遼寧省蜱種鑒定技術(shù)規(guī)范（征求意見稿）

ICS67.120.30B50遼寧省地DB21方標(biāo)準(zhǔn)(報(bào)批稿)遼寧省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB21/XXXXX—XXXX前言本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口管理。(遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出，遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口)本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)、遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、沈陽市疾病預(yù)防控制中心、錦州醫(yī)科大學(xué)、東沃同泰(鳳城)生物工程有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：韓小虎，陳澤良，辛晴，姜峰，車金，孫莉，于東海，崔楊書翰，劉暢，金鑫，徐昭艷，陳瑤，吳旭，王大偉等。本標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳(沈陽市和平區(qū)太原北街2號(hào))，聯(lián)系電話準(zhǔn)起草單位通訊地址：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)(沈陽市沈河區(qū)東陵路120號(hào))，聯(lián)系電話：024-884871561DB21/XXXXX—XXXX遼寧省蜱種鑒定技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了遼寧省常見的5種蜱，即長角血蜱、嗜群血蜱、日本血蜱、森林革蜱、全溝硬蜱的采集、保存、形態(tài)學(xué)鑒定以及DNA條形碼鑒定技術(shù)。本文件適用于遼寧省蜱的種類鑒定，可輔助應(yīng)用于相關(guān)蜱傳病的監(jiān)測(cè)與防控。其中形態(tài)學(xué)鑒定最適用于形態(tài)完整且未飽血的成蜱；DNA條形碼技術(shù)適用于任何形態(tài)及不同發(fā)育階段的蜱，包括殘損蜱、飽血蜱、幼蜱、若蜱、成蜱、蜱卵。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文文件。TSN/T5337—2021動(dòng)物疫病傳播媒介蜱種類鑒定技術(shù)規(guī)范，20223術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。5樣品采集5.2設(shè)備與儀器無需儀器或設(shè)備。2DB21/XXXXX—XXXX5.3采集方法應(yīng)穿淺色、表面光滑的長袖實(shí)驗(yàn)服，扎緊褲腿或把褲腿塞進(jìn)鞋襪里，穿靴子，戴橡膠手套。裸露皮膚應(yīng)涂抹趨避劑如避蚊胺等。帳篷等露營裝備應(yīng)用殺蟲劑浸泡。避免在蜱棲息地如草地、樹林等環(huán)境中長時(shí)間坐臥。野外活動(dòng)結(jié)束后應(yīng)檢查衣物上是否有蜱。一旦發(fā)現(xiàn)蜱叮咬，用鑷子從叮咬處夾住蜱，順著叮咬方向小心取出，然后用碘伏或酒精反復(fù)擦洗；如果不慎將蜱的假頭基留在了皮膚內(nèi)，可用潔凈的針頭挑破傷口皮膚，挑出假頭基，再用碘伏或酒精反復(fù)擦洗。建議保留蜱，置于離心管(或其他密閉容器)內(nèi)4℃暫放(供醫(yī)生或?qū)I(yè)人士進(jìn)行鑒定)，建議盡快就醫(yī)(尤其是在有蜱傳病流行的地區(qū))。5.3.2畜禽體上蜱的采集在牛、羊、犬、禽等動(dòng)物身上采集蜱時(shí)，用干凈、尖細(xì)的鑷子盡可能靠近皮膚表面緩慢夾取蜱。盡量小心避免蜱的假頭基部分殘留在皮膚內(nèi)。將采集到的蜱放置到15ml或50ml離心管中。去除蜱后，用75%乙醇溶液對(duì)被蜱叮咬處進(jìn)行消毒。5.3.3環(huán)境游離蜱的采集在經(jīng)常放牧的草地、野生動(dòng)物巢穴及家養(yǎng)畜舍地面采集蜱，方法如下：布旗采集法：白絨布一邊穿入木棍，在木棍兩端系以長繩，在草地上或灌木從中緩慢拖動(dòng)，草地以及灌木上的蜱即可附著在旗面上。檢查并用鑷子收集于離心管中。直接采集法：在稍矮的草地，可將身體稍下蹲貼近地面，輕輕扶起草葉，觀察草葉背面是否有蜱；在稍高的草地，可直接觀察草尖處。發(fā)現(xiàn)蜱后用鑷子收集于離心管中；也可將葉子截?cái)噙B同蜱共同置入離心管內(nèi)，盡快赴實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行處置(草葉需盡快去除，以免霉?fàn)€)。5.3.4.衣物及布旗的處理用洗衣液以及常用消毒劑浸泡、洗滌并不能有效殺滅衣物、布旗中殘留的蜱及蜱卵。對(duì)于不需要重復(fù)使用的物品，可采用焚燒、煮沸或高溫蒸汽的方法。對(duì)于需要重復(fù)使用的個(gè)人衣物、布旗，除煮沸及高溫蒸汽法以外，也可用洗衣機(jī)的烘干功能進(jìn)行長時(shí)間高溫烘烤。5.4蜱樣本的運(yùn)輸及保存蜱樣本在車輛運(yùn)輸過程中應(yīng)置于車載冰箱4-8℃，避免將蜱長期置于密閉車廂內(nèi)，氣溫過高將導(dǎo)致蜱死亡變形。完整的蜱在4℃、干燥、避光環(huán)境下，可暫存2周以上。用于蜱種鑒定的蜱樣本，可置于離心管內(nèi)并加入過量的95%的乙醇溶液或無水乙醇浸泡，定期補(bǔ)充乙醇。容器上應(yīng)附有采集標(biāo)簽，注明采集地點(diǎn)、日期、宿主、生境、海拔、經(jīng)緯度、采集人等信息，避光陰涼處暫放，避免高溫與陽光直射。長期保存則需置于液氮中，或液氮冷凍1小時(shí)以上之后轉(zhuǎn)入-80℃冰柜保存。飽血蜱在室溫、干燥環(huán)境下可產(chǎn)卵，并且在一定時(shí)間內(nèi)孵化出幼蜱。3DB21/XXXXX—XXXX6形態(tài)學(xué)鑒定6.2設(shè)備與儀器6.3形態(tài)學(xué)觀察6.3.1用鑷子夾取或用小刷子掃取乙醇溶液中浸泡的蜱，放于吸水紙上吸去表邊的乙醇溶液后，放置在體視顯微鏡下觀察。6.3.2觀察蜱的背面觀、腹面觀、假頭基、須肢、肛溝等，再觀察氣門板、生殖孔、哈氏器等形態(tài)學(xué)特征部位。蜱具體形態(tài)特征部位參見附錄B。6.4蜱的形態(tài)學(xué)種類判定蜱可根據(jù)典型形態(tài)特征鑒定到屬和種，具體形態(tài)特征按照附錄C鑒定，其他不易觀察到典型形態(tài)特征或殘缺的蜱則需采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行種類的鑒定。7DNA條形碼鑒定除特別說明以外，本文件所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水應(yīng)符合規(guī)范性引用文件的規(guī)定。雙蒸水(應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格，按照附錄A.2配制)。7.1.5商品化的組織基因組DNA提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司貨號(hào)：DC102)。7.1.650×TAE(生工生物工程(上海)股份有限公司)。7.1.7GOODVIEWⅠ核酸熒光染色劑(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)。擴(kuò)增片段IF-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGGR-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGTF-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGR-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA4DB21/XXXXX—XXXX用雙蒸水將引物稀釋為20μmol/L工作濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。引物合成后采用滅菌雙蒸水稀釋為7.2設(shè)備與儀器CR7.2.2組織研磨器(杭州遂真生物技術(shù)有限公司)。7.2.3超凈工作臺(tái)(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)。7.2.4制冰機(jī)(蘇州連海制冷科技有限公司)。7.2.5水浴鍋(國華電器有限公司HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋)。7.2.6臺(tái)式小型離心機(jī)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司D1524R高速冷凍型微量臺(tái)式離心機(jī))。7.2.7常規(guī)冰箱(青島海爾股份有限公司)。7.2.8旋渦振蕩器(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司MX-S漩渦混勻器)。能生命科學(xué)有限公司TanonESP-60)。7.2.11微量可調(diào)移液器(10μL、100μL、1000μL)及配套吸頭(賽默飛世爾科技(中國)有限公7.3檢測(cè)方法參照7.1.5中所述試劑盒說明書，按要求提取蜱基因組，步驟如下：.3.1樣本的處理及核酸提取使用完整或不完整的成年蜱、幼蜱、若蜱、蜱卵樣品。將蜱樣品放置于1.5mL除酶離心管中，先顆研磨珠，再加入200μL滅菌雙蒸水，將研磨管放入組織研磨器中，12000r研磨5min，用移液器吸取200μL研磨液的上清液，采用DNA提取試劑盒提取蜱組織DNA。7.3.2PCR反應(yīng)體系反應(yīng)組分體積(μL)5雙蒸水1總體積7.3.3PCR擴(kuò)增程序PCR陽性對(duì)照：取-80℃保存蜱基因組DNA(附錄A.1)。PCR空白對(duì)照：加水替代基因組DNA。7.3.4瓊脂糖凝膠電泳5DB21/XXXXX—XXXX取5-10μL樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳(附錄A.3)。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀或者紫外透射儀觀察結(jié)果。.3.5結(jié)果判定核酸電泳判定16SDNA陽性對(duì)照，有460bp的擴(kuò)增條帶，同時(shí)陰性對(duì)照沒有相應(yīng)條帶，判定試驗(yàn)成立；否則試驗(yàn)無效，需分析并排除引起試驗(yàn)無效的因素，并重新試驗(yàn)。COⅠ基因陽性對(duì)照，有710bp的擴(kuò)增條帶，同時(shí)陰性對(duì)照沒有相應(yīng)條帶，判定試驗(yàn)成立；否則試驗(yàn)無效，需分析并排除引起試驗(yàn)無效的因素，并重新試驗(yàn)。在陽性、陰性對(duì)照都成立的前提下，若檢測(cè)樣品有460/670bp的條帶，則試驗(yàn)陽性；若檢測(cè)樣品無核酸測(cè)序序列比對(duì)分析“BLAST”按鈕開始進(jìn)行比對(duì)。在彈出的比對(duì)結(jié)果頁面中，以分值最高(MaxScore，一般為第一行)且序列相似度≥97%的蜱種為鑒定結(jié)果。8結(jié)果綜合判定8.1根據(jù)典型形態(tài)特征能夠鑒定到種的樣品，直接判定蜱種。8.2對(duì)于本身缺乏典型形態(tài)特征或部分典型特征的樣品，應(yīng)結(jié)合分子生物學(xué)DNA條形碼方法結(jié)果進(jìn)行蜱種鑒定。6DB21/XXXXX—XXXX附錄A(規(guī)范性)試劑的配制A.1陽性對(duì)照取蜱(成蟲、若蟲、幼蟲、卵)等，應(yīng)用商品化DNA提取試劑盒，提取基因組DNA，使用50μL滅菌雙蒸水溶解或洗脫基因組DNA，-80℃保存。A.2滅菌雙蒸水雙蒸水是重蒸水的一種，是將經(jīng)過一次蒸餾后的水，再次蒸餾得到的水。雙蒸水再經(jīng)過高壓蒸汽滅A.31×TAE緩沖液及1.5%瓊脂糖凝膠50×TAE緩沖液蒸餾水×TAE緩沖液瓊脂糖核酸染料將三角瓶放在沸水浴中加熱至瓊脂糖充分溶解，置室溫冷卻到50℃左右，加入核酸染液5μL，搖勻，倒入電泳板上，凝固后，4℃?zhèn)溆谩?DB21/XXXXX—XXXX附錄B(資料性)遼寧省主要蜱種的基本信息、典型形態(tài)圖及基本生物學(xué)特征B.1遼寧省主要蜱種的形態(tài)模式圖蜱總科(Ixodoidea)，包括硬蜱、軟蜱及納蜱三類，遼寧省常見蜱種為硬蜱(暫未發(fā)現(xiàn)軟蜱和納蜱)。(形態(tài)結(jié)構(gòu)見圖B1)B.2遼寧省主要蜱種的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)蜱背腹扁平，圓形或者橢圓形，身體分為假頭和軀體兩部分，假頭突出于軀體前或者位于軀體腹面前端，為口器部分。軀體腹部有4對(duì)足。蜱的軀體背腹面是否有幾丁質(zhì)的盾板及盾板形狀等是鑒別蜱種的重要特征。蜱的發(fā)育為不全變態(tài)，包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱四個(gè)階段，幼蜱只有3對(duì)足。B.3遼寧省主要蜱種的寄生部位8DB21/XXXXX—XXXX蜱通常寄生在動(dòng)物耳后、腳趾間、腋窩處以及頸項(xiàng)部等皮膚較薄、不易被搔動(dòng)的部位，寄生數(shù)量多時(shí)蜱在動(dòng)物全身可見。B.4遼寧省主要蜱種的宿主動(dòng)物蜱是重要的吸血性外寄生蟲，在蛻皮等發(fā)育時(shí)需要附著于宿主體表吸血。主要寄生在哺乳動(dòng)物體表，少數(shù)寄生在鳥類、爬行類及兩棲類體表。蜱在叮咬宿主、吸食血液的同時(shí)釋放毒素，可導(dǎo)致癱瘓、毒性反應(yīng)以及宿主的過敏反應(yīng)等。B.5遼寧省主要蜱種可導(dǎo)致的人獸共患病與動(dòng)物疫病蜱作為媒介可傳播、攜帶多種人畜共患病以及動(dòng)物疫病。遼寧省蜱傳播的疾病主要有：Q熱、立克次體病、萊姆病、兔熱病、牛環(huán)形泰勒焦蟲病、森林腦炎、克里米亞-剛果出血熱、粒細(xì)胞無形體病等。9DB21/XXXXX—XXXX附錄C(規(guī)范性)蜱科屬的形態(tài)學(xué)鑒定步驟C.1蜱科的確定(科檢索表)鑒定步驟鑒定特征鑒定結(jié)果1身體背面具幾丁質(zhì)盾板或假盾區(qū)；假頭向前，從背面可見；氣門板顯著，位于身體腹面，足基節(jié)Ⅳ的后外側(cè)；須肢各節(jié)幾乎等長，或第Ⅳ節(jié)收縮，內(nèi)陷于第Ⅲ節(jié)腔內(nèi)。表皮革質(zhì)，身體背面無盾板(原偽盾蜱屬的種類具革質(zhì)假盾區(qū)，但硬化程度不高)；假頭位于腹面前方，若蜱和成蜱從背面不可見；氣門板不明顯，位于足基節(jié)Ⅲ和Ⅳ之間的基節(jié)上褶上；須肢各節(jié)幾乎等長，第Ⅳ節(jié)不收縮，不內(nèi)陷，不近端點(diǎn)。軟蜱科(Argasidae)2雌蜱身體背面具皺褶；前端具乳突狀革質(zhì)假盾區(qū)，覆蓋物褶疊程度深；須肢3節(jié)，末節(jié)內(nèi)陷不明顯。納蜱科(Nuttalliellidae)身體背面具明顯堅(jiān)硬的盾板，雌蜱和未成熟蜱覆蓋背面前半部，雄蜱則覆蓋整個(gè)背部；除幾丁質(zhì)板附近，表皮上具有細(xì)小的褶或條紋；須肢第郁節(jié)收縮，內(nèi)陷在第Ⅲ節(jié)腔內(nèi)。硬蜱科(Ixodidae)DB21/XXXXX—XXXXC.2硬蜱科各屬的確定(屬檢索表)鑒定步驟鑒定特征鑒定結(jié)果1肛溝圍繞在肛門之前；無眼；雄蜱腹面幾乎全部被幾丁質(zhì)板覆蓋(共7塊)；幼蜱口下板后毛2對(duì)，背部無矢狀感器；通常為巢居性寄生，宿主不具專一性；雄蜱不吸血，分布廣泛。硬蜱屬(Ixodes)肛溝圍繞在肛門之后，通常很小；眼有或無；雄蜱腹面無幾丁質(zhì)板，或發(fā)育不完全，僅分布在身體后端(肛側(cè)板和副肛側(cè)板)；幼蜱僅1對(duì)口下板后毛，身體背部具矢狀感器；通常不穴居或巢居；雄蜱吸血，分布相對(duì)有地域性。無眼(尤其成蜱和若蜱)有眼32假頭基方形至矩形；須肢短，呈圓錐形，第II節(jié)長寬約等，其外側(cè)超出假頭基邊緣；幼蜱須肢3節(jié)，其背面矢狀感器前端具2對(duì)緣毛；宿主不具專一性。血蜱屬(Haemaphysalis)3氣門板正常，無脊或色斑；緣垛有或無，但不是9個(gè)，須肢長度近似等于假頭基，且第II節(jié)長與寬大致相等，有緣垛，雄蜱的第IV對(duì)足正常，假頭基矩形，通常有色斑。革蜱屬(Dermacentor)注：目前遼寧省內(nèi)，主要硬蜱科成員為全溝硬蜱，革蜱屬成員為森林革蜱，血蜱屬成員為長角血蜱、嗜DB21/XXXXX—XXXX附錄D(規(guī)范性)遼寧省主要蜱種形態(tài)鑒別特征D.1遼寧省主要蜱種形態(tài)鑒別特征DB21/XXXXX—XXXX參考文獻(xiàn)NT[3]李朝品，蜱螨與人類疾病.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，1995蜱屬蜱種性別腹面特征背面特征血蜱屬長角血蜱雌性肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)I只有一距。盾板僅占前部，無眼，假頭基矩形，須肢第二節(jié)后外角輕度或中度突出，須肢第三節(jié)背面后緣有一發(fā)達(dá)三角形尖刺。雄性肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)I只有一距。盾板覆蓋整個(gè)背面，無眼，假頭基矩形，須肢第二節(jié)后外角輕度或中度突出，須肢第三節(jié)背面后緣有一發(fā)達(dá)三角形尖刺。嗜群血蜱雌性肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)I只有一距，足基節(jié)II—IV內(nèi)距較基節(jié)I內(nèi)距顯著短。盾板僅占前部，無眼，假頭基矩形，須肢第二節(jié)后外角輕度或中度突出，須肢第二節(jié)與第三節(jié)外緣幾乎等長。雄性肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)I只有一距。盾板覆蓋整個(gè)背面，無眼，假頭基矩形，須肢第二節(jié)后外角輕度或中度突出，須肢第三節(jié)頂端向內(nèi)測(cè)彎曲，須肢合攏時(shí)交疊呈鉗狀。日本血蜱雌性肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)I只有一距，足基節(jié)II—IV內(nèi)距較基節(jié)I內(nèi)距稍短或等長。盾板僅占前部，無眼，假頭基矩形，須肢第二節(jié)后外角輕度或中度突出，須肢第