5株鵝細(xì)小病毒的VP3基因的序列測(cè)定研究,病毒學(xué)論文

5株鵝細(xì)小病毒的VP3基因的序列測(cè)定研究,病毒學(xué)論文鵝細(xì)小病毒病又稱小鵝瘟，其作為一種急性傳染病給養(yǎng)鵝業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。該病主要損害1月齡以內(nèi)的雛鵝，發(fā)病后主要表現(xiàn)為精神萎靡、食欲廢絕、嚴(yán)重下痢和滲出性腸炎等異常感覺和狀態(tài)[1].該病的病原為鵝細(xì)小病毒〔GooseParvovirus,GPV〕，該病毒屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，GPV僅有一個(gè)血清型[2],病毒粒徑約20nm,是當(dāng)前已經(jīng)知道的動(dòng)物病毒中較小、較簡(jiǎn)單的病毒之一[3].我們國家學(xué)者方定一于1956年初次在江蘇揚(yáng)州發(fā)現(xiàn)并命名為小鵝瘟[1].匈牙利學(xué)者德舍氏〔Derzsys〕于1966年初次使用鵝胚分離到該病毒；1974年，世界家禽協(xié)會(huì)將其正式命名為Derzsys病，隨后GPV不斷蔓延至中國臺(tái)灣[4]、匈牙利[5,6]、英國[7]、日本[8]、泰國[9]、德國[10]、美國[11]、瑞典[12]和波蘭[13]等多個(gè)國家和地區(qū)，給全球養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴(yán)重危害。本研究從江蘇省各市鵝場(chǎng)病死雛鵝的肝、脾、腸病料中分離到5株病毒。通過實(shí)驗(yàn)室診斷證明所分離的5株野外病毒均為小鵝瘟病毒，本研究中同時(shí)對(duì)該5株GPV的VP3基因進(jìn)行序列測(cè)定并進(jìn)行了系統(tǒng)的遺傳進(jìn)化分析。1材料與方式方法1.1材料1.1.1病料江蘇省各市鵝場(chǎng)死亡的，具有小鵝瘟典型病變的雛鵝肝、脾、腸病料組織，病料來源及分離時(shí)間見表1.1.1.2種胚9~10日齡SPF胚購自北京梅里亞SPF種禽場(chǎng)；鵝胚購自高郵市非免種鵝場(chǎng)。1.1.3抗原與血清GPV瓊擴(kuò)標(biāo)準(zhǔn)抗原、陽性血清均由本研究中心制備。1.1.4試劑及儀器Taq酶、RNA酶、氨芐青霉素、IPTG、X-gal、dNTP、DNAmarker、pEASY-T3CloningKit和膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；EDTA、Tris堿、SDS和蛋白酶K購自Sigma公司；EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)；PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司產(chǎn)品，型號(hào)為GeneAmpPCRSystem9700;高速冷凍離心機(jī)為美國Sigma公司產(chǎn)品，型號(hào)為3K15;小鵝瘟病毒VP3基因的特異性引物：P1:5-CCAAGCTACAACAACCACAT-3和P2:5-TGAGCGAACATGCTATGGAAGG-3,目的條帶大小為539bp.1.2方式方法1.2.1病毒分離及傳代取具有典型病變鵝的肝、脾、腸組織，剪碎，按1∶3參加滅菌PBS溶液，研磨，勻漿，經(jīng)超聲波處理后，5000r/min離心15min,反復(fù)凍融數(shù)次，取上清液加青、鏈霉素雙抗至2000U/mL和2mg/mL,接種非免疫鵝胚，0.2mL/枚，置38℃孵育。收取72h后死亡鵝胚的尿囊液，分裝成若干青霉素小瓶，每瓶1mL~2mL,-70℃冷凍保存?zhèn)溆谩Ｃ看O(shè)不接種的正常鵝胚作對(duì)照。傳代時(shí)尿囊液均作1∶100稀釋，分別接種6~8枚鵝胚，每胚0.2mL,取72h~120h之間死亡的鵝胚尿囊液。1.2.2瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)〔AGP〕根據(jù)以下為參考文獻(xiàn)所述的方式方法進(jìn)行抗原純化濃縮，取死亡胚尿囊液，經(jīng)6000r/min離心20min棄沉淀，加等量氯仿混合，6000r/min離心30min取上清，經(jīng)PEG6000棄沉淀濃縮20倍后制成待檢抗原[14].參照(獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)〕中的方式方法進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)[15].簡(jiǎn)述之，在瓊擴(kuò)板周圍孔參加不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)抗小鵝瘟病毒陽性血清，中心孔依次參加標(biāo)準(zhǔn)抗原、待檢病毒分離物和正常鵝胚尿囊液。1.2.3紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)根據(jù)前述方式方法將病毒液進(jìn)行純化后濃縮2倍制備待檢病毒液。將待檢病毒液用磷酸鹽緩沖液在U型板中進(jìn)行2倍連續(xù)倍比稀釋，每孔25L,最后1孔加一樣體積的磷酸鹽緩沖液作對(duì)照。隨即向各孔內(nèi)參加25L的1%各種動(dòng)物的紅細(xì)胞，充分混勻，37℃放置15min后檢查結(jié)果。1.2.4病毒基因組提取根據(jù)以下為參考文獻(xiàn)[4]所述的方式方法提取GPV各分離株的基因組，簡(jiǎn)述之：500L尿囊液與裂解緩沖液〔含有pH8.0的50mM的Tris,5mMEDTA,2%SDS和200g/mL的蛋白酶K〕等體積的混合，完全混勻后使用等體積的酚氯仿〔苯酚∶氯仿=1∶1〕抽提兩次，12000r/min離心10min后汲取上清使用兩倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，-20℃放置10min后12000r/min離心10min后棄上清，使用70%的酒精溶液清洗沉淀后TE緩沖液溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.5鵝細(xì)小病毒VP3基因的擴(kuò)增及序列測(cè)定以提取的基因組DNA為模板、P1、P2為引物擴(kuò)增VP3基因片段。反響條件如下：94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行72℃延伸5min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。目的DNA片段與TA克隆載體相連后，經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑斑、搖菌、質(zhì)粒提取及鑒定后，將含有重組質(zhì)粒的陽性克隆斑送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。1.2.6小鵝瘟病毒VP3基因遺傳進(jìn)化分析將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST搜索后，下載并整理了107株小鵝瘟病毒及19株番鴨細(xì)小病毒VP3基因的序列數(shù)據(jù)。使用Lasergene7.1軟件包中的Meaglin軟件進(jìn)行比對(duì)，然后使用BioEdit軟件進(jìn)行序列整理，最后比照對(duì)后的序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。遺傳進(jìn)化樹利用MEGA6.0軟件中的最大似然法進(jìn)行構(gòu)建，軟件預(yù)測(cè)最佳替換形式為K2+G.2結(jié)果2.1病毒分離鵝胚接種后，多數(shù)胚死亡時(shí)間在60h~120h之間，未接種的對(duì)照鵝胚均健康存活。與對(duì)照鵝胚相比，感染胚可見絨毛尿囊膜增厚，胚胎發(fā)育阻滯，胚體全身嚴(yán)重出血，胚頭充血嚴(yán)重〔圖1〕；多數(shù)胚胎的心、肝、腎有出血，少數(shù)胚胎的心肌蒼白。2.2瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)〔AGP〕結(jié)果瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果表示清楚，用死亡鵝胚尿囊液制備的病毒濃縮抗原能與GPV陽性血清發(fā)生沉淀反響，并與小鵝瘟診斷抗原和陽性血清構(gòu)成的沉淀線吻合。2.3紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)結(jié)果所有5株病毒分離物均不凝集雞、鴨、鵝、豚鼠及兔子的紅細(xì)胞。2.4PCR鑒定結(jié)果GPV各分離株VP3基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見約539bp的目的條帶，DNA大小與預(yù)期的結(jié)果相符〔圖2〕，結(jié)果表示清楚這5株病毒分離物中均有GPV.經(jīng)雞胚接種實(shí)驗(yàn)、瓊脂糖擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)及PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)了這5株病毒分離物均為GPV,并將1~5號(hào)病毒分離物分別命名為Gooseparvovirus/nanjing/09、Gooseparvovirus/taizhou/12、Gooseparvovirus/nantong/12、Gooseparvovirus/yangzhou/08、Gooseparvovirus/yangzhou/11.2.5小鵝瘟VP3基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果使用MEGA5.0遺傳進(jìn)化分析軟件構(gòu)建的ML進(jìn)化樹見圖3,從遺傳進(jìn)化樹來看，GPV與MDPV分布在不同的兩個(gè)分支，這符合該病毒屬一般規(guī)律[16,17].而GPV又進(jìn)一步演化為3個(gè)分支。本研究中5株GPV分離株中有4株處于國內(nèi)主要分支上，僅有1株〔Gooseparvovirus/yangzhou/11〕與當(dāng)下市售活疫苗在同一分支。該結(jié)果表示清楚隨著GPV病毒在野外的不斷遺傳變異，該病毒在不斷的進(jìn)化演變，進(jìn)而出現(xiàn)了較新的基因型。3討論本研究通過分離及鑒定獲得了5株GPV野外分離株，并對(duì)這5株GPV進(jìn)行了系統(tǒng)遺傳進(jìn)化分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚國內(nèi)主要分支已逐步構(gòu)成了新的基因亞型，并且與中國臺(tái)灣的主要分離株具有較近的親緣關(guān)系。但中國臺(tái)灣因其與大陸相分離的特點(diǎn)，也逐步出現(xiàn)了與內(nèi)陸不同基因型的分支，其與波蘭、美國、匈牙利、德國、英國及法國構(gòu)成了國外分支。市售活疫苗為1961