血紅蛋白中血紅素氧合前后的結(jié)構(gòu)變化探討,生物化學(xué)論文

血紅蛋白中血紅素氧合前后的結(jié)構(gòu)變化探討,生物化學(xué)論文對(duì)血紅蛋白可逆載氧的系統(tǒng)研究是生物無(wú)機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的重要成果之一，其構(gòu)造與功能的關(guān)系也一直是相關(guān)教學(xué)關(guān)注的重點(diǎn)。在近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)的研究中，人們對(duì)于血紅蛋白的分子構(gòu)造、載氧機(jī)理與生物學(xué)功能都有了較為全面的認(rèn)識(shí);但是對(duì)于其活性中心血紅素在結(jié)合氧分子前后的相關(guān)構(gòu)造變化，當(dāng)前仍然存在多種爭(zhēng)議，華而不實(shí)包括:血紅素中心的亞鐵離子在和氧分子結(jié)合的經(jīng)過(guò)中能否發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移?氧分子與血紅素鐵是端配位還是側(cè)配位?在脫氧狀態(tài)下能否有水分子占據(jù)第6個(gè)配位點(diǎn)?本文結(jié)合研究進(jìn)展對(duì)這些爭(zhēng)議進(jìn)行總結(jié)分析，以期加深對(duì)血紅蛋白構(gòu)造功能的理解，輔助教學(xué)內(nèi)容，并對(duì)血紅素類功能配合物的設(shè)計(jì)合成提供參考。1血紅素的構(gòu)造與功能血紅蛋白在高等動(dòng)物體內(nèi)起運(yùn)載氧氣的作用。血紅蛋白［1］具有的四級(jí)構(gòu)造為4個(gè)亞基構(gòu)成的異源四聚體22，華而不實(shí)每個(gè)蛋白亞基都結(jié)合一個(gè)血紅素輔基，且將其包裹于蛋白側(cè)鏈構(gòu)成的疏水核心(圖1)。脫氧狀態(tài)的血紅素分子由卟啉與亞鐵離子配位構(gòu)成。固然不同血紅素分子的卟啉環(huán)外衍生構(gòu)造不同，能夠分為多種異構(gòu)體，但其利用環(huán)上4個(gè)氮原子進(jìn)行配位的方式是一致的。同時(shí)，蛋白中87位(亞基)或92位(亞基)的組氨酸殘基上的咪唑氮原子從卟啉環(huán)平面上方與亞鐵離子配位，構(gòu)成第5配位點(diǎn)(圖2)。實(shí)驗(yàn)證明，在脫氧血紅素中，亞鐵離子半徑較大(92pm)，不能嵌入卟啉環(huán)內(nèi)，因此高出卟啉環(huán)平面60pm。當(dāng)氧分子配位后，中心鐵離子半徑縮小至75pm而進(jìn)入卟啉環(huán)平面。在結(jié)合氧分子經(jīng)過(guò)中還伴隨著中心鐵離子的磁矩變化。在脫氧狀態(tài)下，血紅素鐵呈現(xiàn)順磁性;而在氧合狀態(tài)下呈反磁性［1］。對(duì)于血紅素氧合前后鐵離子半徑和磁性變化的原因存在多種爭(zhēng)議，華而不實(shí)血紅素中心亞鐵離子在氧合經(jīng)過(guò)中能否發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移是最重要的一個(gè)。穆斯堡爾譜(Mssbauerspectroscopy)只顯示中心鐵離子與氧分子之間有強(qiáng)的共價(jià)作用，但是難以對(duì)鐵離子的氧化態(tài)進(jìn)行清楚的講明［2］。另外，IＲ譜中觀察到的OO鍵的紅外伸縮振動(dòng)頻率在數(shù)據(jù)與結(jié)論上都存在分歧［3］，但是明確的一點(diǎn)是OO鍵的鍵級(jí)為1．5，與超氧負(fù)離子的鍵級(jí)一樣［4］。Ｒaman光譜也提供了一些數(shù)據(jù)［5］。不過(guò)由于中心鐵離子與氧分子配位前后的原子軌道、分子軌道發(fā)生重組，光譜數(shù)據(jù)以及鍵級(jí)、鍵長(zhǎng)、鍵角等數(shù)據(jù)自然會(huì)發(fā)生變化。在沒(méi)有直接證據(jù)的情況下，直接比照配位前后的相關(guān)性質(zhì)和譜學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)而得出支持某種假設(shè)的結(jié)論是不夠充分可靠的［6］。另外還有兩個(gè)爭(zhēng)議，一是與鐵離子相結(jié)合的氧分子的配位方式，即是端配還是側(cè)配;二是脫氧血紅素中亞鐵離子是5配位，還是有水分子配位構(gòu)成6配位。人們提出了不同的氧合理論模型，試圖對(duì)以上爭(zhēng)論進(jìn)行解釋。2理論模型研究由于以上實(shí)驗(yàn)證據(jù)表示清楚在脫氧血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)檠鹾涎t蛋白經(jīng)過(guò)中存在某些復(fù)雜的構(gòu)造變化和電子重排經(jīng)過(guò)，人們對(duì)血紅素中鐵氧鍵合經(jīng)過(guò)和構(gòu)造提出了多種理論模型。最早，Pauling運(yùn)用經(jīng)典價(jià)鍵理論建立模型［7-9］對(duì)此經(jīng)過(guò)進(jìn)行講明:O2以端配方式與亞鐵離子結(jié)合，華而不實(shí)一個(gè)氧原子的一對(duì)孤對(duì)電子與鐵配位，未發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，亞鐵離子由5配位高自旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)?配位低自旋，因此半徑縮小，由于電子配對(duì)，順磁性轉(zhuǎn)變?yōu)榉创判?。血紅素與一氧化碳結(jié)合的產(chǎn)物具有類似的分子構(gòu)造，能夠講明血紅素氧合后的配合物存在一種共振體，因此亞鐵-氧之間的鍵有部分雙鍵性質(zhì)(圖3a)。后來(lái)，Weiss提出電子轉(zhuǎn)移模型［10-11］，以為在血紅素與雙氧結(jié)合后，中心的亞鐵離子Fe(Ⅱ)首先轉(zhuǎn)移一個(gè)電子給O2構(gòu)成超氧負(fù)離子O－2，本身變成半徑較小的高鐵離子Fe(Ⅲ)，然后超氧負(fù)離子與高鐵離子配位。固然低自旋的高鐵離子有一個(gè)未成對(duì)電子，本身呈順磁性，但是與同樣具有一個(gè)未成對(duì)電子的超氧負(fù)離子配位結(jié)合后，電子配對(duì)，各自的順磁性消失，整體顯示抗磁性(圖3b)。除此之外，Griffith還提出另外一個(gè)側(cè)配氧合模型［12］。他通過(guò)對(duì)中心原子鐵及氧分子的軌道計(jì)算得出，其配位形式既不是垂直端配共振體，也不是傾斜端配共振體。結(jié)合自旋狀態(tài)分析，他以為O2是平行于卟啉-鐵配位平面進(jìn)行配位的，即側(cè)配氧合，利用亞鐵離子空的d2sp3雜化軌道和O2的2p軌道重疊構(gòu)成鍵，而亞鐵離子的3dxz原子軌道上的電子能夠和O2的*2p空軌道構(gòu)成反應(yīng)鍵(圖3c)。綜上，如今存在3種不同理論模型，下面對(duì)幾個(gè)爭(zhēng)議分別進(jìn)行闡述。3爭(zhēng)議一:氧合血紅素中鐵離子的氧化態(tài)問(wèn)題首先，對(duì)于結(jié)合雙氧前后血紅素中心亞鐵離子氧化態(tài)的變化情況長(zhǎng)期存在爭(zhēng)議。對(duì)公認(rèn)的磁性與半徑變化的事實(shí)，Pauling理論解釋為Fe(Ⅱ)離子的電子自旋狀態(tài)的改[]綜上，如今存在3種不同理論模型，下面對(duì)幾個(gè)爭(zhēng)議分別進(jìn)行闡述。3爭(zhēng)議一:氧合血紅素中鐵離子的氧化態(tài)問(wèn)題.首先，對(duì)于結(jié)合雙氧前后血紅素中心亞鐵離子氧化態(tài)的變化情況長(zhǎng)期存在爭(zhēng)議。對(duì)公認(rèn)的磁性與半徑變化的事實(shí)，Pauling理論解釋為Fe(Ⅱ)離子的電子自旋狀態(tài)的改變，這與鍵長(zhǎng)、鍵角等數(shù)據(jù)也相符合［13］;Weiss模型則以為鐵(Ⅱ)被氧化為鐵(Ⅲ)，而不僅僅僅是電子自旋狀態(tài)的變化。中心原子氧化態(tài)的升高必然伴隨著半徑的減小和磁性的改變。前文提到在IＲ譜中觀察到OO鍵的紅外伸縮振動(dòng)頻率對(duì)應(yīng)著OO鍵的鍵級(jí)為1．5，與超氧負(fù)離子的鍵級(jí)一樣［14］。除此之外，X射線光電子能譜(X-rayphotoelectronspectroscopy)研究表示清楚，中心鐵原子具有一個(gè)約為3．2的氧化態(tài)［15］。Durham等人［6］利用X射線吸收近邊構(gòu)造光譜(X-rayabsorptionnearedgestructures)研究中心鐵離子在氧合經(jīng)過(guò)前后的能級(jí)變化情況，證明鐵離子在氧合后有效正電荷增加了。這些都能夠被Weiss模型合理地解釋。對(duì)于Pauling模型存在一些困惑。比方通過(guò)高自旋到低自旋的轉(zhuǎn)變看似能夠解釋磁性的變化，但是這同時(shí)要求氧分子首先由兩個(gè)電子自旋平行的三線態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樽孕鋵?duì)的單線態(tài)，這是一個(gè)能量上不利的經(jīng)過(guò)。同時(shí)，在Pauling理論中，以為氧配位之后使八面體場(chǎng)的晶體場(chǎng)分裂能升高，進(jìn)而導(dǎo)致中心亞鐵離子由順磁性的高自旋(t42ge2g)轉(zhuǎn)變?yōu)榭勾判缘牡妥孕?t62ge0g)，進(jìn)而使其半徑減小。在這個(gè)推理經(jīng)過(guò)中，配位場(chǎng)分裂能的變化，以及高低自旋的轉(zhuǎn)變對(duì)半徑的影響，是缺乏直接量化證據(jù)的。相比之下，Weiss模型中亞鐵離子轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F離子，離子半徑自然減小的解釋愈加直接有力。但是，當(dāng)前對(duì)Weiss模型最大的非議是典型的高鐵血紅素卻不具備可逆載氧功能。對(duì)于這一點(diǎn)，我們以為能夠這樣解釋，一是由于在Weiss模型中，與鐵離子配位的實(shí)際上是超氧負(fù)離子，而不是空氣中直接存在的雙氧分子。故而，這一點(diǎn)不能作為否認(rèn)Weiss模型的證據(jù)。另外，實(shí)驗(yàn)［16］表示清楚，從血紅蛋白中分離出的血紅素暴露在氧氣中時(shí)，氧分子會(huì)與兩個(gè)血紅素鐵以橋配配位，形成穩(wěn)定的Fe(Ⅲ)-O2-Fe(Ⅲ)產(chǎn)物，血紅素亞鐵被不可逆地氧化為血紅素高鐵。同時(shí)，珠蛋白鏈構(gòu)成的疏水構(gòu)造能夠保衛(wèi)血紅素亞鐵在可逆載氧經(jīng)過(guò)中不被氧化，這已被公認(rèn)。因而我們能夠以為，在Weiss模型中，從血紅素亞鐵離子到氧分子的一個(gè)電子轉(zhuǎn)移只發(fā)生在氧合配位體中，而且是可逆的。在脫氧經(jīng)過(guò)中，遭到外圍蛋白構(gòu)造的保衛(wèi)，氧合配位體脫掉氧分子，血紅素恢復(fù)為亞鐵離子?？梢?jiàn)，Weiss模型能夠較為合理地解釋現(xiàn)有大部分現(xiàn)象而沒(méi)有明顯不合理之處。氧合血紅素中鐵離子的氧化態(tài)之爭(zhēng)在教學(xué)體系中是非常分明的，由于牽涉血紅蛋白的可逆載氧的氧合機(jī)理是非常重要的。歷史上Pauling模型有著廣泛的影響，當(dāng)前國(guó)內(nèi)外很多經(jīng)典教學(xué)材料中都認(rèn)同這一觀點(diǎn)。例如，Miessler［17］在(InorganicChemistry〕中闡述血紅蛋白的存在能夠保衛(wèi)血紅素鐵使其與氧氣結(jié)合后仍保持Fe(Ⅱ)形式，而不被氧化為Fe(Ⅲ)。麥松威［18］在(高等無(wú)機(jī)構(gòu)造化學(xué)〕中也強(qiáng)調(diào)了在血紅蛋白中，O2結(jié)合于Fe(Ⅱ)，不會(huì)氧化為Fe(Ⅲ)。隨著一些新的譜學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究，Weiss模型也得到越來(lái)越多的支持。Cotton［19］在(AdvancdInorganicChemistry〕中也提到，在脫氧條件下血紅素鐵是Fe(Ⅱ)高自旋;氧合后變?yōu)镕e(Ⅲ)低自旋，通過(guò)與超氧負(fù)離子結(jié)合而電子配對(duì)呈現(xiàn)反磁性。郭子建等在其(生物無(wú)機(jī)化學(xué)〕教學(xué)資料［15］中支持氧合經(jīng)過(guò)中的Weiss模型。4爭(zhēng)議二:雙氧配位方式關(guān)于O2對(duì)于鐵離子的配位是彎曲型端配(bentend-on)還是側(cè)配(side-on)也一直存有爭(zhēng)議。在Griffith模型中，O2與血紅素中心鐵原子配位方式為側(cè)配;而在Pauling模型［7-9］和Weiss模型［10-11］中，O2以彎曲型端配方式與鐵結(jié)合。模型化合物和血紅蛋白、肌紅蛋白的X射線晶體衍射數(shù)據(jù)都證實(shí)雙氧與鐵離子以端配方式結(jié)合且有一定傾斜角。而Mssbauer譜也證明O2既不是平行也不是垂直于血紅素平面。最初因難以獲得準(zhǔn)確的蛋白晶體構(gòu)造數(shù)據(jù)，一系列與血紅蛋白復(fù)合體幾何構(gòu)型類似的模型化合物被構(gòu)建用來(lái)研究蛋白質(zhì)構(gòu)造與功能之間的關(guān)系［20］。血紅蛋白中氧氣對(duì)鐵的彎曲型端配構(gòu)造最早在尖樁籬笆型復(fù)合體(picketfencecomplex)(圖4)中被觀測(cè)到［21-22］，后來(lái)人們?cè)谘鹾霞〖t蛋白［23］及氧合血紅蛋白［24］的晶體構(gòu)造中也觀察到了這種配位方式(圖5)。氧合血紅素中的FeOO鍵在不同物種的同源蛋白質(zhì)及模型化合物中有特定角度，F(xiàn)eOO鍵的鍵角在Fe(TpivPP)(2-Melm)尖樁籬笆型復(fù)合物中為129在氧合無(wú)脊椎動(dòng)物血紅蛋白中為170，近乎為直線型［25］;在脊椎動(dòng)物氧合肌紅蛋白中為115［26］;在脊椎動(dòng)物氧合血紅蛋白中為156，介于尖樁籬笆型復(fù)合物和無(wú)脊椎動(dòng)物血紅蛋白之間。蛋白空腔的大小、雙氧與蛋白上特定氨基酸之間氫鍵的構(gòu)成會(huì)影響FeOO鍵角。例如，根據(jù)空間位置判定，氧合血紅蛋白和氧合肌紅蛋白中-亞基E7位的組氨酸上的Nε與O的間距是2．7，有利于構(gòu)成NεH帿O的氫鍵，氫鍵的強(qiáng)弱、-亞基E7位組氨酸與雙氧的相對(duì)位置將影響FeOO鍵角。5爭(zhēng)議三:鐵離子配位數(shù)問(wèn)題在氧合血紅蛋白中，血紅素鐵構(gòu)成6配位構(gòu)造，而且CO、NO等小分子極易取代O2與血紅素鐵構(gòu)成彎型端配構(gòu)造［27］。在生物體的脫氧血紅蛋白中，水能否與血紅素鐵配位也小有爭(zhēng)議。大部分教學(xué)資料描繪敘述脫氧血紅蛋白中亞鐵離子為5配位，由于血紅素所處的疏水蛋白構(gòu)造應(yīng)不利于水的配位結(jié)合;但也有研究［28］報(bào)告在脫氧血紅蛋白中，水分子能夠作為血紅素鐵的軸向配體介入配位，即在脫氧情況下血紅素鐵為6配位。假如血紅素鐵在氧合前后都是6配位，即只是水分子被氧分子取代，則很難解釋血紅素鐵在氧合經(jīng)過(guò)中的宏大構(gòu)造變化。對(duì)于水分子與血紅素鐵的配位情況，當(dāng)前所得的血紅蛋白及血紅素模型化合物的晶體構(gòu)造顯示很少有水介入中心金屬的配位［19］。但Priedman等人［29］在研究Scapharca的二聚血紅蛋白構(gòu)造時(shí)發(fā)現(xiàn)，在這里血紅蛋白亞基界面上有水分子團(tuán)簇構(gòu)造。根據(jù)二聚血紅蛋白晶體構(gòu)造，脫氧二聚血紅蛋白的血紅素鐵可與水分子配位。他們用定點(diǎn)突變、改變浸透壓的方式方法進(jìn)一步研究水分子配位對(duì)血紅蛋白功能的影響，發(fā)現(xiàn)將Scapharca血紅蛋白的72位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸后，氧氣對(duì)血紅蛋白的親和性提高了40倍;造成這一結(jié)果的最重要差異就是:突變后血紅蛋白中的血紅素鐵與水分子的結(jié)合能力變?nèi)趿?。除此之外，增加浸透壓將降低人血紅蛋白對(duì)氧氣的親和性，這講明水分子和氧氣在與血紅素鐵配位時(shí)存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，人血紅蛋白中血紅素鐵可能與水分子存在類似的弱配位鍵。綜上所述，當(dāng)前只在極少數(shù)血紅蛋白晶體中觀察到了水與血紅素鐵的配位。一般以為，脫氧時(shí)血紅素鐵為5配位，即血紅素鐵不與水分子配位。6結(jié)論對(duì)于血紅蛋白中血紅素的氧合經(jīng)過(guò)及氧合前后的構(gòu)造變化，人們采用了多種物理和化學(xué)手段進(jìn)行研究，獲得了豐富的數(shù)據(jù)。基于此，人們提出了Pauling模型、Weiss模型等不同的理論模型試圖解釋血紅蛋白的氧合機(jī)理，但是對(duì)其詳細(xì)構(gòu)造某些方面的認(rèn)識(shí)仍然存在一些爭(zhēng)議。本文通過(guò)分析比擬幾種理論模型，結(jié)合相關(guān)研究的最新進(jìn)展，對(duì)當(dāng)前教學(xué)中有爭(zhēng)議的問(wèn)題進(jìn)行了梳理和總結(jié)，提出相關(guān)看法。對(duì)于氧合經(jīng)過(guò)中鐵離子的氧化態(tài)問(wèn)題，我們以為Weiss理論中Fe(Ⅲ)與超氧負(fù)離子的配位模型比擬合理;對(duì)于O2配位方式的爭(zhēng)議，當(dāng)前已基本解決，晶體構(gòu)造表示清楚其為彎曲型的端配;對(duì)于脫氧血紅素中鐵離子的配位數(shù)其實(shí)爭(zhēng)議不大，均以為是5配位。但某些研究表示清楚在脫氧情況下，一些物種的血紅素鐵可與水、組氨酸和卟啉環(huán)構(gòu)成6配位構(gòu)造，值