核醫(yī)學第章放射性核素標記化合物

示蹤技術(shù)

觀察野生動物大熊貓的生活習性無線電發(fā)射器示蹤物

放射性核素酶熒光素

1當前1頁，總共99頁。1923年,G.Hevesy首次通過測定放射性鉛的射線來觀察其在動、植物體內(nèi)的分布；1952年Hershey32P、35S→DNA是遺傳物質(zhì)；1959年Berson、Yalow→RIA；1958年

Meselson、Stahl→DNA半保留復制；1977年，F(xiàn)rederickSanger等采用放射性標記技術(shù)和ARG，成功地進行了DNA序列測定。示蹤實驗之父32P、131I、14C、3H先后被用于醫(yī)學實驗研究RNA-DNA逆轉(zhuǎn)錄、遺傳的三聯(lián)密碼、細胞周期、微量物質(zhì)測量等均離不開示蹤技術(shù)。History2當前2頁，總共99頁。如何用噬菌體感染實驗證明DNA是遺傳信息的載體？Introduction3當前3頁，總共99頁。如何用噬菌體感染實驗證明DNA是遺傳信息的載體？4當前4頁，總共99頁。如何用噬菌體感染實驗證明DNA是遺傳信息的載體？35S32P35S32P子代分離蛋白質(zhì)外殼及DNA內(nèi)核，并測量放射性蛋白質(zhì)外殼無放射性，DNA上有放射性！DNA是遺傳物質(zhì)！5當前5頁，總共99頁。為什么要用放射性核素作為示蹤劑？

一般非放射性物質(zhì)進入機體后無法區(qū)別哪些是外來的？哪些是原有的物質(zhì)？有些物質(zhì)進入機體后發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化、分解，無法再找到它的蹤跡。Tracer6當前6頁，總共99頁。核醫(yī)學應用

7當前7頁，總共99頁。PETandSPECT:AdvancedImagingSystemsPositronEmissionTomographySingle-PhotonEmissionComputedTomographyAPETscancanbeaneffectivetooltodiagnoseParkinson’sdisease8當前8頁，總共99頁。Radiopharmaceutical

RadiotherapyPrinciple當前9頁，總共99頁。Definition放射性核素標記化合物：它是指在化合物分子中引入可起示蹤作用的放射性核素，并保持原有化合物的理化和生物學性質(zhì)不變的一類化合物。

10當前10頁，總共99頁。本章內(nèi)容當前11頁，總共99頁。第一節(jié)基本概念12當前12頁，總共99頁。一、幾個重要參數(shù)1.放射性濃度：它是指單位體積的溶液中含有的放射性活度。以Bq/L或Bq/ml等表示。2.放射化學純度：指所指定的放射性標記化合物的放射性活度占該樣品的總放射性活度的百分比。要求放化純度要達到95%以上放化純度(%)=(標記物的放射性活度)/(樣品總的放射性活度)×100%放射性示蹤實驗是以測量放射性的蹤跡來顯示該物質(zhì)的行蹤的，如果示蹤劑中含有放射數(shù)雜質(zhì)，就會使實驗結(jié)果紊亂，甚至失敗。放射性雜質(zhì)不僅可以從原料及制備過程中引入，而且也會隨著標記物貯存時間的延長而逐漸產(chǎn)生。因此不僅制備標記化合物時得要進行純化分離，而且在貯存過程中仍要密切監(jiān)測它的放射化學純度，特別是高比活度的氚標記化合物。13當前13頁，總共99頁。3.放射性比活度對比活度的要求因使用目的而異：一般用于競爭結(jié)合分析法測定微量物質(zhì)時要求比活度高，以提高分析方法的靈敏度。作為示蹤劑用于觀察某些物質(zhì)的體內(nèi)過程時，則要求盡量接近生理狀態(tài)下的用量而同時具有可測量的放射性活度。過高或過低均不好：放射線比活度越高，示蹤的靈敏度也越高，但制備和使用高比活度標記物，有如下因素的限制：一是受原料比活度和制備方法的限制；二是比活度愈高，制備操作難度愈大；三是比活度高時，特別是氚標記物，易引起輻射自分解，還會對被示蹤的機體產(chǎn)生毒性(如研究對象的細胞損傷和蛋白變性)，影響實驗結(jié)果。過低的比活度因其靈敏度過低而達不到預期的實驗目的。單位質(zhì)量（摩爾、容積）物質(zhì)所含放射性的多少，后者常稱為放射性濃度。單位：MBq/mg、GBq/mg、TBq/g或MBq/mmol、GBq/mmol、MBq/ml。14當前14頁，總共99頁。3.放射性比活度放射線核素的理論比活度:當該種核素的豐度是100%時其放射性活度。它的大小只取決于核素的半衰期。A理論=λ×N阿伏加德羅常數(shù)=0.693/T1/2×6.02×1023標記化合物的放射性比活度:該化合物上的放射線核素活度(Bq)

化合物質(zhì)量(g)或摩爾數(shù)(mol)A=15當前15頁，總共99頁。4.化學純度:指某一化學形式存在的物質(zhì)量在該樣品的總重量中所占的百分比。5.放射性核素純度：是指特定的放射性核素的放射性活度占總放射性活度的百分數(shù)，表示為：放射性核素純度(%)=(特定的放射性核素的活度)/(樣品的總放射性活度)×100%

一般要求放射性核素純度要達到99%以上。16當前16頁，總共99頁。6.標記位置及命名:標記化合物命名，通常先指出標記部位再指出標記核素，最后列出化合物名稱，三部分中以二短橫線相聯(lián)，如：1-14C-醋酸。17當前17頁，總共99頁。二、同位素標記與非同位素標記同位素標記：指化合物中的某一穩(wěn)定核素被其放射性同位素置換的方法。如用3H取代化合物分子中的1H。非同位素標記：采用并非原化合物所含元素的放射性核素(一般選用性質(zhì)比較接近的放射性核素)進行標記的方法。如蛋白質(zhì)用131I或125I標記，所得標記物與原來化合物不完全相同。18當前18頁，總共99頁。19當前19頁，總共99頁。三、定位標記與非定位標記定位標記：指標記原子標記在化合物的指定位置上，以符號“S”表示。例如1(S)-14C-醋酸、2(S)-14C-醋酸，前者表示14C標記在醋酸羧基碳上，即CH3-14COOH，后者則標記在甲基碳上，即14CH3-COOH，兩者所能示蹤的基團不同，制備二者的合成路線也完全不同。20當前20頁，總共99頁。三、定位標記與非定位標記非定位標記：標記原子的結(jié)合部位無法確定。分為均勻標記和全標記。均勻標記：指放射性原子均勻地分布于分子中，以“U”表示。如用14CO2通過植物光合作用制得的14C-葡萄糖其中分子六個碳原子從統(tǒng)計學上看被均勻標記上14C，故可寫成14C-葡萄糖(U)或u-14C-葡萄糖。全標記：是指放射性核素的原子隨機地無嚴格定位地分布于被標記化合物分子結(jié)構(gòu)上，以“G”表示。如G-3H-膽固醇，標記分子中的所有氫原子都可被取代，但機率各不相同。非定位標記化合物不能用于觀察分子上特定基團或原子的去向，而只是代表整個分子的代謝、分布等狀況。非定位標記可以得到較高的比活度．因為在一個分子中，可能存在幾個標記原子，且制備方法的選用面也較寬準定位標記21當前21頁，總共99頁。22當前22頁，總共99頁。四、雙標記與多標記雙標記：在化合物分子的不同部位，引入兩種不同的放射性核素原子(如3H和14C)或引入一種元素的兩種同位素原子。雙標使得人們可以在同一機體或離體組織中同時觀察兩個指標。它們在示蹤應用時，可在同一機體或離體組織中同時觀察兩個指標，不僅減少工作量，還可排除和減少由于個體差異所引起的實驗誤差．在研究化合物的不同代謝物在代謝中的相互關(guān)系、動力學過程以及生物反應機制等問題中，雙(多）標記示蹤劑能解決一般示蹤實驗不易解決的問題。23當前23頁，總共99頁。放射性核素標記化合物，除了與相應的非標記化合物具有同樣的化學、生物學特性外，更由于分子中引入了放射性原子，增加了不穩(wěn)定因素：1）放射性衰變引起的不穩(wěn)定性；2）由放射線引起的輻射自分解；3）由于標記位置不牢固或外界因素的影響，引起放射性原子脫落或定位標記物中放射性原子發(fā)生位移等造成不穩(wěn)定性。一般來說，放射性原子應標記在分子中牢固的、不易脫落的位置，對于14C、35S．13N、32P等放射性核素，標記物位置都比較穩(wěn)固，而3H在分子中往往不穩(wěn)定，即使與碳原子相連的氚，由于鄰近基團等影響，與水的交換率可以很明顯，如苯環(huán)上與羧基處于鄰位或?qū)ξ坏碾霸蛹疤蓟撂忌系碾霸佣疾环€(wěn)定。五、標記化合物的不穩(wěn)定性當前24頁，總共99頁。第二節(jié)

放射性核素標記化合物的制備25當前25頁，總共99頁。一、放射性核素的選擇不改變原有化合物的理化和生物學性質(zhì)；結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好；有合適的半衰期；射線容易測量；其它：是否容易標記、價格是否可以接受、射線是否容易防護。26當前26頁，總共99頁。二、放射性核素的來源在發(fā)現(xiàn)人工核反應前，放射性核素都是從天然放射性鈾釷礦物中分離提取，由于品種不多，且特性不適于醫(yī)用，故應用有限。自從發(fā)現(xiàn)人工核反應及加速器和反應堆問世以后，人們才有可能生產(chǎn)許多品種的放射性核素。目前，醫(yī)用放射性核素主要通過人工核反應，從反應堆和加速器中生產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計，全世界所生產(chǎn)的放射性核素中，約有80％一90％用于醫(yī)學。不論用反應堆還是加速器所生產(chǎn)的放射性核素，都必須經(jīng)過必要的分離、純化等放射化學處理，經(jīng)鑒定放射核純度合格，并測定比活度后，才能供使用。27當前27頁，總共99頁。二、放射性核素的來源(一)反應堆生產(chǎn)放射性核素1.利用中子引起的核反應：用中子轟擊穩(wěn)定性核素是獲取人工放射性核素的來源之一。能量較低的中子，核反應后，俘獲中子而放出γ光子，如(n、γ)反應；能量較高的中子，核反應后，釋放帶電粒子如質(zhì)子或α粒子等。

23Na+10n(低)→24Na+γ或23Na(n.γ)24Na

6Li+10n(高)→3H+4He或6Li(n、α)3H2.核裂變產(chǎn)物燃料廢料中分離提?。汉朔磻阎兴煤巳剂?35U或239po，在其裂變過程中可產(chǎn)生許多放射性核素，供醫(yī)用的有：99Mo、131I、132I、133Xe和137Cs等。28當前28頁，總共99頁。二、放射性核素的來源(二)加速器生產(chǎn)利用加速器將質(zhì)子或氘核等粒子加速后，用其轟擊穩(wěn)定性核素而得到放射性核素。這類放射性核素的衰變方式多為正電子發(fā)射或電子俘獲。生產(chǎn)醫(yī)用放射性核素的加速器主要是回旋加速器。生產(chǎn)的11C、15O和13N等放射性核素的T1/2相當短，用處極大。29當前29頁，總共99頁。三、制備放射性標記化合物要考慮的因素放射性核素的獲取及其價格：起始原料通常是由反應堆生產(chǎn)的無機物標記物的穩(wěn)定性：做示蹤劑的化合物穩(wěn)定；標記原子所在的位置也要牢固微量操作技術(shù)：一般在毫克或微克級水平進行冷試驗：即用非放射線原料代替放射性原料的模擬實驗30當前30頁，總共99頁。由人工核反應所制得的放射性核素，一般均為簡單比合物，如3H2、Ba14C03、Na125I等。為了得到合適的分析試劑或示綜劑，還需進一步以簡單放射性化合物為原料，制備所需的放射性標記化合物。制備標記化合物的基本方法有同位素交換法、化學合成法、生物合成法及絡(luò)合物/螯合物生成法等方法。四、放射性標記化合物制備的基本方法31當前31頁，總共99頁。四、放射性標記化合物制備的基本方法1、同位素交換法放射性核素與要標記的化合物中同一元素的穩(wěn)定同位素相互交換來制備放射性標記化合物的方法。優(yōu)點：方法簡便，易于操作。適宜于稀有、結(jié)構(gòu)復雜的有機化合物的標記。缺點：無進行定位標記，且有機化合物主鏈上的原子無法標記，標記物的比放射性低。32當前32頁，總共99頁。四、放射性標記化合物制備的基本方法1、同位素交換法放射性核素與要標記的化合物中同一元素的穩(wěn)定同位素相互交換來制備放射性標記化合物的方法。如：制備[G-3H]-河魚屯毒素

可逆反應，反應速度的快慢與反應條件有關(guān)，常以交換半值期作為選擇最適反應條件的指標。一般反應3-5個半值期即可。交換半值期的物理意義：產(chǎn)物的濃度等于交換反應達到平衡時產(chǎn)物濃度的1/2所需時間。影響交換反應速率的因素：溫度、酸度、壓力，所用溶劑性質(zhì)，反應的濃度及選用合適的催化劑等。33當前33頁，總共99頁。同位素交換法的優(yōu)缺點優(yōu)點：方法簡便，易于操作：不需制備前體，無復雜的合成步驟，待標記的化合物用量少(一般為mg級)，更適用淤標記稀有昂貴的復雜有機化合物，如反應條件選擇適當，也可獲得較高放射性活度與比活度，放射性核素利用率也可以很高。缺點：a.化合物的中心原子（如有機化合物主鏈上的原子）不易用交換法標記，所以用交換法制備標記化合物，最常用的放射性核素是氚和放射性碘，而14C標記化合物由于反應條件要求高，就不易用此法制備。b.如果在通常條件下，即不加溫、不用特別的pH或不用催化劑等，就能交換的系統(tǒng)，亦不能用于制備標記化合物，因為這樣的標記物，在一般生理條件下，標記原子亦易交換下來．c.如一個分子中有幾個位置可以交換時，則標記位置不易有專一性．同樣，

d.原料如含有雜質(zhì)，且也含可交換位置，就會形成放射性雜質(zhì)，故應特別注意同位素交換反應中待標記物的純度．當前34頁，總共99頁。四、放射性標記化合物制備的基本方法2、化學合成法通過各種化學反應，將放射性核素引入到待標記化合物特定位置上的標記方法。優(yōu)點：可以選擇標記的核素、標記的位置（定位標記）、比放射性可以嚴格控制（比活度高），分離提純?nèi)菀祝兌雀撸?。缺點：步驟多、流程長、費時費力。35當前35頁，總共99頁?；瘜W合成法化學合成制備標記化合物最主要的方法，此法基于化學合成反應的原理，利用簡單的放射性化合物作原料來制備所需的標記化合物．原則上凡能用化學合成法合成的化合物，均可用化學合成法制備標記化合物，其機理和方法與一般化合物合成沒有本質(zhì)區(qū)別。然而，畢竟制備的是放射性核素標記物，且在標記位置、活度、放化純度等方面有特殊要求，因而與普通化學合成又有許多不同處：首先，在選用原料方面，制備標記化合物的起始原料大多只能用簡單的無機物；其次，在選擇合成路線時，要根據(jù)所需要的標記位置專門設(shè)計，力求使標記原子在分子中較穩(wěn)定的位置或特定的位置上，并需考慮如何使放射性得率最高；另外，制備高比活度的標記化合物，需采用微量合成及分離純化技術(shù)，一般需設(shè)計專門的微量合成裝置，盡量采用低溫、真空技術(shù)和避免高溫、高壓等劇烈反應，以減少放射性沾污。當前36頁，總共99頁?；瘜W合成法化學合成法一般都應用非標記物進行充分的預試驗(常稱冷試驗)，以選定最合適的制備路線及反應條件。本法能獲得高比活度、高純度而又是定位標記的標記化合物，這是其他制備方法所不能同時達到的，因此它是制備標記化合物的最主要方法。當前37頁，總共99頁。四、放射性標記化合物制備的基本方法3、生物合成法是利用生物(動植物或微生物)的生理代謝或酶的生物活性，將簡單的放射性物質(zhì)在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)化成所需的放射性標記物。如14CO2→加入藻類細胞中→產(chǎn)生的蛋白，含有16種標記的氨基酸。生物合成法又可分為“全生物合成”和“酶促合成”二類。前者常使用完整生物或某一器官的生理代謝進行生物合成標記，后者則利用生物組織中某種特定的酶，促進合成反應。以上二者，都是對某些放射性標記物，特別是一些構(gòu)造復雜、化學合成難以制備或目前尚不可能制備的有機化合物進行標記的有用手段．38當前38頁，總共99頁。3、生物合成法優(yōu)點：可完全保留標記物原有的生物活性和旋光性，特別適合作生物示蹤應用，可制備一些構(gòu)造復雜、化學合成難以完成或目前尚不可能制備的有機物，如某些蛋白質(zhì)、多糖、核酸、激素、生物堿及苷類等。缺點：1）生成物復雜，后續(xù)分離純化步驟比較繁雜，放射性原料的利用率往往較低；2）除非所用原料的結(jié)構(gòu)已接近生成物，否則很難標記在某一特定位置上；3）標記率比較低酶促合成是近年來很受注意的一種標記技術(shù)，對制備一些生物活性物質(zhì)的定位標記物有一定發(fā)展前途，產(chǎn)品比活度也可較高，前提是必須有特異性高的酶制劑和高比活度的底物。39當前39頁，總共99頁。四、放射性標記化合物制備的基本方法4、絡(luò)合物/螯合物生成法將放射性金屬離子與特定的化合物進行絡(luò)合和螯合反應，標記到化合物分子上的方法。優(yōu)點：快速、定量、操作簡易。臨床上最常用的方法。缺點：對標記化合物的活性影響較大。40當前40頁，總共99頁。第三節(jié)

幾種常用放射性標記化合物的制備41當前41頁，總共99頁。常用放射性標記化合物的制備14C標記化合物的制備氚標記化合物的制備放射性碘標記物的制備32P、33P和35S標記化合物的制備核酸和反義核苷酸的標記當前42頁，總共99頁。同位素交換法、化學合成法、生物合成法(2)制備：(1)核素特點：＊一、14C標記化合物的制備C處于化合物結(jié)構(gòu)的骨架地位43當前43頁，總共99頁。14C標記化合物的化學合成常以Ba14CO3或14CO2為起始原料，由這些原料經(jīng)一步或兩步反應制備簡單的14C標記化合物，這些中間體經(jīng)常使用，有商品供應。如以Ba14CO3為原料制備14C-丙氨酸：44當前44頁，總共99頁。全生物合成最常采用的生物是細菌、綠藻、酵母等，這些低等生物代謝活潑，繁殖迅速，容易迅速低將簡單的放射線原料(例如14CO2)摻入到細胞內(nèi)。如利用蛋白質(zhì)含量較高的小球藻在14CO2的環(huán)境中進行光合作用，使14CO2摻入到細胞內(nèi)，生成含有14C的蛋白質(zhì)、核酸及多糖14C標記化合物的生物合成45當前45頁，總共99頁。2.酶促合成利用某些特定的酶通過一步或幾步反應，將標記前身物轉(zhuǎn)化為所需要的標記產(chǎn)物。例如：關(guān)鍵：有相應的前體和合適的酶14C標記化合物的生物合成46當前46頁，總共99頁。優(yōu)點：來源豐富，可在反應堆大量生產(chǎn)；弱β-,射程短(4.5~6mm),無需外輻射防護；放射自顯影分辨率高，可觀察亞細胞形態(tài)標記簡單，得率高、比活度高；T1/2長（12.33年）、易運輸、貯存和安排實驗。不足：C-H不如C-C牢固，易脫落；高比活度的氚標記物容易發(fā)生輻射自分解；同位素效應，注意標記位置遠離反應部位。二、氚(3H)標記化合物的制備(1)核素特點：47當前47頁，總共99頁。二、氚(3H)標記化合物的制備(2)制備：同位素交換法、化學合成法、生物合成法氚氣暴射交換溶液中的催化交換催化加氚法催化鹵素置換法氚化金屬還原法48當前48頁，總共99頁。3H同位素交換法：直接將3H氣體引入待標記分子中進行同位素交換反應。3H同位素交換法氚氣暴射交換溶液中的催化交換故不常用！優(yōu)點：簡單、方便。缺點：易標記在不穩(wěn)定位置上、化學鍵易斷、反應時間較長、比活度低、純化困難。49當前49頁，總共99頁?；瘜W合成法是目前制備高比活度的氚定位標記的最成熟、最重要的方法。需要：1）合適前體：常用烯烴、炔烴、有機鹵化物、腈及羧基化合物等；2）還原劑：氚氣以及氚化金屬，如NaBT4、LiBT4、KBT4、LiAlT4等?；瘜W合成法催化加氚法催化鹵素置換法氚化金屬還原法50當前50頁，總共99頁?；瘜W合成法之催化加氚法將含有不飽和鍵的前體（烯烴、炔烴、有機鹵化物、腈及羧基化合物）溶解后在催化劑作用下和氚氣反應數(shù)小時51當前51頁，總共99頁?；瘜W合成法之催化鹵素置換法在催化條件下，氚很容易與溴、碘原子發(fā)生置換反應（常加入少量有機胺類，中和反應產(chǎn)物鹵化氚，有利于反應進行）52當前52頁，總共99頁?；瘜W合成法之催化鹵素置換法用氚化金屬還原劑，如NaBT4、LiBT4、KBT4、LiAlT4等，它們可以選擇性地將羧酸、酯、酮、醛和腈類化合物還原成相應的醇類或胺類而實現(xiàn)定位標記53當前53頁，總共99頁。主要根據(jù)“酶促反應”的原理，以氚的標記物為底物，利用專一性很強的酶作為催化劑，將該標記物轉(zhuǎn)化成所需的另一種標記物生物合成法能定位標記，而且保留生物活性54當前54頁，總共99頁?！獭獭倘⒎派湫缘鈽擞浕衔锏闹苽?5當前55頁，總共99頁。125I

T1/2＝60d標記物儲存應用一段時間、商品化低能γ射線，無β粒子輻射分解少，標記物穩(wěn)定性好三、放射性碘標記化合物的制備56當前56頁，總共99頁。CONHCH2COOHICONHCH2COOH131I+Na131IKIO3H+131I－鄰碘馬尿酸(一)同位素交換法HOIHO131I

Na131I150℃1h131I－6－膽固醇57當前57頁，總共99頁。(二)蛋白質(zhì)、多肽的碘標記技術(shù)前提：1）待標記物要有易被碘原子結(jié)合或取代的基團，對蛋白質(zhì)和多肽而言，最主要是酪氨酸，它易被碘化的部位是苯環(huán)上羥基的兩個鄰位。組氨酸和色氨酸殘基也有一定活性。（箭頭）2）必須先把125I-氧化成125I258當前58頁，總共99頁。Na125IHOCH2CHCOOHCH2CHCOOHHO125I+125I2NH2NH2125I－碘代酪氨酸氧化劑

Ch-T，H2O2標記原理：(二)蛋白質(zhì)、多肽的碘標記技術(shù)59當前59頁，總共99頁。蛋白質(zhì)、多肽的碘標記常用方法1、直接標記法氯胺-T法乳過氧化物酶法固相氧化法2、間接標記法60當前60頁，總共99頁。61當前61頁，總共99頁。1.氯胺T法SO2NCH3NaCl+2Na125I+2H2OSO2NHCH3+125I2++NaCl2NaOH溫和氧化劑62當前62頁，總共99頁。⑴反應液組成：

Na125I74MBq（10μL）

蛋白質(zhì)5μg（10μL）

緩沖液（pH7.4）30μL

氯胺T100μg（10μL）

室溫1~3min⑵加Na2S2O5200μg（0.2mL)中止反應⑶用SephadexG50柱層析分離純化

125I-蛋白質(zhì)63當前63頁，總共99頁。64當前64頁，總共99頁。氯胺-T是較強的氧化劑，對一些生物活性不穩(wěn)定的物質(zhì)，例如一些補體成分、某些激素、酶和受體都有一定的損傷65當前65頁，總共99頁。2.乳過氧化物酶法乳過氧化物酶

+H2O2O2（新生氧）標記原理：Na125I125I266當前66頁，總共99頁。⑴反應液：Na125I37MBq（10μL）

緩沖液（pH5.6）30μL蛋白質(zhì)5μg（10μL）乳過氧化物酶25ng（10μL）H2O2200ng

（10μL）室溫7min⑷巰基乙醇（10mmol/L）0.5mL(中止反應)⑵H2O2200ng

（10μL）室溫7min⑶H2O2200ng

（10μL）室溫7min⑸加入NaI載體溶液,用SephadexG50柱層析分離純化

125I-蛋白質(zhì)67當前67頁，總共99頁。注意事項：1.乳過氧化物酶使用前新鮮配制2.H2O2保持低濃度：<0.1mmol/L3.酶的濃度↑，標記率↑酶的用量<1%標記蛋白↓酶自身碘化而引入的放化雜質(zhì)68當前68頁，總共99頁。乳過氧化物酶-葡萄糖氧化酶法(LPO-GO)葡萄糖氧化酶＋葡萄糖H2O2標記原理：乳過氧化物酶O2（新生氧）Na125I125I269當前69頁，總共99頁。⑴反應液：Na125I37MBq（10μL）

緩沖液（pH7.0）30μL蛋白質(zhì)5μg（10μL）乳過氧化物酶25ng（10μL）葡萄糖氧化酶10ng

（10μL）室溫4~20min葡萄糖(0.5%)5μL(2)0.1%疊氮鈉100μL中止反應(3)用Sephadex柱層析分離純化70當前70頁，總共99頁。4.固相氧化法固相酶法:將乳過氧化物酶等交聯(lián)在瓊脂糖凝膠上氯甘脲法:(Iodogen)NNNNOOClClClCl固相氧化劑（溫和）1,3,4,6-四氯

3a,6a-雙苯基甘脲71當前71頁，總共99頁。⑴1mg氯甘脲溶于25mL二氯甲烷，取50μL加入3mL試管中，用N2氣吹干，在試管底部形成氯甘脲薄膜

-20℃條件下可保存半年（Iodogen管）(2)試管中加入：

Na125I37MBq（10μL）

緩沖液（pH7.4）30μL蛋白質(zhì)5μg（10μL）室溫3min(3)取出反應液，上柱分離純化

125I-蛋白質(zhì)特點：標記率高，標記蛋白損傷少雜質(zhì)少，多為單碘化合物72當前72頁，總共99頁。二、73當前73頁，總共99頁。聯(lián)接標記法(Bolton－Hunter法)CH2CH2C－O－NHOOOO125I125ICH2CH2C－O－NOHOOO+NH2－CHC－OCH2CH2C－HOO125I125INH－CHC－O3－(對羥基苯)丙酸－N－琥珀亞胺酯125I－標記蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子末端氨基Na125ICh－T(聯(lián)接試劑)74當前74頁，總共99頁。室溫1~3min具體操作方法：⑴碘化：琥珀亞胺酯0.4μgNa125I74MBq氯胺－T50μg（10μL）Na2S2O5120μg（10μL)NaI2mg苯250μg(2)聯(lián)接:分離上述苯液，移入試管，用N2氣吹干后加入:蛋白質(zhì)10μgPB(pH8)50μL室溫10~30min甘氨酸(0.2mol)500μL0℃,5min(3)上柱分離純化125I-標記蛋白質(zhì)75當前75頁，總共99頁。優(yōu)點:二步操作，避免蛋白質(zhì)變性缺點:標記率低蛋白質(zhì)接上琥珀亞胺酯，分子較大，影響活性76當前76頁，總共99頁。14C標記化合物的制備氚標記化合物的制備放射性碘標記物的制備32P、33P和35S標記化合物的制備核酸和反義核苷酸的標記主要用于標記核苷酸當前77頁，總共99頁。第四節(jié)放射性標記化合物的純化和鑒定78當前78頁，總共99頁。沒有被標記上的游離放射性核素，如碘標殘存的125I；待標記物中雜質(zhì)亦被標記，如蛋白標記中的雜蛋白；標記后形成的雜質(zhì)，如在儲存期內(nèi)，或者由于標記物本身的不穩(wěn)定，或者由于輻射自分解，產(chǎn)品的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等可能發(fā)生變化而形成的放射性雜質(zhì)，所以標記結(jié)束一段時間后再用的化合物需要進行重新的純化鑒定。一、放射性雜質(zhì)的來源放射化學純度要高(>95%)，在示蹤過程中要穩(wěn)定79當前79頁，總共99頁。標記率：指放射性核素被標記到待標記化合物上的量占放射性總的投入量的百分比。標記率(%)=標記物的放射性/投入的總放射性×100%測定方法：最常用紙層析或薄層層析法，對于生物制劑有時也用柱層析或蛋白沉淀法。二、標記率的測定80當前80頁，總共99頁。常用測定方法：1、紙層析法：混合樣品中各組分的性質(zhì)不同，在固定相上的吸附能力和在流動相中的溶解度不同，因此它們各自的移動速度不同，可在特殊紙片上分離開。

常用比移值Rf表示各組分的移動速度快慢。意義：某標記物的Rf值在相同條件下穩(wěn)定不變。Rf=待測組分到原點的距離I

流動相前沿到原點距離L當前81頁，總共99頁。標記率測定之分段測量法82當前82頁，總共99頁。標記率測定之放射線掃描法83當前83頁，總共99頁。展開實驗注意問題層析紙長度，一般20cm左右，越長分離越好；展開劑要精心設(shè)計，選2-3種進行驗證。要求：能把混合物很好的分開，用時還要組成簡單，粘度小，展開快，展開后易揮發(fā)，價格低，易購買。點樣斑大小適當。點樣斑不能碰到展開劑的液體。層析缸要有蓋，減少干擾。當前84頁，總共99頁。分段測量，段的大小要一致；起跑點所在段也要測量；高比活度樣品點要加載體，減少吸附；避免反復點樣，層析紙要自然晾干；最好能用標準樣品做對照；各段劑量值必須減本底。85當前85頁，總共99頁。2、薄層層析法：硅膠或氧化鋁（固定相）：根據(jù)混合物各組分的吸附力和分配系數(shù)不同而分開。離子交換樹脂（固定相）：根據(jù)各組分離子電荷的性質(zhì)和數(shù)量不同而分開。聚酰胺：以各組分氫鍵吸附能力不同而分開。當前86頁，總共99頁。常用方法：1.層析法（1）紙層析（2）薄板層析（3）柱層析（如凝膠過濾層析、離子交換層析和親和層析）2.透析法3.電泳法三、標記物的分離純化87當前87頁，總共99頁。1.層析法（1，2）紙層析法和薄板層析法：原理和操作與標記率的測定類似，最后，根據(jù)標準品所顯示的位置，將純化產(chǎn)品剪下（紙）或刮出（板），用適當?shù)娜軇ㄋ蛞掖嫉龋?，將標記物浸泡提取出來，并進行鑒定。特點：簡便、快速，但僅能適用于少量體積的樣品的純化。88當前88頁，總共99頁。（3）柱層析法：原理：將固定相裝在一定體積的玻璃柱（或金屬柱）中，層析柱經(jīng)處理之后，將樣品加到固定相之上，然后用洗脫液淋洗，樣品中的各種化合物，或者由于吸附、分配的差異，或者由于離子荷電的差異，或者由于分子量的差異等等，從層析柱上被淋洗出來的速度有所不同，各組分的洗出也有先后，從而達到分離的目的。89當前89頁，總共99頁。（3）柱層析法：根據(jù)被純化物的性質(zhì)，采用不同內(nèi)容的層析柱和選擇合適的淋洗條件：凝膠過濾層析法：本法是利用具有分子篩效應的多孔網(wǎng)狀凝膠來分離不同分子量的化合物。由于小分子物質(zhì)可進入凝膠粒子的網(wǎng)孔內(nèi)部，而較大分子物質(zhì)進不去，因此，在淋洗層析柱時，小分子物質(zhì)推進速度慢，而大分子物質(zhì)卻沿著凝膠粒子間的縫隙最先被洗脫出來，從而達到分離的目的。凝膠主要有三類：sephadex交聯(lián)葡聚糖多孔凝膠；sepharose或biogel-A瓊脂糖珠；biogel-P聚丙酰胺90當前90頁