熒光定量PCR的原理及應用

大型儀器管理中心黃雪玲2010-9-27實時熒光定量PCR原理及其應用熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!熒光定量PCR儀的應用基礎研究中基因表達豐度的測定；差異基因的表達檢測，基因型分析；臨床醫(yī)療領域病原體的檢測和基因診斷：包括特定基因的檢測、細菌和病毒等病原體的檢測；環(huán)境監(jiān)測，包括水質(zhì)、空氣的污染檢驗；檢驗檢疫工作：食品衛(wèi)生檢驗，轉(zhuǎn)基因作物的檢驗；法醫(yī)的遺傳學鑒定；熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!PCR的反應過程CycleFluorescence熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!實時熒光定量PCR中的三個概念增長曲線(primarycurve)熒光閾值（threshold)CT值(CycleThreshold)熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!域值：PCR擴增信號進入相對穩(wěn)定對數(shù)增長期時的熒光值。熒光域值（Threshold）的設定熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!Ct值與起始模板的關系每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系。起始拷貝數(shù)越多，CT值越?。荒０錎NA的起始拷貝數(shù)越少，CT值越大。一般正常的CT值范圍在15-35之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!SYBRGreen?I優(yōu)點：使用方便，可以應用于不同的模板靈敏，便宜缺點：與非特異性產(chǎn)物結合，但可以通過熔解曲線進行辨別熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!MeltCurveAnalysis熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!優(yōu)點：對目標序列有很高的特異性，在病原微生物特異性檢測上有獨特優(yōu)勢設計簡單，準確性好缺點：只適合于一種特異目標的檢測，相對價格略高雙標記探針（TaqmanProbe）熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!引物設計的一般原則：產(chǎn)物長度在80-300bp之間產(chǎn)物GC含量在50-60%之間引物的GC含量在50-60%之間，熔解溫度在55-65℃之間應避免引物中有連續(xù)的G或C，但推薦在引物的末端含有G或C

Primer5.0.idtdna./Scitools/Applications/PrimerQuest/Default.aspx?SequenceWarning=True熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!熒光定量PCR實驗技術路線模板PlasmidDNA

目的片段在PlasmidDNA中很易被擴增，可以適當稀釋TotalDNA

目的片段在TotalDNA中豐度相對較低，因此TotalDNA量要略高于PlasmidDNA

cDNA

以cDNA為模板時一般將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物原液稀釋10~50倍后作模板熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!定量方法絕對定量相對定量熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!絕對定量標準品：含有目的片段的濃度已知的核酸繪制標準曲線時，一般選取4-5個點（多于5個更好），被選點的模板濃度范圍要包括待測樣本濃度熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!比較CT法（△△CT）前提：每個循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量，靶基因和看家基因的擴增效率基本一致雙標準曲線法利用兩組標準曲線分別得到目的基因及持家基因的表達量樣本目的基因表達量=相對定量方法目的基因標準曲線測得值持家基因標準曲線測得值熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!相對定量方法二——雙標準曲線法當兩個擴增反應效率不同或者不方便證明的時候，則需要通過雙標準曲線的方法來進行相對定量；或者也可以重新設計引物，優(yōu)化反應條件使得目標序列和內(nèi)參序列具有相同的擴增效率。對于所用的標準品只要知道其稀釋比例即可。最終結果必須除以參照物的量，即參照物是1*的樣本，其它的樣本為參照物量的n倍。在反應中同時擴增一內(nèi)源控制物，如持家基因等以標準化起始模板的量熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR（Real-timeQ-PCR）技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積，實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過參照標準曲線對反應體系中未知模板進行定量分析的方法。

熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!增長曲線反映熒光強度與循環(huán)數(shù)的對應關系CycleFluorescence熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!Ct值Ct值:C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!

熒光定量PCR標記方法內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!熔解溫度(Tm值)Tm值：50%DNA變成單鏈時的溫度，此溫度與雙鏈DNA的長度、GC含量有關，可部分代表序列的特異性。熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標記探針（TaqmanProbe）熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!熒光定量PCR實驗技術路線查詢目的基因序列

選擇合適的熒光標記方法選染料法則購買SyBrGreenI或相應試劑盒；探針法則設計并合成熒光探針

設計特異引物或探針熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!熒光定量PCR實驗技術路線實驗時先對普通PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在條帶特異的情況下才能采用染料法進行熒光定量PCR實驗注意

模板濃度：在普通PCR基礎上可以稀釋10~100倍引物濃度：0.4~0.9μM（一般略低于PCR引物量）熒光物質(zhì)濃度：按說明書操作，根據(jù)實驗結果優(yōu)化加樣準確性：避免微小加樣熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!熒光定量PCR實驗技術路線熒光定量PCR反應靈敏，微小差異都能被反映，實驗中要避免核酸污染，尤其是避免PCR產(chǎn)物污染。試劑反復凍融對實驗也有影響，各組分采用少量分裝保存低濃度模板反復凍融容易降解，少量分裝保存熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!標準曲線由系列稀釋的已知濃度的樣品做標準曲線計算待測樣品的濃度logN0=-CtlogE+logN絕對定量——未知濃度的樣品與標準曲線相比較熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!相對定量——在一定樣本中靶基因相對于另一參照樣本的量的變化

只需要了解相對于參照樣本目的基因的表達量的變化量，而不需要確切的知道基因的表達量具體是多少，采用相對定量即可。比較的依據(jù)是實驗時不同樣本的總核酸模板一致用表達量基本恒定的看家基因作為內(nèi)參照來體現(xiàn)上樣模板的量熒光定量PCR的原理及應用共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!目標基因與持家基因擴增效率差別舉例

對于每一個稀釋梯度，都用GAPDH和c-myc引物進行擴增。計算出c-myc和GAPDH的平均CT值以及△CT值，通過cDNA濃度梯度的log值對△CT值作圖，如果所得直線斜率絕對值接近于