜交當(dāng)前55頁，總共114頁。標記已知序列的核酸片斷②探針的標記方式標記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5’3’當(dāng)前56頁，總共114頁。③DNA聚合酶I對探針序列的標記缺口轉(zhuǎn)移法(nicktranslation)：放射性同位素標記：DNA聚合酶I同時具備5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。當(dāng)前57頁，總共114頁。5’3’外切酶活性從DNA缺口的下一段DNA5’端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在缺口的上一段DNA的3’一側(cè)補上一個新的核苷酸。缺口缺口5’5’3’3’5’3’5’3’當(dāng)前58頁，總共114頁。純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進行缺口轉(zhuǎn)移一種-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標記8當(dāng)前59頁，總共114頁。2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質(zhì)DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草桿菌蛋白酶當(dāng)前60頁，總共114頁。①3’端補平5’5’klenow②DNA3’末端標記補平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標記的dNTP。klenow（2）主要用途當(dāng)前61頁，總共114頁。3’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補平根據(jù)末端的順序選擇一種-32P-dNTPs末端標記的DNA限制性內(nèi)切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h當(dāng)前62頁，總共114頁。③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物當(dāng)前63頁，總共114頁。（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)3.T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解單鏈更快）。①來源②酶活性當(dāng)前64頁，總共114頁。③特點當(dāng)沒有dNTP時，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。當(dāng)前65頁，總共114頁。5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’當(dāng)前66頁，總共114頁。（2）T4DNA聚合酶的用途標記末端（取代合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性補平，并加入放射性標記的dNTP。①補平隱蔽末端②DNA3’末端標記當(dāng)前67頁，總共114頁。酶切中間產(chǎn)生兩個末端標記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’5’外切）DNA酶切片斷T4DNA聚合酶（5’3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’內(nèi)切酶切無dNTPs當(dāng)前68頁，總共114頁。a.放射性標記的優(yōu)缺點：制作簡單、高比放射性、放射自顯影效果好。優(yōu)點：缺點：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、對人體有害。要求在專門實驗室操作。當(dāng)前69頁，總共114頁。b.非放射性標記i）生物素標記：生物素（biotin），又稱維生素H、輔酶R可以與dNTP酰化結(jié)合成為生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素連接酶（biotinligase）催化與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。當(dāng)前70頁，總共114頁。純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進行缺口轉(zhuǎn)移生物素-dTTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口轉(zhuǎn)移法將生物素摻入DNA探針中當(dāng)前71頁，總共114頁。光促生物素標記生物素連接臂光敏基因探針序列探針序列生物素連接臂光敏基因+光照當(dāng)前72頁，總共114頁?？股锼氐鞍祝╝vidin）：鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin）：生物素的識別——親和素：是一種雞卵清蛋白。細菌中avidin的類似物。能與生物素特異結(jié)合的蛋白或抗體，常用：當(dāng)前73頁，總共114頁。ii）地高辛標記：可以與dNTP連接成地高辛-dUTP等，參入DNA合成過程。形成地高辛標記的DNA探針。生物素和地高辛標記的探針都有商品化的試劑盒(kit)。地高辛的結(jié)合物是抗地高辛抗體。當(dāng)前74頁，總共114頁。當(dāng)前75頁，總共114頁。iii）偶聯(lián)酶及其底物常用的兩種酶：辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過程中發(fā)出熒光（或生成有色的產(chǎn)物）。酶的作用：當(dāng)前76頁，總共114頁?；瘜W(xué)發(fā)光底物當(dāng)前77頁，總共114頁。HRPO和AP的顯色反應(yīng)底物當(dāng)前78頁，總共114頁。發(fā)光反應(yīng)機理當(dāng)前79頁，總共114頁。iv）用非放射性標記的探針檢測原理生物素探針序列待測基因親和素酶底物中間產(chǎn)物產(chǎn)物發(fā)光探針DNA用生物素或地高辛標記。親和素或地高辛抗體與酶偶聯(lián)。酶催化一個發(fā)光或顯色反應(yīng)。親和素或地高辛抗體與生物素或地高辛結(jié)合。當(dāng)前80頁，總共114頁。核酸探針雜交篩選法的缺點是：只檢測是否有外源DNA插入，而不論該DNA是否表達出產(chǎn)物。當(dāng)前81頁，總共114頁。4.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，由兩個亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白。增加大亞基對模板的親和性。當(dāng)前82頁，總共114頁。（2）T7DNA聚合酶的特點①持續(xù)合成能力強一旦與模板結(jié)合就會不間斷地合成互補鏈。②3’5’外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)的阻礙當(dāng)前83頁，總共114頁。②進行末端標記①以大分子量DNA為模板的合成如M13③補平隱蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法標記3’末端。與T4DNA聚合酶相同。合成補平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。當(dāng)前84頁，總共114頁。5.修飾后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7DNA聚合酶的用途①DNA測序雙脫氧法。②標記DNA3’隱蔽末端③更有效地補平末端當(dāng)前85頁，總共114頁。6.逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。（1）來源RNA腫瘤病毒。（2）AMV的性質(zhì)由和兩條多肽鏈組成。當(dāng)前86頁，總共114頁。①鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和RNaseH活性。RNaseH：鏈經(jīng)過蛋白酶水解后產(chǎn)生的一條多肽。以5’3’或3’5’方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA當(dāng)前87頁，總共114頁。（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途②鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5’3’DNA外切酶活性。①合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補結(jié)合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA當(dāng)前88頁，總共114頁。②合成DNA探針用隨機引物（randomprimer）或oligodT做引物。隨機引物：隨機順序形成的寡聚DNA片斷。（理論上它能與各種序列的模板結(jié)合）③RT-PCR用的模板克隆某個基因時，用其mRNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈。當(dāng)前89頁，總共114頁。第四節(jié)DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1.來源小牛胸腺。2.組成大小兩個亞基。3.特性（1）5’3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）當(dāng)前90頁，總共114頁。②不需要模板?、傩枰?’—OH、二甲胂酸緩沖液。③底物可以是單鏈DNA、是3’—OH突出的雙鏈DNA、

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④隨機添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP，末端轉(zhuǎn)移酶當(dāng)前91頁，總共114頁。4.末端轉(zhuǎn)移酶的用途（1）同聚物加尾給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。外源DNA載體DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端轉(zhuǎn)移酶當(dāng)前92頁，總共114頁。（2）再生酶切位點便于回收克隆片斷。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow補平當(dāng)前93頁，總共114頁。AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGAAGCTTTTTTCGAA末端轉(zhuǎn)移酶dTTPAAAAAA外源DNA當(dāng)前94頁，總共114頁。（3）非放射性標記DNA片斷的3’端AAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位點HindⅢ位點連接催化非放射性標記物參入DNA片斷的3’端。（生物素-11-dUTP等）當(dāng)前95頁，總共114頁。二、T4多核苷酸激酶1.來源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細胞中分離出來。多種哺乳動物細胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2.功能催化磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。不論5’-OH端突出與否。當(dāng)前96頁，總共114頁。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的磷酸帶有32P標記，就會被轉(zhuǎn)移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。當(dāng)前97頁，總共114頁。3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標記DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP多核苷酸激酶3’P--OH5’3’HO--P5’堿性磷酸酶（1）正向反應(yīng)（forwardreaction）當(dāng)前98頁，總共114頁。（2）交換反應(yīng)標記法反應(yīng)混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP時，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P與DNA5’端的磷酸交換。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反應(yīng)效果不理想。當(dāng)前99頁，總共114頁。

三、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）細菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。具有抗熱性。SDS中加熱68oC可完全失活。當(dāng)前100頁，總共114頁。2.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH堿性磷酸酶3.堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體份子自我連接當(dāng)前101頁，總共114頁。單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A堿性磷酸酶5’5’5’當(dāng)前102頁，總共114頁。A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能與脫磷