霍亂等感染性腹瀉實驗室檢測技術(shù)的課件

2023/3/31霍亂等感染性腹瀉

實驗室檢測技術(shù)東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/32感染性腹瀉的病原體種類很多，其中腸桿菌科常見致瀉菌有致瀉性弧菌、志賀氏菌、沙門氏菌，病原性大腸埃希氏菌：腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、腸集聚性粘附大腸桿菌(EAggEC)，腸產(chǎn)志賀樣毒素且具有侵襲力的大腸桿菌（ESIEC）和結(jié)腸類耶爾森氏菌。

下面對以上幾種常見感染性腹瀉的實驗室檢測技術(shù)進行簡要介紹。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/33致病性弧菌大腸桿菌志賀氏菌小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌空腸彎曲菌致腹瀉原蟲輪狀病毒東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/34致瀉性弧菌東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/35弧菌屬種類較多，已定名的有30多種，其中有12個種是人的致病性弧菌或從人的臨床標(biāo)本中分離得到，主要包括：霍亂弧菌、副溶血弧菌、河弧菌、擬態(tài)弧菌和麥?zhǔn)匣【?。弧菌屬中將與O1群霍亂弧菌具有共同鞭毛抗原，生化性狀相似，僅菌體抗原不同的弧菌統(tǒng)稱為霍亂弧菌。根據(jù)菌體抗原不同，將霍亂弧菌分成若干O血清群，目前已有200多個群，其中作為國際檢疫傳染病，霍亂的病原診斷，仍以檢出O1群或O139群霍亂弧菌為準(zhǔn)。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/36時間省份流行弧菌分型70年代山東散發(fā)地區(qū)：非流行株暴發(fā)點：小川1b和1d80年代83年以前稻葉1d84年以后小川1b為主,稻葉1d次之90年代90年-92年全國疫情處于低水平93年新疆O139局部暴發(fā)94年、98年山東小川1b為主（占99.2%）97年萊陽1株O139群霍亂弧菌2001年煙臺、濟寧O139群霍亂弧菌至今山東小川1b霍亂弧菌/小川1d，O139歷年福建、廣州、江蘇等小川1b/稻葉1d山東省及其他省份歷年霍亂弧菌分型狀況東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/37O1群和O139群抗原構(gòu)造與血清分型型別群特異性抗原型特異性抗原AO139BC小川+++少量稻葉+—+彥島+++O139—+——東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/38及時發(fā)現(xiàn)傳染源和盡快確定疫情，是撲滅霍亂的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，病人的早期發(fā)現(xiàn)，首先依靠臨床實驗室診斷和流行病學(xué)指征，從而為有效采取措施提供可靠依據(jù)。O1群和O139群霍亂弧菌的檢驗程序詳見下表。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/39O1群和O139群霍亂弧菌的檢驗程序快速診斷增菌培養(yǎng)（堿性胨水）分離培養(yǎng)TCBS、ABS（慶大霉素瓊脂等）標(biāo)本（糞便等）波片凝集陽性（結(jié)合菌落、菌體形態(tài)）凝集菌落或可疑菌落純培養(yǎng)（普通培養(yǎng)）鑒定分型確診報告第二次增菌（堿性胨水）初步報告10-20小時6-8小時10-20小時直接?xùn)|南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/310TCBS培養(yǎng)基上弧菌的生長情況菌種TCBS上出現(xiàn)的菌落(%)*評價綠黃霍亂弧菌（O1和O139群）＜199好擬態(tài)弧菌1000好梅契尼科夫弧菌0100可能降低霍利斯弧菌1000很差海魚弧菌95536℃時降低河弧菌0100好弗尼斯弧菌0100好溶藻弧菌0100好付溶血弧菌991好創(chuàng)傷弧菌90#10#好辛辛那提弧菌0100好*產(chǎn)生給予類型菌落的百分?jǐn)?shù)。#Hollis最初報道的蔗糖陽性率為3%，而收到的菌株中，蔗糖陽性率則比較高（15%）。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/311SPA霍亂診斷液使用說明

本診斷液為含A蛋白葡萄球菌菌液經(jīng)高效價霍亂抗血清致敏后制成，呈均勻混濁白色混懸液。供玻片凝集試驗用，可作為急性腹瀉病人的快速診斷和人群檢索時過篩之用。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/312使用方法：

1、取該診斷液1滴與被檢標(biāo)本等量混合，搖動玻片，3分種內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集定為初步陽性，應(yīng)再做下列步驟。2、取標(biāo)本約0.5毫升于小試管中，加熱煮沸，待冷卻后再作一次玻片疑集，如轉(zhuǎn)為陰性者應(yīng)判該標(biāo)本為陰性；如仍呈陽性，則判該標(biāo)本為陽性。3、對陽性標(biāo)本，同時進行涂片染色，如鏡檢為弧菌，則報告該試驗結(jié)果陽性。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/313注意事項：

1、SPA診斷液在使用前，先與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)液作玻片凝集，如出現(xiàn)凝集，證明可以使用，如未出現(xiàn)凝集，該診斷液不可再用。與陰性對照液（鹽水或PBS）不應(yīng)出現(xiàn)凝集，如凝集時亦不可再用。2、做協(xié)同凝集試驗所用的標(biāo)本，應(yīng)是水樣便或經(jīng)增菌后的培養(yǎng)物，不可用大便直接作凝集，以免影響結(jié)果判斷。3、本品應(yīng)放于4℃冰箱保存。用前需先作上述質(zhì)量檢查。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/314假陽性出現(xiàn)多原因：（2%）1、大便內(nèi)有雜質(zhì)、非特異性物質(zhì)的存在。2、操作不當(dāng)：

a、切勿直接用大便做凝集反應(yīng)。

b、增菌液中挑取菌膜下層的液體，勿直接挑取菌膜作凝集反應(yīng)。

c、挑取診斷液與增菌液的比例要適當(dāng)，挑取的量大一點，少了易干，干后貼在玻片上不易觀察結(jié)果。三分鐘后觀察凝集結(jié)果，但時間不宜過長。陰性對照要用生理鹽水，或直接用診斷液。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/3153、免疫血清沒通過其他弧菌吸收，難免有非特異性交叉凝集出現(xiàn)。免疫用菌株經(jīng)幾十年傳代發(fā)生變異，免疫血清效價降低。4、金黃色葡萄球菌傳代多次，發(fā)生變異，不易乳化，易出現(xiàn)沉淀，顆粒本身增大。5、觀察結(jié)果：凝集后液體清、不凝集，對照液液體混濁。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/316埃爾托型霍亂弧菌噬菌體——生物分型（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所）：為區(qū)別埃爾托型霍亂弧菌的兩類不同菌株（流行株和非流行株），對各種來源的菌株進行分型，可作為追溯傳染來源、傳播途徑和分析流行形式的流行病學(xué)工具之一。詳見手冊P61-64。

霍亂弧菌與有關(guān)細(xì)菌的鑒別見手冊P54-57。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/317噬菌體分型：根據(jù)5株國內(nèi)分離的弧菌噬菌體（VP1-VP5）將埃爾托型霍亂弧菌分成32個噬菌體型。對5株噬菌體全敏感的噬菌體1型菌株是最常見的流行株，但并非所有噬菌體1型菌株均為流行株。2型主要是1型的粗糙型，3-6型也屬流行株范疇。7型以后屬非流行株，對5株噬菌體全抵抗的是32型。非流行株僅引起散發(fā)病例，是一些疫區(qū)和非疫區(qū)自然水體中的主要菌型。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/318

近年來，O139群霍亂弧菌已成為霍亂流行的主要病原。通過研究證明，O139群霍亂弧菌可能是O1群ELtor生物型的變異株。從以下四點說明0139的特性，見下圖。

(1)抗原構(gòu)造(2)分泌腸毒素(3)耐藥性(4)臨床特點東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/319O139群霍亂弧菌和O1群弧菌特性對比*相關(guān)特性O(shè)139群弧菌O1群弧菌抗原構(gòu)造*有莢膜無莢膜分泌腸毒素均產(chǎn)生霍亂腸毒素，產(chǎn)毒量為10-80ng/ml（O139群在抑制狀態(tài)也可恢復(fù)產(chǎn)毒能力）耐藥性氯霉素、紅霉素、慶大霉素敏感鏈霉素、磺胺、復(fù)方新諾明耐藥四環(huán)素敏感耐受弧菌抑制劑呈抗性對高、低濃度均呈敏感反應(yīng)臨床特點住院病例85%嚴(yán)重危及生命、出現(xiàn)嚴(yán)重脫水，經(jīng)補液與四環(huán)素治療病程為2天。（01群免疫力者對0139無免疫力）東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/320

O139群霍亂弧菌和O1群弧菌二者生物型既有區(qū)別又有聯(lián)系，最大區(qū)別是莢膜和O1群生物合成基因的有無。這些提示說明O139群霍亂弧菌不是O1群ELtor生物型簡單的點突變，可能存在更復(fù)雜的突變機制。二者是否只有個別基因和表型的差異以及是什麼原因?qū)е铝诉@些差異（尤其是O139群表面莢膜的出現(xiàn)）還有待于進一步的研究。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/321大腸桿菌東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/322一、分類

到目前為止,所發(fā)現(xiàn)的對人類有致病作用的大腸埃希氏菌已有六個種別，即:

腸道致病性大腸桿菌(EPEC)腸道侵襲性大腸桿菌

(EIEC)

腸毒素性大腸桿菌(ETEC)腸集聚性粘附大腸桿菌

(EAggEC)腸出血性大腸桿菌

(EHEC)腸產(chǎn)志賀樣毒素且具有侵襲力的大腸桿菌(ESIEC)

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/323二、實驗室診斷

1.腸道致病性大腸桿菌(EPEC):

EPEC是最早被認(rèn)識的腹瀉性大腸埃希氏桿菌,其生化特性與一般大腸桿菌相同,

如分解葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣,發(fā)酵乳糖和蔗糖,靛基質(zhì)和甲基紅試驗室診斷主要靠血清學(xué)。到1997年為止,國際上據(jù)不完全統(tǒng)計已發(fā)現(xiàn)了39個“O”群,但各國常見的“O”群比較局限,主要的O血清型包括O55、O86、O111、O119、O125、O126、O127、O128ab和O142。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/3242.腸道侵襲性大腸桿菌(EIEC):

EIEC的生化反應(yīng)、抗原成份、致病機理均與志賀氏菌有相同之處。除

O124的部分菌株有動力外,其他均為無動力株。另外,EIEC與志賀氏菌抗原之間互相交叉也比較突出。

EIEC的實驗室診斷中血清學(xué)是很重要的檢測手段。目前,國內(nèi)已有11種/套的診斷血清。我省在近幾年的腹瀉檢測中檢出：028ac、O29、O112、O124、O136、O144、O152、Ol64和01679個血清型。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/3253.腸毒素性大腸桿菌(ETEC):

ETEC的生化反應(yīng)與一般大腸桿菌相同。本菌的特點是產(chǎn)生不耐熱的腸毒素(LT)和耐熱的腸毒素(ST),有些菌株兩種腸毒素均產(chǎn)生,有些菌株只產(chǎn)生其中的一種。最常見的0血清型有：06、O8、O15、O20、O25、O27、O63、O78、O80、O114、O115、O128ac、O148、O153和O167。

ETEC的實驗室診斷主要是腸毒素的測定。常用的試驗方法有：兔腸結(jié)扎試驗，Bikerl試驗(平板擴散試驗)和酶聯(lián)免疫試驗。目前己有診斷血清。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/3264.腸集聚性粘附大腸桿菌(EAggEC):

EAggEC是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種與人類腹瀉有關(guān)的大腸桿菌,該菌對Hela的細(xì)胞(子宮頸癌細(xì)胞)或Hep-2細(xì)胞(喉癌細(xì)胞)有特殊的積聚性黏附現(xiàn)象,使細(xì)菌與細(xì)菌之間,細(xì)菌與細(xì)胞之間呈磚塊樣堆積狀黏附.。目前,EaggEC的診斷主要是細(xì)胞試驗和特異性DNA探針。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/3275.腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7的鑒定：

O157：H7大腸桿菌屬于腸出血性大腸桿菌(EHEC)的一個最常見、最重要的血清型。感染本菌后,主要臨床癥狀為：突發(fā)性腹痛,初期有水樣便,隨即出現(xiàn)血性糞便,低燒或不發(fā)燒,嚴(yán)重者可導(dǎo)致溶血性尿毒綜合癥,血小板減少性紫癲和其它臟器的損傷。因此,快速、準(zhǔn)確做出診斷為臨床治療、防止該菌傳播提供信息具有特別有重要的意義。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/328（1）Ol57:H7大腸桿菌的微生物學(xué)特性:

該菌符合大腸桿菌的主要特點如:革蘭氏陰性桿菌,無芽胞,有鞭毛,能運動。需氧或兼性厭氧,培養(yǎng)溫度為37℃,在普通培養(yǎng)基上生長良好。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/329（2）Ol57：H7大腸桿菌與其他大腸桿菌的主要區(qū)別：O157：H7大腸桿菌與其他大腸桿菌明顯不同的是不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇。

與非出血性大腸桿菌不同的是能產(chǎn)生志賀樣毒素(SLT)。0157:H7大腸桿菌與其它大腸桿菌有鑒別意義的生化特性見表-l。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/330表-10157:H7大腸桿菌與其它大腸桿菌有鑒別意義的生化特性東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/331自92年以來,我省收集O157:H7大腸桿菌絕大多數(shù)菌株均具有豐富的“K”抗原。因此,在作試管凝集時活菌凝集效價很低,而死菌能達(dá)到血清原效價。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/3326.腸產(chǎn)志賀樣毒素且具有侵襲力的大腸桿菌(ESIEC):這是中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院的流行病學(xué)微生物學(xué)研究所發(fā)現(xiàn)的一種新的致瀉性大腸桿菌。

其主要特點是:即產(chǎn)生志賀樣毒素又對上皮細(xì)胞有侵襲力,與腸侵襲性大腸桿菌的

INV探針、志賀樣毒素1或志賀樣毒素2的探針雜交,它也屬于產(chǎn)VT毒素的大腸桿菌。

ESIEC和0157:H7大腸桿菌的共同點都是產(chǎn)生志賀樣毒素(VT毒素),不同的地方是0157:H7大腸桿菌的粘附性菌毛具有一定致病作用,而ESIEC具有侵襲力。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/333

ESJEC的毒力不比O157:H7大腸桿菌差,而且在腹瀉病人大便中分離到的大腸桿菌中占的比例非常高.在北京地區(qū)占31.4%,我省占4.8%.

ESJEC實驗室診斷:首先排除已知的其他感染性大腸桿菌。取待檢菌和INV,SLT1或SLT2核酸探針雜交。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/334動物試驗結(jié)果表明:

ESIEC的毒力和致病力不比

O157H7大腸桿菌差,而且

ESIEC在從腹瀉病人大便中分離到的大腸桿菌中(己知的病原性大腸桿菌不包括在內(nèi))占的比例非常高,在北京地區(qū)點31.4%,在我省占14.8%。

ESIEC對我國人民的危害可能比前面所敘述的病原性大腸桿菌還要大,理應(yīng)引起高度重視。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/335

ESIEC的實驗室診斷:（1）首先排除己知的其他感染性性大腸桿菌。（2）取待檢菌和INLSLTl或SLT2核酸探針雜交。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/336志賀氏菌東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/337

志賀氏菌是引起人類痢疾的病原體，通常是自限性的,平均持續(xù)4-7天。本病的嚴(yán)重程度和病死率與宿主、年齡和得病前的營養(yǎng)狀況及細(xì)胞血清型別的綜合因素相關(guān)。感染宋內(nèi)氏痢疾桿菌,多數(shù)病程短,除免疫抑制者外,幾乎不致死。福氏痢疾桿菌的某些菌株能遺傳易感傾向的人引起反應(yīng)性關(guān)節(jié)病(萊特爾綜合征)。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/338從糞便或肛拭中檢出痢疾桿菌即可作出細(xì)菌學(xué)診斷。標(biāo)本及時送到實驗室處理和使用適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基(同時采用一種弱選擇性——麥康凱瓊脂和一種強選擇性——CSLD

或

SS瓊脂)常可增加檢出痢疾桿菌的機會。注意：分離志賀氏桿菌Ⅰ型時,要特別小心，因為這種細(xì)菌在一些選擇性培養(yǎng)基包括

SS瓊脂上會被抑制，感染病疾時,大便中常會出現(xiàn)膿細(xì)胞。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/339病原體志賀菌屬四個種或血清群組成:A群：志賀痢疾桿菌

B群：福氏痢疾桿菌

C群：鮑氏痢疾桿菌D群：宋內(nèi)痢疾桿菌

A,B,C和

D群再分別分為12,13,18和血清型和亞型,它們以阿拉伯?dāng)?shù)字和小寫英文字母來表示(例如福氏病疾桿菌2a)。痢疾桿菌對腸上皮細(xì)胞的侵襲力有賴于一種特定毒力質(zhì)粒。人類的感染劑量很低(志愿者試驗顯示10-100個細(xì)菌即可致病)。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/340(一)病原學(xué)

分類學(xué)：

志賀氏菌屬是腸桿菌科艾希氏菌族中的一個屬,與同族埃希氏菌屬非常接近。志賀氏菌屬發(fā)酵糖、醇類的能力較埃希氏菌屬為弱。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/341

形態(tài)學(xué)：

本屬細(xì)菌為需氧或兼性厭氧,營養(yǎng)條件要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長。

pH6.4~7.8，溫度10-40℃之間均能生長,最適溫度37℃在變通培養(yǎng)基上經(jīng)37℃培養(yǎng)24小時，菌落光滑圓形、微凸、無色半透明，直徑約2毫米在液體培養(yǎng)基中呈均勻混濁生長。東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/342生化特性：

本菌屬是無動力的革蘭氏陰性桿菌,各群志賀氏菌屬基本的生物學(xué)特性見下表－1：東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/343(二)采樣1、以新鮮粘液血便為主(亦可采用肛拭子取)。最好在服藥前采便,取便后應(yīng)及時送檢驗室接種培養(yǎng)，否則應(yīng)將糞便標(biāo)本或肛拭子放入帶有保存液的管內(nèi)，或置

Cary-Blair運送培養(yǎng)基內(nèi)，送檢驗室培養(yǎng)或放置4-10℃冰箱暫存，在收到送檢標(biāo)本后，應(yīng)即刻接種培養(yǎng)。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/3442、如為慢性痢疾患者或帶菌者糞便、食品等標(biāo)本,可先置有保存液或運送培養(yǎng)基內(nèi),取標(biāo)本接種于

GN肉湯/GN肉湯接種物。在室溫>25℃時即有增菌作用,在炎熱季切,GN肉湯均應(yīng)冷藏送檢,接種量不能超出l:10。增菌時間不能超過6小時。3、其他標(biāo)本：如水或污水等,按有關(guān)規(guī)定進行。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/345(三)檢驗程序

（見表-2）東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/346（四）、檢驗方法

1、增菌：如系慢性痢疾患者,帶菌者的糞便或食品、水等標(biāo)本含菌量少者，需要接種GN肉湯增菌。

2、分離培養(yǎng)：取病人糞便或肛拭增菌后的培養(yǎng)液,用棉拭或接種環(huán)取標(biāo)本接種于

SS瓊脂平板和

EMB瓊脂平板,劃線分離后置37℃培養(yǎng)18-24小時。

3、純培養(yǎng)：挑選無色、微凸、半透明、邊緣整齊、表面光滑(宋內(nèi)氏志賀氏菌可能有較混濁的粗糙型菌落),中等大小、不發(fā)醇乳糖的疑似菌落3-5個分別接種在克氏雙糖培養(yǎng),37℃培養(yǎng)過夜。

東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/347小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/348

本菌屬新近確認(rèn)的在低溫也能繁殖生長的腸道病原菌。山東省在1985-1986年，對引起的腹瀉進行調(diào)查，證實豬是主要傳染源和宿主。并發(fā)現(xiàn)牛、鵝、鳥，11種動物帶菌。其主要血清型共24個，主要致病性菌株為：O：3血清型生物3型。Sereny試驗（侵襲力試驗）陽性，與國外報道的O：8型有所不同。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗程序見下表：東南大學(xué)吳健雄實驗室2023/3/349輪裝病毒較難進行細(xì)胞培養(yǎng)，目前主要檢測手段仍是用電鏡法和ELISA法及核酸電泳法檢測糞便中的病毒抗原。ELISA法操作簡便、敏感，肉眼可判定結(jié)果，適用于大規(guī)模樣品調(diào)查，但易受條件影響，可造成假陽性，實驗時應(yīng)充分注意。阿米巴滋養(yǎng)體直徑15-30偽足透明，內(nèi)質(zhì)可含