浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)

細胞培養(yǎng)基本技術(shù)培養(yǎng)技術(shù)細胞系的建立和鑒定培養(yǎng)物的固定、染色顯微鏡觀察浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)1、細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞原代培養(yǎng)細胞傳代培養(yǎng)細胞凍存和復(fù)蘇細胞的運輸浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)1.1細胞的原代培養(yǎng)是將機體內(nèi)的某組織取出，分散成單細胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制、細胞的衰老、死亡等生命現(xiàn)象。幼稚狀態(tài)的組織和細胞，如動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養(yǎng)浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)意義原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點是細胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，具有二倍體的遺傳性，而且大多數(shù)細胞表現(xiàn)出原來組織的特性。利用原代培養(yǎng)做各種實驗（藥物測試、細胞分化及病毒學方面）效果很好。原代培養(yǎng)也是建立各種細胞系（株）必須經(jīng)過的階段。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)掌握無菌操作技術(shù)了解小鼠解剖操作技術(shù)了解原代細胞培養(yǎng)的一般方法與步驟了解培養(yǎng)細胞的消化分散了解倒置顯微鏡的使用原代細胞培養(yǎng)的實驗?zāi)康暮鸵笳憬髮W細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)實驗材料實驗動物：孕鼠或新生小鼠液體：細胞生長液（內(nèi)含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡鹽溶液70%乙醇器材：滅菌鑷子、剪刀、滅菌培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)瓶、小瓶、燒杯、吸管、酒精燈浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)原代細胞培養(yǎng)方法胰酶消化法組織塊直接培養(yǎng)法冷消化溫消化一次性消化分次消化

消化法：采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個細胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長和繁殖。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)貼塊法消化法原代培養(yǎng)方法分類浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)分次消化

消化法的分類浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)外植塊培養(yǎng)步驟圖解浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)操作步驟1---取材用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養(yǎng)皿上。剔除胚胎周圍的包膜（若胚胎較大，應(yīng)剪去頭、爪），將胚胎放于無菌的含有平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿中。漂洗胚胎，去掉平衡鹽溶液。繼續(xù)用平衡鹽溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)操作步驟2---切割將部分胚胎轉(zhuǎn)移至一個無菌小瓶中，用平衡鹽溶液漂洗。然后用眼科手術(shù)剪刀小心地絞碎胚胎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置，使組織塊自然沉淀到管底，棄上清。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)胰酶消化法操作步驟---消化、接種培養(yǎng)視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40min，每隔5min振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。加入3-5ml細胞生長液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。靜置5-10min，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。1000rpm，離心5-10min，棄上清液。加入平衡鹽溶液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。加入細胞生長液l-2ml（視細胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。將細胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)胰酶消化法操作步驟---消化、接種培養(yǎng)也可將此步驟簡化為：視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40min，每隔5min振蕩一次。靜置，吸去上清，用細胞生長液漂洗消化后的組織塊，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使細胞分離，靜置，使未分散的組織塊下沉。取細胞懸液接種至加了細胞生長液的培養(yǎng)瓶中（調(diào)整細胞濃度到5×105/ml左右），37℃下培養(yǎng)。（注意：省略了離心、計數(shù)等步驟）浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)組織塊直接培養(yǎng)法操作步驟

組織塊接種：將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附于瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將細胞生長液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。37℃靜置3-5h，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入細胞生長液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)原代細胞培養(yǎng)結(jié)果細胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長如接種的細胞密度適宜，5-7d即可形成單層浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)1.2傳代細胞培養(yǎng)細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3-6次培養(yǎng)的細胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細胞分散，從容器中取出，以1:2或1:3以上的比率轉(zhuǎn)移到新的容器中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)細胞傳代方法根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種。1.懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞慢慢沉淀在瓶壁后，將上清培養(yǎng)液去除1/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2.半懸浮生長細胞傳代（HeLa細胞）此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3.貼壁生長細胞傳代

采用酶消化法傳代。常用消化液是0.25％胰蛋白酶液。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)消化法傳代培養(yǎng)步驟浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)選取生長良好的細胞，在超凈工作臺的酒精燈旁，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入2-3

ml的D-Hanks液，輕輕振蕩漂洗細胞，以除去懸浮在細胞表面的碎片(思考：還有什么作用？）加入適量0.1-0.25％胰蛋白酶消化液，室溫消化，倒置顯微鏡下觀察，待細胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時，倒去酶液用Hanks液洗滌1次，加入適量培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細胞，使其成細胞懸液。以1:2或1:3進行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標記，注明代號、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察：細胞培養(yǎng)24h后，即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細胞的生長情況。貼壁生長細胞傳代方法浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)傳代細胞培養(yǎng)結(jié)果一般情況，傳代后的細胞在2h時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2-4d就可在瓶內(nèi)形成單層，需要再次進行傳代浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)取生長良好的細胞，在超凈工作臺用無菌吸管把培養(yǎng)瓶中的細胞吹打均勻。轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，蓋緊膠蓋，平衡后離心（1000rpm/min）5min。(區(qū)別貼壁傳代)在超凈工作臺中吸去上清液，加入適量新培養(yǎng)液，用吸管吹打細胞，制成懸液。以1:2或1:3進行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標記，注明代號、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察：細胞培養(yǎng)24h后，即可進行觀察。懸液細胞的傳代培養(yǎng)浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)要預(yù)先與臨床外科醫(yī)生和護士商量，并做好一切必要的準備工作。爭取拿到的標本新鮮、無菌、少壞死等。聯(lián)系好手術(shù)時間后，立即做好如下準備工作：準備1-2個貯有培養(yǎng)液和抗生素的標本收集瓶，將蓋蓋緊，保持無菌，瓶外貼上標簽，寫上工作人員名字、地點和電話號碼；將收集瓶送往醫(yī)院，并與醫(yī)生和護士講清取手術(shù)標本的部位及注意事項。1.3人體活檢(或手術(shù))材料浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)標本放入收集瓶后，送出手術(shù)間，立即送往組織培養(yǎng)實驗室。工作人員最好是等在手術(shù)間外。但有時手術(shù)時間難以掌握。則請護士將收集材料的瓶子蓋好后，放入4℃冰箱，盡快打電話通知工作人員。取臨床標本時，雖然盡可能做到無菌操作，但仍有污染可能性的存在?？蛇x用抗生素類控制污染。如手術(shù)標本比較大（約200mg以上），可將其浸于70%酒精中約30-60秒，這樣會減少表面污染而不損壞內(nèi)部組織的結(jié)構(gòu)和存活。不要用紗布包裹標本，紗布纖維易粘附在組織上。人體活檢(或手術(shù))材料浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)整個取材過程中，都要注意保持組織的濕潤，隨時給組織塊滴加一些培養(yǎng)液或平衡鹽溶液。一般情況下，最好是使用冰冷的液體。在剪碎或切割組織塊時，盡量使用鋒利的刀剪，防止以鈍器對組織揉、捻、撕拉等而造成細胞損傷。整個取材過程耗時越短越好。在萬不得已的情況下，取材后也可將組織貯存在冷的(4

℃)含平衡鹽溶液(或其它緩沖鹽溶液)的營養(yǎng)液中，最好不超過24-48

h(視不同組織類型而定)。需要注意的事項浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)1.4培養(yǎng)細胞生長測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。

任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。方法：細胞計數(shù)法臺盼藍染色法生長曲線法

四唑鹽（MTT）比色法

浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)細胞計數(shù)用細胞計數(shù)法測定細胞生長動力學是目前采用的最普遍的方法。

血細胞計數(shù)板人工計數(shù)細胞計數(shù)器血細胞計數(shù)板：常用的是改良的紐巴氏(Neubauer)血細胞計數(shù)板。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)細胞計數(shù)實驗原理：血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0×10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。存活測試為利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)細胞計數(shù)具體操作：

1.將計數(shù)板及蓋片用75%酒精擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板。

2.吸取少許混合均勻的細胞懸液，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。3.計算板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按公式計算：

細胞數(shù)/mL=四大格細胞總數(shù)/4×104×稀釋倍數(shù)注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)由于死細胞的細胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進入?yún)s不被排出，因而細胞呈色。而活細胞反之，能排出進入細胞內(nèi)的染料，因而不易著色。此法的原理即是利用死、活細胞對染料的不同反應(yīng)而區(qū)分開兩種細胞。臺盼藍染細胞時，時間不宜過長（約2min）。臺盼藍排除檢測法浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)①將1滴細胞懸液(貼壁細胞可經(jīng)0.25％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成細胞懸液)與2滴臺盼藍液混合后，滴入細胞計數(shù)板。②2min后，在顯微鏡下計數(shù)至少200個細胞。未著色的為活細胞，呈藍色的為死細胞。計算活細胞百分比?；铙w染色與細胞計數(shù)浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)細胞生長曲線的繪制細胞生長曲線(cellgrowthcurve)是觀測細胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標，可根據(jù)細胞生長曲線分析細胞增殖速度，確定細胞傳代、細胞凍存或具體實驗的最佳時間。它以培養(yǎng)時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標作坐標圖。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)1)培養(yǎng)細胞首先在2４孔培養(yǎng)板內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細胞。計數(shù)并記錄接種的細胞懸液之密度。接種時間記為0h。2)計數(shù)細胞密度從接種時間算起，每隔24

h計數(shù)３孔內(nèi)的細胞密度，算出平均值。為提高準確率，對每孔細胞可計數(shù)2-3次。如此操作至第七天結(jié)束。

3)繪制曲線

以培養(yǎng)時間為橫坐標、細胞密度

為縱坐標，將全部結(jié)果在坐標紙

上繪圖，即得所培養(yǎng)細胞的生長

曲線。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍四唑鹽比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比，用酶標儀測定OD570nm值。MTT法簡單快速、準確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。四唑鹽（MTT）比色法浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)操作步驟四唑鹽（MTT）比色法100L單細胞懸液接種于96孔板(5×104)。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間加入2mg/ml的MTT液（50L/孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3h。吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150L/孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10min，使結(jié)晶物溶解。酶標儀檢測各孔OD值（檢測波長570nm）。記錄結(jié)果。高濃度血清可影響光吸收值，在加入異丙醇溶液或DMSO前盡量吸凈培養(yǎng)液。吸去培養(yǎng)液時動作要慢,以免吸去形成的結(jié)晶。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)1.5細胞凍存和復(fù)蘇Spallanzani(1776)最早發(fā)表了“冷”處理對“細胞”生命活動影響的報道。1900年前后，科學家基本上肯定了生物成分(如精子)能夠在零下溫度貯存的事實。Polge等人(1949)發(fā)現(xiàn)了甘油對低溫下貯存細胞的保護作用。Luyet(1951)與Lovelock(1953)等多位學者發(fā)現(xiàn)電解質(zhì)濃度增大是造成冷凍貯存細胞損傷的主要原因。Lovelock等人(1959)發(fā)現(xiàn)了一種新的化學保護劑，這就是現(xiàn)在人們熟知的二甲基亞砜(DMSO)。當前低溫液氮凍存貯存細胞已是細胞培養(yǎng)室常規(guī)性通用技術(shù)，貯存時間幾乎是無限的。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)細胞凍存(cryopreservation)：將體外培養(yǎng)物懸浮在冷凍保護劑的溶液中，以一定的降溫速率降至零下某一溫度(<-70℃)，并在此溫度下對其長期保存的過程。復(fù)蘇(thawing)：以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過程。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)影響冷凍效果的因素1.冷凍速率細胞冷至-5~-15℃之間時，細胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)，細胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會向細胞外流動

-冷凍速度慢，細胞內(nèi)水分外滲多，細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰，但脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，甚至使細胞失去活性；

-冷凍速度快，細胞內(nèi)水分沒有足夠的時間外滲，隨著溫度的下降會發(fā)生細胞內(nèi)結(jié)冰，造成細胞膜及細胞器的破壞。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)影響冷凍效果的因素2.冷凍保存溫度液氮溫度（-196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。

-70～-80

℃條件冷凍保存細胞，短期內(nèi)對細胞活性無明顯影響，時間延長，細胞存活率下降。3.復(fù)溫速率

是在細胞復(fù)蘇時溫度升高的速度一般復(fù)溫速度越快越好1-2min內(nèi)從-196℃升溫至37℃（水浴鍋）。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)4.

冷凍保護劑

可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。

滲透性：甘油、DMSO非滲透性：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇影響冷凍效果的因素甘油或DMSO分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。甘油和DMSO并不能防止細胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預(yù)冷。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)慢凍程序標準程序：采用細胞凍存器當溫度在-25℃以上時，1～2℃/min當溫度達-25℃以下時，5～10℃/min當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮(-196C)中簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1-2℃的速度，在40min內(nèi)降至液氮表面過夜，次晨投人液氮中。傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃1h→-20℃1h→-80℃16-18h(或隔夜)→液氮槽長期儲存浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)低溫保護劑的應(yīng)用在細胞凍存時加入低溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是二甲基亞楓（DMSO），它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。常溫下DMSO對細胞的毒副作用較大，在4℃時，其毒副作用大為減弱，凍存時DMSO平衡應(yīng)在4℃下進行。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)細胞凍存方法預(yù)先配制凍存液

-10％DMSO＋細胞生長液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細胞懸液（1-5×106cell/ml)加1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)注意事項控制凍存細胞的質(zhì)量不宜將凍存的細胞放置在-20℃過長時間，易引起低溫損傷凍存小管宜用塑料凍存管浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)保存細胞的復(fù)蘇方法快速解凍凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1min內(nèi)（不要超過3min）全部融化解凍后的細胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)，24h后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細胞對冷凍保護劑特別敏感解凍后的細胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)準備水浴取凍存管，入水浴快速晃動至完全融化去除DMSO4.加入培養(yǎng)基制成細胞懸液，移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)注意事項盡快使細胞恢復(fù)到常溫盡快離心棄去冷凍保護液，防止對細胞的毒害浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融冷到零度以下，細胞可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)1.6細胞的運輸由于培養(yǎng)細胞株(系)的商品化，細胞培養(yǎng)室之間的交流、交換和購買已成為生命科學研究中的一個重要組成部分，培養(yǎng)細胞的運輸成為研究工作的一個重要環(huán)節(jié)。如果不了解所要細胞的性狀、培養(yǎng)液特點及培養(yǎng)注意事項，運輸時不注意使用特殊容器或溫度等，就可能影響細胞的生長，或出現(xiàn)差錯，或?qū)е屡囵B(yǎng)失敗等。裝運細胞的主要方法如下：冷凍儲存運輸充液法浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)細胞的運輸---冷凍儲存運輸利用特殊容器內(nèi)盛液氮或干冰的運輸方法。保存效果較好，但缺點是比較麻煩，不宜長時間運輸，多需空運，代價較大。

浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)細胞的運輸---充液法一般選擇生長良好的細胞，以生長1/3～1/2瓶底壁為宜，去掉舊培養(yǎng)液，補充新的培養(yǎng)液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋，并用膠帶密封，放在一運送盒內(nèi)，用棉花等做防震防壓處理。運輸時間需4-5d，一般放在貼身口袋即可，到達目的地后倒出多余的培養(yǎng)液，只需保留維持生長所需的培養(yǎng)液置37℃培養(yǎng)，次日傳代。如果在市內(nèi)運輸或僅需數(shù)小時運輸路程，也可將細胞附著面朝上，或把培養(yǎng)液全部倒掉放在胸部口袋運送?？扛街诩毎砻娴呐囵B(yǎng)液，可使細胞短時間不受損。

浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)2、細胞系的建立正常細胞系癌細胞系轉(zhuǎn)化細胞系細胞克隆浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)正常細胞系建立的程序：原代培養(yǎng)第一次傳代常規(guī)傳代凍存和復(fù)蘇浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)癌細胞系建立的程序：步驟類似正常細胞系建立注意：取轉(zhuǎn)移灶組織癌細胞、癌最外層組織去除癌組織中的間質(zhì)細胞--膠原酶法浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)細胞系的維持細胞系檔案要記錄好：組織來源、培養(yǎng)基要求、傳代時間等；傳代換液有規(guī)律，否則會引起生物學特性改變；多種細胞維持傳代，要防止交叉污染；要有充足的凍存儲備，防止因污染造成絕種；細胞暫時不用，最好凍存，以免老化或性狀改變。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)證明細胞系的種系：人源、鼠源或其他，染色體分析、同工酶分析、DNA指紋技術(shù)明確細胞系的組織來源：檢測細胞抗原標記的方法細胞是否是正常細胞，有無發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化：正常細胞二倍體特征，惡性轉(zhuǎn)化細胞為異倍體細胞有無交叉污染：同工酶方法，DNA指紋技術(shù)也可以鑒定鑒定細胞系的內(nèi)容浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)3、細胞培養(yǎng)物的固定、染色培養(yǎng)物的常用固定方法染色方法浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)2.1常用固定方法固定細胞的目的：

把組織和細胞的原有結(jié)構(gòu)盡可能完整地保存下來，避免組織和細胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形等，使細胞的化學物質(zhì)和酶能準確定位，使細胞的各部分易于著色、適于觀察、長期保存和分析。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)2.1常用固定方法固定細胞的原則：

盡可能選用新鮮培養(yǎng)物，根據(jù)檢測工具、對象、目的和要求選擇固定劑和固定方法。

培養(yǎng)物的準備和固定前處理各種細胞培養(yǎng)物。雙蓋片懸滴和懸液培養(yǎng)物：離心--PBS漂洗2-3次，固定制片；蓋片單層培養(yǎng)物：蓋片從培養(yǎng)器中取出--PBS漂洗2-3次，固定浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)常用固定液簡單固定液：甲醇、乙醇、醋酸、甲醛、戊二醛、丙酮、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞、氯化鎘、鋨酸混合固定液：

Mueller固定液、Flernming固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)常用固定液固定液用途固定液用途4%甲醛-PBS(1:9)大標本、染色體、線粒體、高爾基體戊二醛蛋白質(zhì)、微管和膜性結(jié)構(gòu)丙酮純冷丙酮固定細胞內(nèi)酶甲醇/醋酸(3:1)培養(yǎng)細胞、染色體，現(xiàn)用現(xiàn)配乙醇(70-100%)血纖維蛋白、色素、彈性纖維、細菌和白細胞FAA固定液蓋片單層培養(yǎng)的細胞醋酸(0.3-5%)減少其它固定劑引起的細胞收縮Carnoy固定液單層細胞1%苦味酸白蛋白、核蛋白、球蛋白、組蛋白和核酸Bouing固定液雙蓋片培養(yǎng)細胞的糖原鋨酸(1-2%)結(jié)膜、細胞結(jié)構(gòu)4%多聚甲醛-PBS腎纖維蛋白、細胞骨架蛋白浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)FAA固定液：

90ml80%的酒精中加入冰乙酸和40%甲醛各5mlCarnoy固定液：

60ml純乙醇中加入氯仿30ml及冰乙酸10mlBouing固定液：

75ml飽和苦味酸（100ml水中加入1.2-1.4g）過濾，加入25ml福爾馬林（40%甲醛，有沉淀時禁用），再加入5ml冰醋酸（最好用前加）4%多聚甲醛-PBS：

50ml蒸餾水中加入4g多聚甲醛，加熱至60-70oC，邊攪拌邊逐滴加入2M的NaOH至液體清澈透明；用1M的HCl調(diào)pH至7.4，冷卻后加入10mM的PBS至100ml鋨酸：在棕色試劑瓶中加入50-100ml的0.1MPBS（pH7.0-7.4），再將裝有1g鋨酸的安培瓶放入，擊碎安培瓶，搖晃使鋨酸溶解浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)2.2染色方法染色是利用化學染料與細胞及各種細胞器發(fā)生化學作用和/或吸附作用，使各種細胞結(jié)構(gòu)能夠通過染色而改變其折射率，從而清晰的顯現(xiàn)出來。影響因素：所用的固定液染液的pH值：組織的酸性成分用pH偏高的染液，堿性成分用偏酸染液浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)1）Giemsa染色簡便、快速，適用于多種細胞和染色體染色染色液現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時間最好不超過48h；Giemsa液對pH敏感。母液制備：

Giemsa粉0.5g，甘油22ml，在研缽內(nèi)將少量甘油和Giemsa粉混合研磨至無顆粒，加入剩余甘油，56oC保溫2h，加入33ml甲醇，棕色瓶保存。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)1）Giemsa染色染色步驟（蓋片培養(yǎng)或涂片法）：1）Sorensenbuf和Giemsa染液9:1體積比混合即得到染色液2）用甲醇固定細胞標本10min，或醋酸/甲醇(1:3)固定30min3）用滴管將染色液布滿材料面（不要有氣泡）4）染色10-15min，用自來水將玻片沖洗干凈，空氣干燥，二甲苯透明5）光學樹脂膠封片后觀察結(jié)果：細胞核染成紫紅色或藍紫色，胞漿染成粉紅色浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)2）蘇木精-伊紅染色染液制備：

1）蘇木精染液(20×):

蘇木精0.5g，銨礬(NH4)2SO4Al2(SO4)324g，H2O50ml，NaIO30.5g，甘油30ml，冰醋酸2ml。2）1%伊紅染液：

1g伊紅溶于100ml蒸餾水。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)2）蘇木精-伊紅染色染色步驟（蓋片培養(yǎng)法）：1）37oC溫PBS中漂洗3次，每次20-60sec，中性福爾馬林固定30min2）蒸餾水漂洗1次，用蒸餾水稀釋的1×蘇木精染液染色10min，自來水洗后置入1%NaHCO3中漂洗至藍紫色3）伊紅水溶液中染0.5-1min，蒸餾水洗后迅速通過丙酮2次，每次3-5min4）通過2:1和1:2丙酮/二甲苯各3次，每次1-2min；純二甲苯5-10min5）用光學樹膠封片（注意勿將蓋片的細胞面放反）后觀察結(jié)果：細胞核染成紅色，胞質(zhì)染成藍紫色浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)3）吖啶橙染色吖啶橙(acridineroange,AO)：常用熒光染料，可用于活細胞、固定細胞染色，可與細胞中DNA和RNA結(jié)合而發(fā)出不同顏色的熒光，DNA亮綠色，RNA橘紅色至火紅色?？焖?、簡便、并有一定特異性。染液配制：用生理鹽水將AO配成1%的母液，冰箱保存，用時則0.1M的PBS（pH4.8）稀釋成0.01%工作液。浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)3）吖啶橙染色染色步驟（蓋片培養(yǎng)）：1）Hank’s液洗蓋玻片上的貼壁細胞3次2）用95%乙醇固定細胞標本15-30min，濾紙吸干3）1%醋酸作用30sec，PBS清洗1min4）用0.01%的AO染液染色1-5min，PBS清洗1min5）0.1MCaCl2分色0.5-2min，PBS清洗3次，每次數(shù)秒6）1:1的甘油:PBS封片，立刻觀察(用激發(fā)波405的濾光片)浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)4）免疫熒光染色原理：用熒光素標記已知抗體或抗原，檢查細胞或組織標本中相應(yīng)的抗原或抗體。在熒光顯微鏡下，抗原抗體特異性結(jié)合部位的熒光素受激發(fā)光照射而發(fā)出明亮的熒光。熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）：發(fā)射熒光波長為490-619nm（黃綠色熒光）

四乙基羅丹明（RB200）：發(fā)射熒光波長為540-660nm（橙紅色熒光）浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)4）免疫熒光染色染色步驟（間接熒光染色法）：1）用95%乙醇固定單層細胞標本10-30min，或冷丙酮固定5-10min，PBS洗3次，每次5min，邊洗邊震蕩2）滴加未標記的一抗液，37oC濕盒中30min，PBS洗3次，每次5min，邊洗邊震蕩3）滴加熒光標記二抗，37oC濕盒中30min，PBS洗3次，每次5min，邊洗邊震蕩4）去除玻片周圍及材料上的水分5）熒光顯微鏡下觀察浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)5）細胞活體染色—臺盼藍用Hank’s液配制0.1%臺盼藍溶液用等比的0.5%胰酶和0.2%EDTA混合液消化貼壁細胞加入適量Hank’s液制成細胞懸液，每ml懸液中加入0.1%的臺盼藍溶液10ul并混勻細胞計數(shù)板計數(shù)1000個細胞中的活細胞（折光性強且不著色）和死細胞（染為藍色）數(shù)目浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)6）細胞骨架染色微絲：PBS洗蓋片培養(yǎng)的細胞3次，每次0.5min2%的甲醛/PBS液固定3min0.5%的三硝基甲苯/PBS處理3次，每次10min，PBS漂洗3次用羅丹明（rhodamine）標記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin）（1:10）室溫中反應(yīng)15min，PBS漂洗3次60%甘油+熒光防淬劑封片后熒光顯微鏡觀察浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)6）細胞骨架染色微管：PBS洗蓋片培養(yǎng)的細胞3次，每次0.5min3%的甲醛/PBS液室溫固定20min0.5%的三硝基甲苯/PBS處理3次，每次10min，PBS漂洗3次，最后用濾紙吸干多余的PBS投入冷丙酮中（-10~20oC）7min，PBS漂洗3次，最后用濾紙吸干多余的PBS浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)6）細胞骨架染色微管：向一干凈平皿中央滴一滴濃度為0.1-0.2mg/ml的一級抗微管蛋白抗體，令小蓋片細胞面向下扣在抗體液上，將平皿置37oC溫箱中45-60min（加水盒）向平皿中緩緩加入PBS，浮起蓋片并用鑷子夾出，PBS漂洗3次，最后用濾紙吸干多余的PBS向另一干凈平皿中央滴一滴熒光標記的二抗（0.1-0.2mg/ml），然后同操作⑤和⑥滴甘油/PBS（1:9，pH8.5）少許于載物片上，把小蓋片的細胞面覆以大蓋片上，并熒光顯微鏡觀察浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)4、顯微鏡觀察浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)3.1光學顯微鏡成像原理：光線自反射鏡折射入聚光器F1增強后照射在標本上；標本的像經(jīng)物鏡放大成倒像F2；目鏡將此物象進一步放大在人眼視網(wǎng)膜上成正像F3。構(gòu)造：機械部分/照明部分/光學部分浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)光學顯微鏡的種類反差方式機制說明亮視野反差取決于光吸收常結(jié)合組織染色技術(shù)來提高反差相差將相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹罘床钆c局部的相密度成正比，包括線粒體、染色體、溶酶體等分光干涉相差轉(zhuǎn)換通過樣品的光程相位差的變化率光經(jīng)過細胞和細胞器邊緣時光程突然變化形成強烈反差暗視野散射光觀察產(chǎn)生細胞和細胞器邊緣的輪廓圖像干涉反射反差取決于相互靠近的空間表面之間發(fā)生的衍射用于觀察細胞培養(yǎng)中細胞與基底間的接觸帶偏振光在低于光學分辨率的情況下檢測具有雙折射性的超分子組織結(jié)構(gòu)用于定性排列結(jié)構(gòu)的研究，如細胞骨架、有絲分裂的微管以及強韌纖維、膜的觀察熒光反差取決于熒光基團的光吸收及光衍射僅限于適當?shù)淖园l(fā)熒光和熒光標記浙江大學細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)光學顯微鏡觀察的一般過程普通光學顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡暗視野顯微鏡偏振光顯微