分子生物學實驗

分子生物學實驗第1頁/共25頁基因工程

基因工程是在分子水平上，用人工方法提取或制備DNA，在體外切割、拼接和重新組合，然后通過載體把重組的DNA分子導入受體細胞，使外源DNA在受體細胞中進行復制與表達，產(chǎn)生出人們所需要的產(chǎn)物，或定向創(chuàng)造生物新性狀，并使之穩(wěn)定地傳給下一代。目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA序列②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）第2頁/共25頁基因工程的基本過程分切接轉(zhuǎn)篩表RNA提取、RT-PCR、PCR內(nèi)切酶DNA連接酶質(zhì)粒提取、脂質(zhì)體抗性篩選、GFP、藥物篩選蛋白純化第3頁/共25頁載體——質(zhì)粒什么是質(zhì)粒？質(zhì)粒是染色體外的穩(wěn)定遺傳因子雙鏈、閉合、超螺旋DNA主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中自主復制和轉(zhuǎn)錄，并表達所攜帶的遺傳信息第4頁/共25頁質(zhì)粒提取—堿裂解法堿裂解法原理123染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子變性染色體DNA片段與蛋白質(zhì)形成沉淀，而復性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復其天然構(gòu)象第5頁/共25頁質(zhì)粒提取—堿裂解法質(zhì)粒提取步驟溶液I：葡萄糖，Tris-Cl，EDTA溶液II：NaOH，SDS溶液III：醋酸鉀，醋酸第6頁/共25頁質(zhì)粒提取試劑1.高純度小/大提試劑盒2.超純度小/大提試劑盒3.去內(nèi)毒素小/大提試劑盒4.酵母質(zhì)粒小提試劑盒凱基質(zhì)粒提取試劑盒采用的硅膠膜吸附材料，經(jīng)機械化切割與裝填，均一性強；結(jié)合液提供質(zhì)粒吸附條件；過濾離心柱可吸附GenomicDNA和部分非超螺旋質(zhì)粒；純化質(zhì)粒為超純度級別，適合于酶切、PCR、測序、轉(zhuǎn)染等要求。第7頁/共25頁RNA提取—異硫氰酸胍/苯酚法原理細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA第8頁/共25頁RNA提取步驟常使用氯仿抽提，以去除糖、蛋白等雜志，并促進水相與有機相的分離。凱基公司的Trizon總RNA提取試劑就是采用這種方法。抽提氯仿抽提RNA后，采用異丙醇沉淀RNA。沉淀加入無RNase的75%乙醇，是RNA沉淀中鹽離子被充分溶解，風干1-2分鐘。洗滌溶解加入適量的RnasefreeH2O溶解RNA沉淀。第9頁/共25頁RNA提取試劑1.總RNA提取試劑盒2.Trizon總RNA提取試劑3.動物組織總RNA提取試劑盒4.植物組織總RNA提取試劑盒5.microRNA快速提取試劑盒凱基TRIzol試劑可用于少量樣品的RNA提取，也可用于大量樣品的RNA提取。提取RNA整個過程方便快速，提取的RNA無蛋白和DNA的污染，純度高，可直接用于NorthernBlotting、斑點雜交、mRNA純化、體外翻譯、RNase保護分析、RT-PCR、構(gòu)建cDNA文庫等各種分子生物學實驗。第10頁/共25頁PCR/RT-PCR

系列PCR試劑反轉(zhuǎn)錄試劑Real-timePCR第11頁/共25頁RT-PCRRT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于直接克隆特定基因的cDNA序列以及檢測細胞中基因表達水平。第12頁/共25頁反轉(zhuǎn)錄PCR引物的選擇反轉(zhuǎn)錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、OligodT及基因特異性引物。隨機引物OligodT基因特異性引物適用于長的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA。與模板序列互補的引物，適用于目的序列已知的情況。適用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的OligodTrRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）第13頁/共25頁反轉(zhuǎn)錄PCR反轉(zhuǎn)錄PCR步驟第14頁/共25頁PCR的基本原理以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5’末端和3‘末端相互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復這一過程，即可使目的DNA片段得到擴增。PCR的基本原理第15頁/共25頁PCRPCR步驟第16頁/共25頁RT-PCR產(chǎn)品PCR相關(guān)產(chǎn)品反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)品1.Taq酶2.Pfu酶3.TaqBuffer4.dNTPs5.2xPCRMix6.2xPCRSuperMix7.PCR試劑盒1.AMV反轉(zhuǎn)錄酶2.M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶3.cDNA第一鏈合成試劑盒（AMV）4.cDNA第一鏈合成試劑盒（M-MLV）5.一步法RT-PCR試劑盒（AMV）6.一步法RT-PCR試劑盒（M-MLV）凱基RT-PCR產(chǎn)品包括從RNA反轉(zhuǎn)錄至cDNA和PCR反應，可適用于各種動、植物、病毒RNA的PCR檢測。第17頁/共25頁實時熒光定量PCR定義

利用熒光信號對PCR反應的過程進行實時監(jiān)控目的

對起始模板進行定量

優(yōu)點

靈敏,重復性,動態(tài)范圍寬,高通量原理

C(t)值與起始模板濃度的對數(shù)成反比第18頁/共25頁SGSGSGReal-timePCR5’3’5’3’ExcitationEmissionSYBR-GreenSGSGSGSGSG5’3’5’3’ExcitationEmissionSGIII第19頁/共25頁Real-timePCRTaq-man原理第20頁/共25頁Real-timePCR產(chǎn)品1.SYBRGreenRealtimePCRMix2.TaqmanRealtimePCRMix凱基Real-time試劑靈敏度高、特異性強定量更準確?？捎糜贒NA或RNA的絕對定量分析、基因表達差異分析、基因分型，例如SNP檢測，甲基化檢測等。

第21頁/共25頁凱基分子生物學產(chǎn)品核酸純化系列PCR/RT-PCR系列基因克隆系列DNAMarker系列第22頁/共25頁凱基分子生物學產(chǎn)品PCR/RT-PCR系列1.Taq酶2.PCRMix(2X)3.AMV反轉(zhuǎn)錄酶4.M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶5.cDNA第一鏈合成試劑盒(AMV)6.cDNA第一鏈合成試劑盒(M-MLV)7.SYBRGreenRealtimePCRMix8.TaqmanRealtimePCRMix核酸純化系列1.高純度小/大提試劑盒2.去內(nèi)毒素小/大提試劑盒3.酵母質(zhì)粒小提試劑盒4.植物/細菌/血液/細胞基因組DNA小提試劑盒5.PCR產(chǎn)物和DNA片段回收試劑盒6.瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒7.Trizon總RNA提取試劑1.T4DNALigase2.KeygenTrans基因克隆產(chǎn)品DN