細菌分離與鑒定方法

關于細菌分離與鑒定方法第1頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五分離方法用途:在檢查含兩種或兩種以上的待檢材料（如肝、脾、腎、心、肌肉等）中的某種細菌時，須先將待檢材料進行分離培養(yǎng)。常用的分離培養(yǎng)方法是瓊脂平皿分區(qū)劃線法，是借劃線將混雜的細菌在瓊脂平皿表面分散開來，使個別的細菌能固定在某一點，經(jīng)培養(yǎng)生長繁殖后形成單個菌落，以達到分離獲得純種細菌的目的。第2頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五分離方法具體操作方法如下：點燃酒精燈，右手執(zhí)筆式握持接種環(huán)（見圖1），在酒精燈火焰上燒灼接種環(huán)，待冷，取待測菌液一環(huán)。左手抓握瓊脂培養(yǎng)基平皿，用手掌將平皿的底固定，用手指將平皿的蓋略抬起一些，進行接種（見圖2）。或者，將平皿的蓋留在實驗臺上，盡量直立平皿靠近酒精燈火焰，右手持接種環(huán)在瓊脂表面的一端（即1區(qū)，約占整個平皿的1/6～1/5）涂布，劃線時，接種環(huán)與瓊脂表面呈30°～40°的角度輕輕接觸，利用腕力動作，切忌劃破瓊脂表面。燒灼接種環(huán)，待冷后，將接種環(huán)通過1區(qū)劃線數(shù)次，在2區(qū)作連續(xù)劃線，各線條間隔要小，但不能重疊。劃滿平皿的1/5～1/4區(qū)域，劃完2區(qū)不需燒灼接種環(huán)，繼續(xù)通過2區(qū)數(shù)次，在3區(qū)作連續(xù)劃線，如此反復至劃完整個平皿（如圖3）。第3頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五圖1接種環(huán)的握持方法圖2平皿的握持方法1區(qū)4區(qū)3區(qū)2區(qū)圖3劃線分離的方法左：分區(qū)右：培養(yǎng)后的結果第4頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五分離方法接種完畢，蓋好平皿蓋，在平皿底玻璃上用記號筆注明標本名稱、接種時間、接種者等。然后將平皿的底朝上，放置在37℃孵箱內孵育24h。取出后觀察瓊脂表面的菌落分布情況（見圖3），注意觀察最后1～2區(qū)內是否分離出單個菌落，并觀察記錄菌落特征（如菌落大小、形狀、透明度、色素等情況）。第5頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五爛鰓病病原菌平板劃線分離：

取病魚鰓絲一小塊，置于滴有無菌水的載玻片的邊緣，10分鐘，用接種環(huán)蘸水，在胰胨瓊脂培養(yǎng)基上劃線。腸炎病病原菌劃線分離：

用70%酒精棉球擦拭魚體，無菌條件下，取病魚的肝或脾或腎或心于普通營養(yǎng)瓊脂基劃線分離。赤皮病病原菌劃線分離：

用刀片刮除病灶腐爛部分后用接種環(huán)掛取病料，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上平板劃線。28℃培養(yǎng)24h。第6頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五細菌的生長狀況觀察原理◆細菌于適宜條件下在不同的培養(yǎng)基上生長，其生長狀態(tài)不同。不同細菌在同一種培養(yǎng)基中生長，生長特點也不相同。這些區(qū)別稱之為培養(yǎng)特征，是鑒別細菌和細菌分類的依據(jù)之一?！舭鸭毦臃N在固體培養(yǎng)基上，在適宜的條件下經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)，在培養(yǎng)基表面（或內部）形成肉眼可見的有一個細菌大量繁殖后而成的集團，稱之為菌落。不同細菌的菌落大小、光濁度、色澤均有其特征。第7頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五普通瓊脂平板

牛肉膏3.0g

蛋白胨10.0g

氯化氯化鈉（NaCL）5.0g

磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.0g

瓊脂15.0g

蒸餾水1000mL

混勻，加熱溶解，調PH至7.6分裝，112kPa高壓滅菌15min，冷卻至45℃傾注滅菌平板。直徑90cm平皿每皿傾入15～20ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基過少，劃線分離時細菌的營養(yǎng)較少，菌落生長過小，菌落形態(tài)不易觀察，培養(yǎng)基也易于干燥，不易在數(shù)天內對菌落形態(tài)進行觀察。第8頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五含糖培養(yǎng)基滅菌條件115℃，10～15分鐘一般培養(yǎng)基滅菌條件121℃，15～20分鐘第9頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五細菌的生長狀況觀察在無菌平皿中，倒入溶化后50℃普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每皿約20毫升，水平靜置待凝固。用接種環(huán)挑去待分離菌株分區(qū)劃線，28℃培養(yǎng)24h。菌落形態(tài)觀察：大?。阂院撩子?。形狀：圓形、不規(guī)則形、放射狀等。表面：光滑、粗糙、圓環(huán)狀、乳突狀等。邊緣：整齊、波形、鋸齒狀等。色素：有顏色，顏色，是否可溶等。透明度：透明、半透明、不透明。

嗜水氣單胞菌菌落為光滑、微凸、圓整、無色或淡黃色，有特殊芳香氣味。第10頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五氧化酶試驗原理

氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，系由細胞色素a和a3所組成，一般僅存于需氧菌和兼性厭氧菌中，它使細菌能利用氧作為氫的最終受體，使分子氧還原為過氧化氫，過氧化氫的積累會有毒性，固本試驗的陽性菌，不僅需氧而且能產(chǎn)生過氧化氫酶。氧化酶并不是直接與試劑起反應，而是先使細胞色素c氧化，然后此氧化型細胞色素c再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應，因而本試驗實際也是測定細胞色素c是否存在。第11頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五氧化酶試驗試劑

1%鹽酸二甲基對苯二胺水溶液或1%二鹽酸四甲基對苯二胺水溶液。方法

在干凈的培養(yǎng)皿中放一張濾紙，滴上二甲基對本二胺的1%水溶液，僅使濾紙濕潤即可，不可過濕。用白金絲接種環(huán)（不可用鎳鉻絲）取18～24小時的菌苔，涂抹在濕潤的濾紙上，在10s內涂抹菌苔現(xiàn)紅色者這為陽性，(四甲基對本二胺呈藍色)，10～60s現(xiàn)紅色者為延遲反應，60s以上現(xiàn)紅色者不計，按陰性處理。嗜水氣單胞菌為陽性。第12頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五氧化酶試驗注意事項二甲基對本二胺溶液易于氧化，一般于冰箱中儲存兩周。如溶液顏色轉紅褐色，則不宜使用。鐵、鎳等金屬可催化二甲基對苯二胺呈紅色，故不宜用以上材料取菌苔。如無白金絲，可用玻棒或滅菌牙簽取菌苔涂抹。在濾紙上滴加試液已剛剛濕潤為宜。如濾紙過濕，妨礙空氣與菌苔接觸，延長顯色時間，造成假陰性。第13頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五AHM鑒別培養(yǎng)

AHM為AeromonasHydrophilaMedium的縮寫。

用于可疑氣單胞菌菌落的鑒定。AHM鑒別培養(yǎng)基★成分

蛋白胨

5.0g

酵母提取物

3.0g

胰蛋白胨

10.0g

L-鹽酸鳥氨酸

5.0g

甘露醇

1.0g

肌醇

10.0g

硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H2O）

0.4g

枸椽酸鐵胺

0.5g

溴甲酚紫

0.02g

瓊脂

3.0g

蒸餾水

1000mL★制法

將各種成分（除溴甲酚紫外）溶化于1升水中，調pH6.7，加入溴甲酚紫，混勻煮沸。分裝于13×100mm試管，每管5.0ml，于121℃，滅菌15分鐘。（溴甲酚紫的有效pH范圍5.2～6.8，顏色變化：黃～紫）第14頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五AHM鑒別培養(yǎng)方法以接種針挑取可疑菌落，穿刺接種達于管底，置35±2℃培養(yǎng)18～24h，如反應不肯定，可繼續(xù)培養(yǎng)18～24h。氣單胞菌典型反應為培養(yǎng)基管底部為變黃，在接近于試管頂部有紫色帶出現(xiàn)。此表明反因為甘露醇陽性，肌醇陰性，鳥氨酸脫羧酶陰性（鳥氨酸脫羧產(chǎn)生腐胺，可使培養(yǎng)基由酸變堿）。有時僅在試管頂端部有輕微變黑，此表明是因分解半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫所致。沿穿刺線全部呈混濁狀，表明該菌具有動力。第15頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五吲哚試驗原理

細菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚(靛基質)，經(jīng)與試劑中的對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色。培養(yǎng)基

1%蛋白胨水水溶液：調pH7.2～7.6，分裝于1/3～1/4試管，115℃蒸汽滅菌30分鐘。Kovacs試劑

對二甲基氨基苯甲醛

5.0g

戊醇

75g（ml）

濃鹽酸

25ml第16頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五吲哚試驗方法將新鮮的菌種接種與上述培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24h。沿管壁緩緩加入3～5mm高的Kovacs試劑于培養(yǎng)液表面，在液層界面發(fā)生紅色，即為陽性反應。若顏色不明顯，可加4～5滴乙醚至培養(yǎng)基，搖動，使乙醚分散于液體中，將培養(yǎng)液靜置片刻，待乙醚浮至液面后，在加吲哚試劑。如培養(yǎng)液中有吲哚時，吲哚可被提取在乙醚層中，濃縮的吲哚和試劑反應，則顏色明顯。嗜水氣單胞菌吲哚試驗陽性第17頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五革蘭氏染色法由丹麥病理學家ChristainGram創(chuàng)立，用于細菌分類學研究。革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家ChristainGram氏創(chuàng)立的，用于細菌分類學研究。革蘭氏染色法是細菌學中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。第18頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五革蘭氏染色法基本原理用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。因細菌蛋白質等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用堿性染料（如美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠等）使其著色。當細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。第19頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五革蘭氏染色原理革蘭氏染色過程：（結晶紫）初染→（碘液）媒染→（95%乙醇）脫色→（番紅花紅）復染。初染：當用結晶紫初染后，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。媒染：碘作為媒染劑，它能與結晶紫結合成結晶紫一碘的復合物，從而增強了染料與細菌的結合力。脫色：當用脫色劑處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細菌結晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內，革蘭氏陰性菌結晶紫-碘的復合物比較容易被洗脫出來。復染：革蘭氏陽性細菌仍保留初染時的顏色，呈紫色。革蘭氏陰性菌呈紅色。第20頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五革蘭氏染色法原理

革蘭氏染色法之所以能將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細菌細胞壁的結構和組成不同決定的。

細菌細胞壁的結構G﹢菌：細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結構組成，細胞壁厚，結構致密，類脂質含量低，用脫色劑處理后，肽聚糖脫水而孔徑縮小，通透性降低，故革蘭氏染色后細菌仍保留初染時的顏色，呈紫色。Gˉ菌：其細胞壁肽聚糖層較薄，交聯(lián)度低，類脂含量高，故脫色時，類脂質被乙醇(或丙酮)溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫-碘的復合物比較容易被洗脫出來，用番紅花紅復染后，細菌被染上復染劑的顏色，即紅色。第21頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五革蘭氏染色法材料嗜水氣單胞菌，葡萄球菌革蘭氏染色液；載玻片；顯微鏡等。方法涂片：（1）取載玻片一張，試凈。（2）用滅菌的接種環(huán)取生理鹽水一滴，放于載玻片的中央（如被檢材料是液體，可不加生理鹽水）。（3）左手斜持菌種管，右手將菌種管棉塞稍加轉動，以便拔下。（4）右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌后，用右手小指拔開菌種管棉塞，管口通過火焰，用接種環(huán)取少量菌（切不可過多）。（5）管口再通過火焰，塞好棉塞。（6）將接種環(huán)上的細菌加到載玻片的水滴內，磨勻，涂成直徑約1厘米大小的薄薄菌膜。干燥：將玻片置于空氣中，使其自然干燥。固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）干燥后將涂片在火焰上緩緩通過三次，其目的是使細菌粘于玻片上，染色和沖水時不易脫落；且細菌為蛋白質，被熱凝固后可保持完整形態(tài)。固定時通過火焰1～2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。第22頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五革蘭氏染色法染色：初染→媒染→脫色→復染初染：加草酸結晶紫染液于標本上，使其覆滿標本，染1～2分鐘，水洗。媒染：滴加碘液沖去殘水，并保持碘液覆蓋1分鐘，水洗。脫色：加95%酒精于玻片上來回流動，傾去酒精。如此重復2～3次（約30秒）。水洗。

或用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色。約20～30秒鐘，立即用水沖凈酒精立即水洗。復染：加番紅花紅（沙黃液、稀釋復紅等），染約1分鐘。水洗、干燥。鏡檢：干燥后用顯微鏡觀察。革蘭氏陰性菌成紅色。革蘭氏陽性均呈紫色。以分散開的細菌革蘭氏染色反應為準。過于密集的細菌染色后常常呈假陽性。同法在同一載玻片上以大腸桿菌和葡萄球菌混合紙片，作革蘭氏染色對比。第23頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五革蘭氏染色法革蘭氏染色的關鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌被誤染為陰性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死及部分自行溶解，都常呈陰性反應。結果與思考在你所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和葡萄球菌被染成何種顏色？它們是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌？作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關鍵一步是什么？當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣能保證你的染色技術操作正確，結果可靠？G+G-另一判斷方法：取40ul3%NaOH滴加于潔凈的載波片上，用接種環(huán)刮去平板單個菌苔適量，在NaOH滴上研磨40S，用接種環(huán)挑起，若有拉絲現(xiàn)象，則為G-，否則為G+第24頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五糖發(fā)酵試驗原理各種細菌因含有發(fā)酵不同糖類的酶，所以分解糖類的能力各不相同，有的能分解多種糖類，有的僅能分解1～2中糖類，還有不能分解。細菌分解多糖類，如淀粉、菊糖等，因其分子較大，不能進入細菌細胞，必須被細菌分泌的胞外酶水解后，才能為細菌吸收利用。雙糖也要胞外酶水解為單糖后被細菌所利用。細菌利用的單糖主要有葡萄糖、果糖等，細菌發(fā)酵葡萄糖可產(chǎn)生丙酮酸，生成乳酸、琥珀酸、甲酸、乙酸等有機酸，并生成醇類和氣體（CO2和H2）。細菌分解糖類后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可因菌種的不同而異，有的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，有的則僅產(chǎn)酸，故可利用此特點以鑒別細菌。第25頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五糖發(fā)酵試驗培養(yǎng)基蛋白胨5.0g溴甲酚紫（0.04%）15ml蒸餾水1000mL,調PH至7.4,分裝，每瓶100ml每100ml蛋白胨水中分別加入葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷及水楊苷1.0g，充分溶解，分裝試管，106.44kPa高壓滅菌10min。方法以幼齡斜面培養(yǎng)物分別接種上述發(fā)酵管，28℃培養(yǎng)24h。凡試驗管顏色從紫色變?yōu)辄S色，表明細菌可發(fā)酵該種糖類，判為陽性。

嗜水氣單胞菌可發(fā)酵以上5種糖類。第26頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五脫脂奶平板試驗（酪蛋白胨化試驗）原理大部分細菌無直接分解蛋白質的能力，多是利用蛋白質的分解產(chǎn)物，如蛋白胨和氨基酸等為其氮源。細菌分解蛋白質是依賴于蛋白酶和肽酶的作用，前者為胞外酶，能水解蛋白質為多肽和簡單的肽，有時可釋放出少量氨基酸，其功用是使不能吸收的蛋白質變?yōu)榭梢酝溉刖毎麅鹊亩嚯幕虬被帷：笳邽榘麅让?，能水解肽類為氨基酸，大部分肽酶需要錳、鎂、鐵、鋅等離子作輔酶。酪蛋白不溶于水，被水解的產(chǎn)物則能被溶解而是培養(yǎng)基呈現(xiàn)出透明狀態(tài)。第27頁，共31頁，2023年，2月20日，星期五脫脂奶平板試驗（酪蛋白胨化試驗）培養(yǎng)基--脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板◆磷酸二氫鉀（KH2PO4）

10.0g◆氯化鉀（KC1）

1.5g

◆蔗糖