外源基因的原核表達

外源基因的原核表達第1頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/20231外源基因表達的作用：外源基因表達泛指目的基因與表達載體重組后，導入合適的受體細胞，并能在其中有效表達，產生目的基因產物。外源基因的表達是研究和探索基因功能、基因表達調控機制、編碼蛋白質的結構與功能的重要方法，也是制備和生產新型蛋白質藥物、診斷試劑必不可少的手段。通過外源基因的表達可由宿主細胞產生大量的目的蛋白。第2頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/20232常用的原核外源表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng)芽孢桿菌表達系統(tǒng)鏈霉菌表達系統(tǒng)藍藻表達系統(tǒng)第3頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/20233原核生物基因表達系統(tǒng)的特點：1、原核生物大多數(shù)為單細胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達產物。2、基因組結構簡單，便于基因操作和分析。3、多數(shù)原核生物細胞內含有質?；蚴删w，便于構建相應的表達載體。第4頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/20234原核生物基因表達系統(tǒng)的特點：4、不具備真核生物的蛋白質加工系統(tǒng)，表達產物無特定的空間構象。5、內源蛋白酶會降解表達的外源蛋白，造成表達產物的不穩(wěn)定。由于以上特點，近年來真核生物表達系統(tǒng)發(fā)展很快，并構建了相應的基因表達載體。第5頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/20235大腸桿菌表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因表達技術中發(fā)展最早，目前應用最為廣泛的經典表達系統(tǒng)。屬革蘭氏陰性細菌。其特點是：遺傳背景清楚目的基因表達水平高培養(yǎng)時間短第6頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/20236大腸桿菌表達系統(tǒng)的主要不足1、缺少真核生物的蛋白質翻譯后修飾和加工過程。2、表達的蛋白質多以包含體形式存在，需經復性才能恢復構象與活性3、宿主本身雜蛋白質多，純化步驟復雜。第7頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/20237大腸桿菌基因表達載體理想的大腸桿菌表達載體的特征1、穩(wěn)定的遺傳和復制能力，在無選擇壓力下保存于大腸桿菌細胞內2、具有顯性的轉化篩選標記3、轉錄可以調控，抑制時本底轉錄水平較低4、轉錄的mRNA能夠在適當?shù)奈恢媒K止且轉錄不影響載體的復制5、具備適用于外源基因插入酶切位點第8頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/20238大腸桿菌基因表達載體構成1、復制子：是一段包含起始位點和反式因子作用區(qū)在內的DNA片段。其功能是通過復制使載體穩(wěn)定存在于大腸桿菌細胞。第9頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/20239大腸桿菌基因表達載體2、篩選標記：大腸桿菌經過轉化后，僅有少數(shù)細菌能獲得攜帶外源基因的質粒并穩(wěn)定地傳代，篩選標記可有效地篩選出轉化有外源基因的陽性重組。第10頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202310大腸桿菌基因表達載體3、啟動子：是與DNA依賴的RNA聚合酶相結合的一段DNA序列。啟動子是調控外源基因轉錄的重要順式作用元件，與mRNA的合成有很大關系，是表達載體不可缺少的元件。第11頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202311大腸桿菌基因表達載體4、終止子：在轉錄過程中能在特異位點將轉錄終止的DNA序列。有兩種類型1、ρ－因子型終止子2、轉錄產物二級結構第12頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202312第13頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202313大腸桿菌基因表達載體4、終止子：能在特異位點終止轉錄的DNA序列。終止子有兩種類型1、ρ－因子2、轉錄產物二級結構第14頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202314第15頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202315第16頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202316終止子的功能（1）、能能有效控制目的基因mRNA的長度（2）、提高mRNA的穩(wěn)定性（3）、避免載體上其他基因的異常表達第17頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202317大腸桿菌基因表達載體5、核糖體結合位點：原核細胞mRNA蛋白合成起始點上游的一段非編碼序列。能與30S小亞基中16SrRNA3’末端的一段序列特異結合。此序列富含嘌呤，核心序列為SD序列。第18頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202318大腸桿菌基因表達載體6、密碼子：密碼子有簡并性，多個密碼子為一個氨基酸進行編碼，不同生物在利用這些密碼子時其利用頻率不同，不同的密碼子會影響到大腸桿菌的翻譯速度。第19頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202319基因表達的機制基因工程技術的核心是基因表達技術。迄今為止，已構件建了不同類型的表達系統(tǒng)，可根據(jù)需要合理地選擇適當?shù)谋磉_系統(tǒng)。外源基因在受體細胞中的表達包括：1、轉錄2、翻譯兩個環(huán)節(jié)第20頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202320基因表達的機制基因工程的核心問題：有效表達外源基因表達的關鍵步驟：起始轉錄基因表達的限速步驟：轉錄起始的速率構建表達系統(tǒng)時首先要考慮的問題是：1、選擇可調控的啟動子2、相關的調控序列第21頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202321目的：在細胞生長的初期不表達或低水平表達，當細胞增殖到一定的密度時，在某種特定的誘導因子的誘導下啟動轉錄合成mRNA。啟動子原核生物啟動子真核生物啟動子誘導型誘導型組成型組成型第22頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202322mRNA的延伸與穩(wěn)定性：有效表達的關鍵是：保持mRNA的1、有效延伸2、正確終止3、mRNA在細胞中的穩(wěn)定存在第23頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202323mRNA的有效延伸：導致mRNA轉錄提前終止的可能原因有和解決辦法1、衰減子：類似于簡單的終止子，在原核生物中一般位于操縱子的啟動子與第一個結構基因之間。在構建表達載體時應避免該序列的存在。第24頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023242、非特異終止：防止非特異性終止的方法是在構建表達載體時加入抗終止的序列元件。第25頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202325轉錄的正確終止也是外源基因有效表達的重要因素，可以防止產生不必要的轉錄產物，使mRNA的長度限制在一定的范圍內，從而增加外源基因表達的穩(wěn)定性。原核生物解決辦法真核生物解決辦法第26頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202326mRNA在細胞中的穩(wěn)定存在：mRNA在受體細胞中的穩(wěn)定存在直接決定翻譯產物的多少。解決辦法1、原核生物：選擇一個RNase缺失的工程菌株。2、真核生物：提高mRNA的正確加工第27頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202327外源基因mRNA的有效翻譯為使外源基因有效翻譯，在構建表達體系時應考慮以下問題：1、AUG為首選起始密碼子2、SD序列為與核糖體結合位點3、SD序列與起始密碼子之間的距離為3～9個堿基4、在翻譯起始區(qū)周圍的序列不易形成明顯的二級結構5、選擇合適的終止密碼子第28頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202328表達蛋白在細胞中的穩(wěn)定性常用的措施有：1、構建融合蛋白表達系統(tǒng)2、構建分泌蛋白表達系統(tǒng)3、構建包涵體表達系統(tǒng)4、選擇蛋白水解酶基因缺陷受體系統(tǒng)第29頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202329外源基因在大腸桿菌中表達產物在細胞的位置：外源基因在大腸桿菌中的表達產物可能存在于細胞質、細胞周質和細胞外培養(yǎng)基中。其表達形式包括形成：1、不溶性蛋白2、可溶性蛋白第30頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202330大腸桿菌載體的表達方式非融合表達載體融合表達載體帶純化標簽表達載體分泌型表達載體表面展示表達載體帶分子伴侶表達載體第31頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023311、非融合表達載體：應用此種載體表達的蛋白質與天然狀態(tài)下存在的蛋白質在結構、功能和免疫原性等方面基本或完全一致。目前上市的細胞因子類產品多采用此類表達載體。2、融合表達載體：分子量較小的蛋白質常用此類載體進行表達。將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因閱讀框。第32頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202332在進行融合表達時，一般將受體菌蛋白位于N端，而外源蛋白位于C端。外源蛋白與菌體自身蛋白以融合蛋白的方式表達后其穩(wěn)定性大大增加。其原因為：外源小分子蛋白上的酶切位點暴露于分子的表面。當以融合蛋白的形式表達后，外源蛋白部分在菌體自身蛋白的引導下正確折疊，可最大程度上封閉酶切位點。第33頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202333帶純化標簽的表達載體：載體上具有一段特殊序列，該序列表達后可作為純化標簽。目的基因與該序列融合表達后，用親和層析的方法很方便的將目的蛋白分離，切除標簽序列后可得到純化的目的蛋白。第34頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202334分泌型表達載體：將目的基因與信號肽融合表達，表達蛋白在信號肽的引導下成為分泌蛋白。表面展示載體：將目的基因克隆到細菌表面蛋白的結構基因中，從而達到細菌表面表達。帶分子伴侶的表達載體：第35頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202335第36頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202336第37頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202337第38頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202338宿主菌大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的基因一般都是異源基因，甚至是真核生物基因，而在細胞內積累大量的異源蛋白極易被降解。造成重組異源蛋白在大腸桿菌中不穩(wěn)定的原因有：1、大腸桿菌缺乏復雜的翻譯后加工和蛋白質折疊系統(tǒng)；第39頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023392、大腸桿菌不具備類似真核細胞的亞細胞結構和表達產物穩(wěn)定因子；3、大量的異源重組蛋白在大腸桿菌細胞中形成高濃度微環(huán)境，導致蛋白質分子之間的作用增強。由于以上原因，為使外源基因高效表達，必須構建作為基因表達受體菌的工程菌株。第40頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202340常見的大腸桿菌表達系統(tǒng)Lac和Tac表達系統(tǒng)：以lac操縱子調控機制為基礎設計和構建的表達系統(tǒng)。通過對大腸桿菌tacI基因誘變，獲得能過量表達lacI

阻遏蛋白的基因突變體lacIq，使外源基因的表達調控在一定的水平。此外，目前還構建了阻遏蛋白溫度敏感型突變體lacIq(ts)宿主菌和載體，使lac和tac啟動子的轉錄受溫度的控制，在低溫(30oC)下基因的轉錄受到抑制，在(42oC)下基因的轉錄保持開放。第41頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202341常見的大腸桿菌表達系統(tǒng)PL和PR啟動子表達系統(tǒng)：以λ噬菌體早期轉錄啟動子PL和PR構建的。在野生型λ噬菌體中，PL和PR啟動子的轉錄與否決定λ噬菌體進入裂解循環(huán)或溶原循環(huán)。λ噬菌體PE啟動子控制的cl基因表達產物是PL和PR啟動子轉錄的阻遏物，而其表達和在細胞中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子這間的復雜平衡關系。通過細胞因子調節(jié)cl在細胞中含量的途徑很難操作，因此在構建表達體系時，選用溫度敏感突變體cl1857(ts)的基因產物調控PL和PR啟動子的轉錄。第42頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202342常見的大腸桿菌表達系統(tǒng)T7表達體系：利用大腸桿菌T7噬菌體轉錄系統(tǒng)元件構建的，具有很高表達能力的表達系統(tǒng)。T7噬菌體RNA聚合酶能選擇性地激活T7噬菌體啟動子的轉錄，這是一種活性很高的RNA聚合酶，其合成mRNA的速率相當于大腸桿菌RNA聚合酶的5倍。在大腸桿菌宿主細胞中，受T7噬菌體啟動子控制的基因在T7噬菌體RNA聚合酶存在下進行高表達。第43頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202343常見的大腸桿菌基因表達受體菌株菌株基因型啟動子BL21hsdSgalT7噬菌體HMS174recA1hsdRrifT7噬菌體M5279lacZtrpArpsLλ噬菌體PL

RB791W3110lacIqL8lac,tac第44頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202344大腸桿菌高效表達目的基因策略對表達相關元件進行優(yōu)化提高稀有密碼子tRNA的表達作用提高外源基因表達產物的穩(wěn)定性優(yōu)化發(fā)酵過程提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性第45頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202345表達相關元件的優(yōu)化主要包括與表達相關的啟動子序列和決定mRNA翻譯的SD序列。具體方法為組合強啟動子和強終止子；增加SD序列中與核糖體16SrRNA互補配對的堿基序列；調整SD序列與起始密碼ATG之間的距離及堿基的種類；防止核糖體結合位點附近序列轉錄后形成發(fā)卡結構。第46頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202346表達質粒的優(yōu)化和設計構建表達質粒時首先要考慮使目標基因的翻譯起始密碼ATG與SD序列之間的距離和堿基組成處于一個適當?shù)姆秶鷥?。核糖體結合位點序列的變化對mRNA的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為：

SD序列UAAGGAGG的翻譯效率要比AAGGA高3～6倍翻譯起始密碼ATG與UAAGGAGG的最適距離是6～8個堿基長度，與AAGAA的最適距離是5～7個堿基長度ATG與UAAGGAGG至少相隔3～4個堿基，與AAGAA至少相隔5個堿基；mRNA的翻譯才能進行ATG與SD序列之間的堿基組成為A，T堿基豐富時，mRNA翻譯效率較高。第47頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202347

核糖體結合位點本身和附近的序列決定了目標基因mRNA5’端的二級結構，研究表明討mRNA5’端形成的“莖環(huán)”結構阻礙了mRNA與核糖體30S亞基的結合，從而抑制了翻譯的起始。盡量提高核糖體結合位點本身和附近的序列中A/T堿基的含量，降低mRNA5’端形成的“莖環(huán)”結構的可能性，也是構建表達質粒時需要注意的事項。在必要的情況下，還可通過定點突變，PCR等技術改變個別關鍵的堿基來破壞mRNA5’端的“莖環(huán)”結構。把目標基因設計成多順反子結構，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個SD序列和目標基因，一起插入表達載體。這一方法通常適用于目標基因5’端序列容易形成二級結構，而又不宜改變其序列的情形下第48頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202348表達質粒的優(yōu)化和設計

在構建表達質粒時，充分利用各個基因的結構特征和特點，注意引入翻譯增強子序列

能提高mRNA翻譯效率的特殊核苷酸序列，稱為翻譯增強子。

第49頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202349提高稀有密碼子tRNA的表達作用簡并密碼子的使用頻率不同與相應tRNA在細胞中的豐度有關。過多使用低豐度tRNA時，會因tRNA耗盡而影響翻譯?？蓪⑼庠椿蛑型x密碼子進行點突變，成為受體菌中常用密碼子而提高表達能力。第50頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202350共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因表達水平高的基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛性高于表達水平低的基因。

現(xiàn)已闡明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有：編碼Arg的密碼子AGA、AGG、CGA、CGG編碼Pro的密碼子CCC、CCU、CCA編碼Cys的密碼子UGU、UGC;編碼Gly的密碼子GGA、GGG編碼Leu的密碼子CUA、CUC編碼Ile的密碼子AUA編碼Ser的密碼子UCA、AUG、UCG、UCC編碼Thr的密碼子ACA四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術第51頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202351共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因

由于同義密碼子的使用頻率與細胞內對應的tRNA的豐度有正比關系稀有密碼子對應的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變。

解決這一問題的辦法：通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子。在表達系統(tǒng)中共表達稀有密碼子tRNA基因，以提高大腸桿菌細胞內稀有密碼子tRNA的豐度四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術第52頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202352提高外源基因表達產物的穩(wěn)定性：大腸桿菌中含有多種蛋白水解酶，在外源基因表達產物的誘導下，其蛋白水解酶的活性可能會增加。因此必需提高外源蛋白在大腸桿菌細胞內的穩(wěn)定性。常用的方法有：1、將外源基因的表達產物轉運到細胞周質或培養(yǎng)基中；2、選用某些蛋白水解酶缺陷株；3、對外源蛋白中水解酶敏感的序列進行修飾或改造；4、在表達外源蛋白的同時，表達外源蛋白的穩(wěn)定因子。第53頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202353提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性：大腸桿菌的核酸酶系統(tǒng)能專一性地識別外源DNA或RNA并對其進行降解。為了保持外源mRNA在宿主細胞內的穩(wěn)定性，可采取兩種措施：1、盡可能減少核酸外切酶對外源基因mRNA的降解；2、改變外源基因mRNA的結構，使之不易被酶降解。第54頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202354提高目標基因mRNA和目標基因產物的穩(wěn)定性

由于大腸桿菌防御體系的自身保護作用，大腸桿菌中的核酸酶和蛋白水解酶能夠降解目標基因mRNA和目標基因產物，這種降解作用程度對不同的基因或蛋白質而言是不同的，具有一定的專一性和選擇性。第55頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202355提高目標蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有：利用蛋白轉運系統(tǒng)把目標蛋白最終累積在周質空間，或分泌到培養(yǎng)基中采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌。對分子量較小的目標基因進行融合表達或串聯(lián)聚合表達。共表達能提高特定目標蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因。對蛋白質序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點進行改造。在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。第56頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202356

但必須指出的是，由于目標蛋白本身的性質和用途的不同，上述幾種方法在使用上是受到一定的限制的。主要表現(xiàn)為：大腸桿菌對分子量較大的目標蛋白的較運和分泌效率一般比較低，不能滿足大規(guī)饃制備的需要。蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛，生長速率慢，使高密度發(fā)酵比較困難。融合表達使目標蛋白的構象與天然狀態(tài)不一樣，導致生物比活力降低，甚至沒有活性。融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學的方法切割出單體目標蛋白。酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除?；瘜W法比酶法成本低，但不少裂解試劑有毒性。對蛋白質序列進行改造需要有基本的蛋白質結構數(shù)據(jù)，而目前這方面的數(shù)據(jù)庫還不完整。第57頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202357優(yōu)化發(fā)酵過程：工藝的優(yōu)化生物學因素的優(yōu)化第58頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202358工藝的優(yōu)化擴大培養(yǎng)的條件優(yōu)化反應器的優(yōu)化第59頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202359生物學因素的優(yōu)化溶氧量pH值溫度培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基的混合情況第60頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202360四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞

大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個菌體對目標基因的表達水平基本不變的前提下，通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實現(xiàn)總表達量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種

第61頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202361構建出產乙酸能力低的工程化宿主菌

高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導致菌體生長速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對目標基因的高效表達有明顯的阻抑作用。這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問題。雖然在發(fā)酵過程中可采取通氧氣，提高攪拌速度，控制補料速度等措施來控制溶氧飽和度，減少乙酸的產生。但從實際應用上看，這些措施都有一定的滯后效應，難以做到比較精確的控制。因此構建出產乙酸能力低的工程化宿主菌，是從恨本上解決問題的途徑之一。第62頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202362芽孢桿菌表達系統(tǒng)芽孢桿菌是對人畜無害的革蘭氏陽性土壤微生物。細菌細胞壁內不含內毒素，能分泌大量蛋白到胞外，目前已成為一些重要工業(yè)酶制劑的生產菌種。第63頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023631、多為非致病性微生物2、培養(yǎng)條件簡單，生長迅速3、表達產物能分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，且多數(shù)表達產物具有天然構象和生物學活性4、遺傳背景比較清楚，便于進行遺傳操作5、培養(yǎng)發(fā)酵技術比較成熟第64頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202364芽孢桿菌表達系統(tǒng)的不足1、芽孢桿菌分泌的蛋白酶量大、種類多，對外源基因表達產物的穩(wěn)定性形成很大威脅2、載體不穩(wěn)定，易造成外源基因的丟失第65頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202365芽孢桿菌表達載體復制子：目前廣泛應用于芽孢桿菌表達載體的復制子有：1、來源于金色葡萄球菌的復制子如pUB110、pC194和pE194等質粒表達載體。2、來源于小芽孢桿菌的復制子如pHY481、pWT481等。第66頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202366芽孢桿菌表達載體啟動子：在利用芽孢桿菌表達體系時，必需使用芽孢桿菌能夠識別的啟動子。芽孢桿菌含有多種轉錄起始識別因子(σ)，在芽孢桿菌中已鑒定的σ

已達十種。啟動子可被特異的σ

因子識別。芽孢桿菌啟動表達具有明顯的時序性，與菌體的生長周期和生理代謝活動密切相關。第67頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202367表達載體：1、自主復制質粒芽孢桿菌的自主復制質粒大多為無抗性標志的隱蔽質粒。帶有抗性標志的自主復制質粒主要來自其它革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌如pUB110、pC194和pE194，并在這些質粒的基礎上構建了雙標記質粒等載體。自主復制質粒不穩(wěn)定，在復制過程中易發(fā)生丟失。第68頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023682、整合質粒：在大腸桿菌質粒的基礎上增加一個芽孢桿菌的抗性標志，以及待整合的目的基因。因其沒有芽孢桿菌的復制子，不能自主復制，整合到芽孢桿菌染色體后，隨細胞復制而復制。3、噬菌體：Φ105、SPβ及其它噬菌體均可作為芽孢桿菌的表達載體。其中Φ105是一種溫和噬菌體。第69頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202369宿主菌：野生型芽孢桿菌能分泌大量的胞外蛋白酶，影響外源基因表達產物的穩(wěn)定性，因此在構建芽孢桿菌表達系統(tǒng)宿主菌時要將蛋白酶基因進行突變，使其滅活或將活性降低。目前應用較多的宿主菌主要有枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等。第70頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202370枯草芽孢桿菌能分泌6種不同的胞外蛋白酶，即枯草桿菌蛋白酶、胞外蛋白酶、金屬蛋白酶、桿菌肽酶及中性蛋白酶A和B。對其中3～5種胞外蛋白酶基因進行突變，可將胞外蛋白酶的活性降低至原來的1％；若將6種胞外蛋白酶基因全部突變，則胞外蛋白酶活性可降至原來的0.3%左右。第71頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202371短小芽孢桿菌表達體系的優(yōu)點：1、能對許多蛋白質進行分泌表達2、胞外蛋白酶活性較低3、短小芽孢桿菌分泌胞外蛋白酶的同時還能產生蛋白酶抑制劑，不同短小芽孢桿菌分泌抑制劑的能力不同，使胞外蛋白酶的活性差異很大第72頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023724、細胞壁的結構由三層組成，最外兩層為蛋白層，內層為肽聚糖。細胞壁的結構與細胞的生長周期有關。在生長穩(wěn)定前期，細胞壁的外層和中層蛋白開始從細胞表面脫落，分泌型蛋白開始表達；進入穩(wěn)定期后，細胞壁的蛋白層全部脫落，細胞壁蛋白仍然表達導致細胞壁蛋白在培養(yǎng)基中大量累積。第73頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023735、利用細胞壁蛋白基因的啟動區(qū)、操縱區(qū)、翻譯起始區(qū)和蛋白質信號肽序列等元件表達外源基因，可使外源基因在小芽孢桿菌表達系統(tǒng)中獲得高效分泌表達。第74頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202374芽孢桿菌中高效表達的策略1、提高表達質粒在細胞中的穩(wěn)定性：以金黃色葡萄球菌為基礎構建的一系列質粒在進行滾環(huán)復制時會產生許多單鏈DNA，這些單鏈DNA的存在會對質粒DNA造成影響，在沒有選擇壓力的情況下易發(fā)生丟失；某些表達質粒載體還含有染色體DNA同源序列，在細胞分裂的過程中可發(fā)生同源交換，導致質粒的消失。第75頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023752、構建新型的表達質粒：通過消除表達載體中與宿主菌染色體DNA的同源序列3、構建整合型質粒：利用質粒中與染色體的同源序列構建整合型質粒，使目的基因整合到染色體上4、滅活芽孢桿菌胞外蛋白酶第76頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202376鏈霉菌表達系統(tǒng)鏈霉菌是一類好氧、絲狀的革蘭氏陽性細菌，廣泛存在于土壤中，能夠產生多種生理活性物質。鏈霉菌的染色體為線狀結構，在中間含有復制起始點和共價結合的末端蛋白，DNA不穩(wěn)定，有時會出現(xiàn)缺失而環(huán)化，但對細菌生長沒有嚴重影響。第77頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202377鏈霉菌表達系統(tǒng)的特點；1、為非致病性細菌，不產生內毒素2、可進行外源蛋白的分泌表達3、可進行高密度培養(yǎng)，具有豐富的次級代謝途徑和初、次級代謝調控體系，表達外源蛋白的時間較長4、鏈霉菌在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中應用歷史悠久，有良好的工業(yè)化基礎第78頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202378鏈霉菌表達載體啟動子：鏈霉菌基因啟動子的結構表現(xiàn)為多樣性，至少存在三類鏈霉菌基因啟動子：1、與大腸桿菌基因－10區(qū)和－35區(qū)類似的啟動子，－10區(qū)堿基序列通常為5’TAGPuPuT3’，－35區(qū)堿基序列為5’TTGCPu3’，這種啟動子序列可被大腸桿菌RNA聚合酶識別，這類啟動子一般在細菌對數(shù)生長期啟動相關基因的轉錄。第79頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023792、僅與大腸桿菌基因－10區(qū)類似的啟動子。3、與大腸桿菌基因－10區(qū)與－35區(qū)序列均不相同的啟動子。終止子：鏈霉菌基因終止子結構具有較長的不完全互補反向重復序列，能形成發(fā)卡結構，在多數(shù)情況下不含寡聚T序列，轉錄終止位點位于終止子結構下游的鄰近區(qū)域第80頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202380核糖體結合位點：鏈霉菌基因核糖體結合位點的序列類似于其他原核生物的SD序列：5’(a/g)GGAGG3’相對于其他革蘭氏陽性細菌而言，鏈霉菌基因中核糖體序列的保守性略低，與起始密碼之間的距離為5～12個堿基。鏈霉菌基因轉錄起始位點與編碼區(qū)之間的距離變化也較大，從數(shù)個bp到幾百個不等。第81頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202381密碼子：鏈霉菌對編碼蛋白質的密碼子具有明顯的偏愛性。對數(shù)十種鏈霉菌蛋白質的密碼子進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，編碼蛋白質的堿基序列中GC的平均含量高達73％，密碼子的第一、第二和第三位堿基的GC含量分別為66％、53％和93％。有些簡并密碼子的使用頻率不足2％。第82頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202382鏈霉菌表達載體1、高拷貝載體：普遍采用的是pIJ101，在鏈霉菌中的拷貝數(shù)為40～800。通常加入硫鏈絲霉素、紅霉素、紫霉素和新霉素作為抗性選擇性標記。pIJ702是pIJ101的衍生質粒，含有mel(酪氨酸酶)和tsr基因作為選擇性標記。外源基因可插入滅活mel基因，因不產生黑色素而非常方便使用。第83頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023832、低拷貝載體：由SCP2*衍生的質粒pIJ922和940等，可接受較大的外源基因，但只有1～2個拷貝。3、穿梭質粒載體：可在大腸桿菌中完成構建和復制，在鏈霉菌細胞中進行表達。4、噬菌體載體第84頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202384宿主菌：鏈霉菌基因表達系統(tǒng)的宿主菌主要有變鉛青鏈霉菌和天藍色鏈霉菌。天藍色鏈霉菌是整個霉菌中分子遺傳學研究最清楚的菌株，但有較強的修飾系統(tǒng)，因而在實際應用中都是以變鉛青鏈霉菌作為外源基因表達的受體菌系統(tǒng)。第85頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202385變鉛青鏈霉菌表達外源基因的優(yōu)點1、遺傳背景清楚，不含內源性質粒2、對外源DNA無明顯的修飾作用3、能夠高效表達鏈霉菌基因以外的其他基因；4、具有高效的異源蛋白分泌系統(tǒng)，并且其內源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。第86頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202386在鏈霉菌中高效表達外源基因的策略影響外源基因在鏈霉菌中表達的因素包括：啟動子的特性信號肽的序列基因的結構和發(fā)酵條件等第87頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202387啟動子的影響：鏈霉菌RNA聚合酶能識別某些原核生物的啟動子，但不能識別真核生物基因的啟動子，因此表達真核生物基因時要采用鏈霉菌的啟動子。為高效表達要對其進行適當?shù)男揎椇透脑?。如在啟動子的?0區(qū)和－35區(qū)內插入GC堿基對可明顯提高外源基因的轉錄效率；將ermE啟動子中缺失3個堿基對，可使基因啟動轉錄的效率大大增加。第88頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202388信號肽序列：針對要表達的外源蛋白對信號肽序列進行優(yōu)化是實現(xiàn)外源蛋白高效分泌表達的重要途徑。在信號肽N－區(qū)的電荷數(shù)增加或減少可使分泌表達的效率成倍的增加或降低；信號肽與目的蛋白的距離也影響到外源蛋白的分泌。信號肽只影響分泌與否而不影響表達的效率。第89頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202389基因結構的影響：1、密碼子的影響：應盡可能不出現(xiàn)鏈霉菌中的稀有密碼子。鏈霉菌中翻譯的起始密碼子一般為ATC或GTC,終止密碼為TAA或TAG。2、SD序列：不同的宿主其SD序列不同，針對不同的鏈霉菌對SD序列進行改造或修飾以提高外源基因的表達。第90頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023903、終止子：選擇合適的終止子可提高RNA聚合酶的利用率和增加mRNA的穩(wěn)定性發(fā)酵條件：包括發(fā)酵工藝、培養(yǎng)基組分、各種環(huán)境因素如溫度、pH值和溶氧等一系列相關條件，這些條件的確定須經實驗反復摸索。第91頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202391藍藻表達系統(tǒng)藍藻是近年來迅速發(fā)展起來的一種很好的表達系統(tǒng)，藍藻含有葉綠素和藻膽色素，具有光合系統(tǒng)，進行光合作用。藍藻還具有原核生物的特征，無細胞核及雙層膜結構的細胞器，染色體DNA裸露，是典型的原核生物。第92頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202392藍藻表達系統(tǒng)的特點作為表達外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點，表現(xiàn)為：1、基因組為原核型，除了裸露的染色體DNA外，不含葉綠體DNA和線粒體DNA，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源DNA檢測；2、細胞壁為革蘭氏陰性，便于外源DNA的轉化；第93頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023933、營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、CO2、無機鹽、水和適宜的溫度；4、多種藍藻含有內源質粒，為構建藍藻質粒載體提供了極好的條件；5、藍藻富含蛋白質，并且多數(shù)藍藻無毒，經常作為食品或保健品的添加劑。第94頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202394藍藻外源基因表達載體為使外源目的基因的有效轉化及表達，已構建了一系列穿棱質粒表達載體和基因整合平臺系統(tǒng)，如：pZL、pPKE2、pPKET等。在這些表達載體上組裝了多種含有不同啟動子的基因表達盒。應用較多的有噬菌體PL和PR啟動子及藍藻藻藍蛋白cpcB2A2操縱子啟動子和熱休克基因groESL等。第95頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202395在藍藻細胞中高效表達外源目的基因的策略1、構建在藍藻細胞中穩(wěn)定性好的表達載體系統(tǒng)：現(xiàn)已構建了松馳質粒復制起始點的穿梭質粒，在細胞中有較高的基因拷貝數(shù)，提高了目的基因高效表達的可能性。第96頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023962、重組穿梭質粒在藍藻細胞中通常是很不穩(wěn)定的，在缺選擇壓力的培養(yǎng)條件下很容易丟失，導致目的基因表達的不穩(wěn)定性。近年來以藍藻染色體DNA的非必需序列區(qū)為基因整合平臺，構建相應的供體質粒表達載體，通過同源重組將目的基因整合到藍藻染色體上保證其穩(wěn)定。第97頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023973、組裝含強啟動子的外源表達盒。4、外源基因融合表達：近年來開發(fā)了泛素融合表達系統(tǒng)。經藍藻、大腸桿菌及酵母細胞的實驗證明，目的基因泛素基因融合表達可大大提高目的基因的表達量，并且?guī)缀跛蟹核厝诤闲问疆a生的蛋白質都是具有活性的，同時，泛素還可被作為分離標簽。第98頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202398基因表達產物的檢測與分離純化外源基因的表達包括轉錄和翻譯兩個階段。因此，外源基因表達產物的檢測過程就是對特異性mRNA和蛋白質的檢測。對mRNA檢測的主要方法為Northern雜交法，檢測特異性蛋白質的方法包括生化反應檢測法、免疫學檢測法和生物學活性檢測法等。第99頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/202399外源基因轉錄產物的檢測外源基因轉移到受體細胞后可能有的命運是：1、外源基因與表達載體一起游離于染色體外進行轉錄2、外源基因整合到染色體上并進行轉錄3、外源基因整合到染色體上后不轉錄，表現(xiàn)為基因沉默第100頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023100Northern雜交檢測mRNA步驟：1、提取總RNA2、分離mRNA(利用親和層析的原理純化)3、制備RNA探針。(根據(jù)mRNA序列合成同源DNA探針或以cDNA探針)4、Northern雜交第101頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023101報告基因的酶法檢測報告基因的特點1、表達產物及其功能在未轉化的受體細胞中不存在2、報告基因的表達產物便于檢測第102頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023102基因工程中使用的報告基因：1、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)：催化乙酰輔酶A中的乙酰基團轉移到氯霉素分子上而使氯霉素失活。真核生物細胞中不含CAT，重組后細胞產生氯霉素抗性。CAT的活性可以通過反應底物乙酰CoA的減少或乙氯霉素的增加表示。第103頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023103基因工程中使用的報告基因：2、β-葡萄糖苷酯酶基因(GUS)編碼產物催化β-葡萄糖苷酯類物質的水解。大多數(shù)植物細胞、細菌細胞和真菌中都不存在內源GUS活性而廣泛用作轉基因植物、細菌和真菌的報告基因。另外常用的報告基因有二氫葉酸還原酶、胸苷激酶、熒光素酶等第104頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023104免疫學檢測：是基因表達產物檢測中最常用的方法之一。以表達產物作為抗原，通過與特異性抗體發(fā)生反應來確定基因表達的情況。主要方法有1、免疫沉淀法2、酶聯(lián)免疫吸附法3、Westhern印跡法4、固相放射免疫法等第105頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023105免疫沉淀法的過程1、對靶細胞進行放射性標記：通常以同位素35S標記靶蛋白，在培養(yǎng)基中加入〔35S〕的蛋氨酸和半胱氨酸的混合物，通過代謝過程使哺乳動物培養(yǎng)細胞標記上放射性同位素。2、細胞裂解釋放靶抗原3、靶蛋白的免疫沉淀將抗靶蛋白的特異性抗體加入到細胞裂解液中形成抗原-抗體復合物并回收。第106頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/20231064、將回收的靶蛋白在反應試管中與蛋白抗體，使之與靶蛋白結合并形成沉淀。5、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析第107頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023107酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)1、抗體制備：ELISA檢測中的抗體包括普通抗體和酶標記抗體，其中酶標記的抗體又分為針對特異抗原的酶標一抗和針對一抗的酶標二抗2、抗體或抗原的包被：通過物理吸附法和共價交聯(lián)法等將抗原或抗體固定在固相載體的表面第108頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/20231083、免疫反應：特異性抗原與固相抗體結合形成抗原-抗體復合物，再與酶標抗體反應形成抗原-抗體-酶標抗體復合物4、特異性表達產物的檢測：洗去未發(fā)生反應的抗體，加入顯色劑或熒光底物，通過酶促反應發(fā)生顏色或熒光強度變化以確定抗原的量。第109頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023109Westhern印跡法1、總蛋白質的提取2、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳3、蛋白質印跡4、探針的制備(針對目的蛋白的抗體［一抗］它一般不進行標記，而與一抗結合的二抗帶特定的標記)5、雜交檢出生物學活性檢測第110頁，共117頁，2023年，2月20日，星期三2/28/2023110基因表達產物的分離純化1、細胞破碎