生物防腐劑乳酸鏈球菌素在食品中的應(yīng)用

生物防腐劑乳酸鏈球菌素在食品中的應(yīng)用乳酸鏈球菌素（Nisin）Nisin是通過(guò)現(xiàn)代生物技術(shù)，從乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)物中提取的、具有抗菌活性的多肽物質(zhì)。分子結(jié)構(gòu)式\>iCOOM分子結(jié)構(gòu)式\>iCOOMNisin的主要特點(diǎn)：TNisin進(jìn)入人體即被體內(nèi)蛋白酶分解為多種氨基酸，無(wú)殘留，安全可靠。，可降低食品滅菌溫度，縮短滅菌時(shí)間，減少食品營(yíng)養(yǎng)破壞。T對(duì)引起食物腐敗的陽(yáng)性菌，尤其是耐熱芽抱有強(qiáng)烈的抑制作用。乳酸鏈球菌素是一種世界公認(rèn)的、安全的天然生物性食品防腐劑和抗菌劑，主要用丁乳和乳制品、肉和肉制品的防腐保鮮。乳酸鏈球菌素的發(fā)現(xiàn)要追溯到上世紀(jì) 20年代，1928年，LA.Rogers等美國(guó)研究人員首先報(bào)道了乳酸鏈球菌代謝產(chǎn)物能抑制其他乳酸菌的生長(zhǎng)。 1947年，A.T.R.Mattick等人發(fā)現(xiàn)血活學(xué)N群中的一些乳酸鏈球菌能產(chǎn)生蛋白類抑菌物質(zhì)，并從乳酸鏈球菌發(fā)酵液中制備出了這種多肽物質(zhì)，由丁是N群中的乳酸菌所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，故命名為N-inhibitorySubstance,即N群抑菌物質(zhì)，簡(jiǎn)稱為Nisin。Nisin是乳酸鏈球菌的一種天然產(chǎn)物，對(duì)遠(yuǎn)超過(guò)食品應(yīng)用量的乳酸鏈球菌素的蠹性研究表明，它是無(wú)蠹的。由丁其對(duì)蛋白水解酶（a-胰蛋白酶）特別敏感，因此食用后在消化道內(nèi)即可很快被蛋白水解酶水解成氨基酸。1953年，乳酸鏈球菌素的第一批商業(yè)產(chǎn)品Nisaplin在英國(guó)面市；1969年，F(xiàn)AO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)批準(zhǔn)乳酸鏈球菌素可作為一種食品添加劑 ；1988年，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）也正式批準(zhǔn)將乳酸鏈球菌素應(yīng)用丁食品中；1990年，我國(guó)衛(wèi)生部食品監(jiān)督部門簽發(fā)了乳酸鏈球菌素在中國(guó)的使用合格證明書。目前已有 50多個(gè)國(guó)家批注允許使用乳酸鏈球菌素。法規(guī)安全作為一種世界公認(rèn)的安全的食品防腐劑，很多國(guó)家對(duì)Nisin在食品中的添加量都不作任何限制擬增加使用范圍和用量：?04.02.02.03腌漬蔬菜、04.02.02.04蔬菜罐頭、04.03.02加工食用菌和藻類，最大用量為800mg/kg；?07.01面包、07.02糕點(diǎn)，最大用量為500mg/kg。GB2760-2014規(guī)定Nisin在食品中的最大使用量如下：?01.0乳及乳制品（巴氏殺菌乳、滅菌乳除外）、 08.02預(yù)制肉制品、08.03熟肉制品、09.04熟制水產(chǎn)品中，最大用量為500mg/kg；?06.04.02.02其他雜糧制品、06.07方便米面制品、10.03蛋制品（改變其物理性狀）中，最大用量為250mg/kg；?04.03.02.04食用菌和藻類罐頭、06.04.02.01雜糧罐頭、12.04醬油、12.05醬及醬制品、12.10復(fù)合調(diào)味料、14.0飲料（包裝飲用水除外）中，最大使用量為200mg/kg;?12.03醋中最大使用量為150mg/kg。孚L酸鏈球菌素的特性溶解性Nisin是一種白色或灰白色的固體粉末，使用時(shí)需溶于水或液體中，它的溶解度主要取決于溶液的pH值，在水中的溶解度隨pH的下降而升高。即pH在5.0時(shí)溶解度為4g/100ml,pH在2.5時(shí)溶解度為12g/100ml,pH等于或大于7.0時(shí)溶解度約為0,幾乎不溶解，產(chǎn)品中由于含有乳蛋白，其水溶液呈輕微的混濁。所以在應(yīng)用時(shí)，一般先用鹽酸溶解后再加入到食品中。穩(wěn)定性Nisin的穩(wěn)定性主要取決于溫度，pH值，基質(zhì)等因素，Nisin在酸性條件下呈現(xiàn)最大的穩(wěn)定性，其熱穩(wěn)定性隨著pH的增加而減弱［2］。當(dāng)Nisin溶于pH=3的稀鹽酸中，經(jīng)121C、15min高壓滅菌，仍能保持100%的活性。當(dāng)pH超過(guò)4時(shí)，特別是加熱條件下，它在水溶液中的分解速度加快，活力降低；在pH等于5.0時(shí)，滅菌后喪失40%活力;pH等于6.8時(shí)，滅菌后喪失90%活力。但在乳酸鏈球菌素加入食品后，由于受到牛奶、肉湯等中的蛋白質(zhì)大分子的保護(hù)，其穩(wěn)定性將大大的提高。孚L酸鏈球菌素的優(yōu)越性高效抑菌Nisin不抑制革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌，專抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，特別是細(xì)菌芽抱。如對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肉蠹梭菌、嗜熱脂肪芽抱桿菌以及利斯特氏菌等多種腐敗菌和食物病原菌有強(qiáng)烈的抑制作用。只要在食品中添加Nisin就可對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有強(qiáng)烈的抗菌活性，它與其他防腐劑聯(lián)合使用能增強(qiáng)其抑菌作用，獲得較寬的抑菌譜，如乳酸和Nisin合用能抑制肉中的金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。Nisin和螯合劑合用時(shí)能有效地減少革蘭氏陰性菌的數(shù)量，如Nisin與檸檬酸鹽、磷酸鹽合用也能提高其對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果。安全性高Nisin是乳中存在的一種天然成分，千白年來(lái)被人們食用未見(jiàn)蠹性問(wèn)題，其生產(chǎn)菌種從奶中分離，采用發(fā)酵方法獲得產(chǎn)物，物理方法提取，沒(méi)有化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。乳酸鏈球菌素對(duì)蛋白酶特別敏感，進(jìn)入人體后可被消化道a?胰凝聚蛋白酶降解為多種氨基酸，可吸收，無(wú)殘留,不產(chǎn)生抗藥性，不影響人體益生菌，與其它抗生素不產(chǎn)生交義抗性。研究證明 Nisin是安全的，LD50為7000mg屆實(shí)際無(wú)蠹級(jí)。1992年3月，我國(guó)衛(wèi)生部在批準(zhǔn)實(shí)施的文件中就明確指出：“可以科學(xué)的認(rèn)為乳酸鏈球菌素作為食品保藏劑是安全的?！比樗徭溓蚓氐囊志秶樗徭溓蚓啬軌蛴行б种苹驓⑺酪鹗称犯瘮∽冑|(zhì)的革蘭氏陽(yáng)性菌，濃度為100ppm時(shí)就可以殺死大多數(shù)的革蘭氏陽(yáng)性菌，能抑制葡萄球菌屆、鏈球菌屆、乳桿菌屆及微球菌屆的某些菌種 ；對(duì)大部分的梭菌屆和芽抱桿菌屆及其芽抱也有明顯的抑制作用。 Hitchins,A.D等研究表明，桿菌屆中的嗜熱脂肪芽抱桿菌的芽抱對(duì)Nisin最為敏感，極少量的Nisin即能夠殺死其芽抱，Nisin對(duì)芽抱的作用是在抱子膨脹起始階段抑制其萌發(fā)，而不是殺死。由于Nisin抗菌譜窄，僅能殺死或抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，而對(duì)于革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌則無(wú)明顯作用，故使其應(yīng)用受到限制，將Nisin與其他防腐劑配合使用可以彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)，進(jìn)而發(fā)揮廣譜抑菌作用。有研究表明，Nisin與其他防腐劑聯(lián)合使用能增強(qiáng)自身的抑菌作用，可獲得較寬的抑菌譜。Nisin和乳酸合用能抑制肉中的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。 Nisin與螯合劑（如EDTA）聯(lián)合使用，對(duì)沙門氏菌具有一定的抑制作用，并能夠有效減少其他 G-菌的數(shù)量。此外，Nisin與磷酸鹽、檸檬酸鹽合用也能提高其對(duì)G-菌的抑制效果。

研究表明，Nisin是一個(gè)疏水、帶正電荷的小肽，它能夠吸附在革蘭氏陽(yáng)性敏感菌的細(xì)胞膜上，與細(xì)胞壁中帶負(fù)電荷的物質(zhì)（如磷壁酸、糖醛酸、酸性多糖或磷脂）作用，能夠通過(guò)C末端的作用侵入到細(xì)胞膜中形成通透孔洞，抑制革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的合成，改變細(xì)胞膜的通透性，引起細(xì)胞中的小分子物質(zhì)流出，同時(shí)，細(xì)胞外水分子流入，最后導(dǎo)致細(xì)胞自溶死亡。Nisin對(duì)許多G+菌有抗菌活性，但對(duì)G-菌、酵母菌和霉菌沒(méi)有作用。對(duì)比G+細(xì)菌和G-細(xì)菌的細(xì)胞壁，可以發(fā)現(xiàn)G+菌的肽聚糖層明顯比G-菌厚得多，而G-菌的細(xì)胞壁組成比較復(fù)雜，主要包括蛋白質(zhì)、磷脂和脂多糖等，十分致密，僅能允許分子量在 600Da以下的小分子通過(guò)，而Nisin分子量約為3510Da，所以無(wú)法通過(guò)致密的細(xì)胞壁，因此，Nisin就不能到達(dá)細(xì)胞膜進(jìn)而發(fā)揮殺菌作用。為了進(jìn)一步證實(shí)這一說(shuō)法，Steven及Kordel等研究報(bào)道，經(jīng)過(guò)處理改變G-菌的外壁的透過(guò)性質(zhì)之后，G-菌也對(duì)Nisin變得敏感，也可以被抑制或殺死。這就有力證明了 G-菌對(duì)Nisin不敏感是因?yàn)榧?xì)胞壁太厚,Nisin分子進(jìn)不去。在Nisin殺菌過(guò)程中，其分子中所含的稀有氨基酸對(duì)Nisin的作用方式很大，對(duì)這一問(wèn)題的研究進(jìn)行得相當(dāng)活躍，主要是通過(guò)蛋白質(zhì)工程的手段，定向改變 Nisin分子中一個(gè)或一段氨基酸的組成，以對(duì)其功能進(jìn)行研究。對(duì)這一領(lǐng)域的研究將使人們進(jìn)一步了解Nisin的作用機(jī)制，以便擴(kuò)大應(yīng)用范圍或增強(qiáng)作用效果。乳酸鏈球菌素的安全性乳酸鏈球菌素是一種天然的多肽物質(zhì)，食用后可被人體內(nèi)的蛋白酶 （如胰蛋白酶、胰酶、唾液酶等）消化分解成氨基酸，無(wú)微生物蠹性或致病作用，因此其安全性較高。1956年，英國(guó)食品防腐劑委員會(huì)證實(shí)了在牛奶和十酪中自然存在有不同數(shù)量的乳酸鏈球菌素;1962年日本的Hara等證實(shí)乳酸鏈球菌素對(duì)小白鼠的半致死量LD50約為7g/kgbw,與普通鹽的LD50值相近;英國(guó)和前蘇聯(lián)的商業(yè)部門對(duì)其生產(chǎn)的乳酸鏈球菌素進(jìn)行了廣泛的蠹性和生物學(xué)研究，包括致癌性、存活性、再生性、血液化學(xué)、腎功能、腦功能、應(yīng)激反應(yīng)及動(dòng)物器官病理學(xué)等諸多方面研究證明，Nisin是安全的。通過(guò)蠹理學(xué)試驗(yàn)證明，乳酸鏈球菌素小鼠經(jīng)口急性蠹性：雌性小鼠LD50為6.81g/kgbw，雄性小鼠LD50為9.26g/kgbw,屆于實(shí)際無(wú)蠹性。乳酸鏈球菌素大鼠經(jīng)口急性蠹性：雌性大鼠LD50為6.81g/kgbw，雄性大鼠LD50為14.70g/kgbw,屆于實(shí)際無(wú)蠹性。結(jié)果表明：乳酸鏈球菌素是安全的。美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)規(guī)定已將乳酸鏈球菌素列為“一般公認(rèn)為安全的（GRAS）”范圍。1992年3月，我國(guó)衛(wèi)生部在批準(zhǔn)實(shí)施的文件中就明確指出：“可以科學(xué)地認(rèn)為乳酸鏈球菌素作為食品保藏劑是安全的”。目前全世界已有近 50個(gè)國(guó)家制定了法律規(guī)定乳酸鏈球菌素作為食品防腐劑的使用范圍和極限使用量，而英國(guó)、法國(guó)、澳大利業(yè)等20多個(gè)國(guó)家則沒(méi)有限量使用的規(guī)定。乳酸鏈球菌素的應(yīng)用舉例Nisin在肉制品中的應(yīng)用Nisin很早就已在國(guó)外應(yīng)用于肉制品中，并廣泛應(yīng)用于肉類、魚(yú)類的防腐保鮮。據(jù)研究，在不影響香腸、火腿色澤和防腐效果的情況下加入乳酸鏈球菌素，可使業(yè)硝酸鹽含量明顯降低。在魚(yú)類防腐方面，乳酸鏈球菌素還具有延遲熏制魚(yú)中存在的肉蠹梭菌芽抱蠹素形成的作用。 Rayman（1981）發(fā)現(xiàn)業(yè)硝酸鹽同乳酸鏈球菌素結(jié)合使用具有協(xié)同作用， Nisin可作為一種有效的替代物，減少火腿中發(fā)色劑的用量。Nisin能有效控制肉制品中微生物的生長(zhǎng)，尤其是抑制產(chǎn)生蠹素的肉蠹梭狀芽抱桿菌的活性，并且Nisin本身呈酸性，能降低周圍介質(zhì)的pH值，因而能降低殘留的業(yè)硝酸鹽含量，減少業(yè)硝胺的形成。另外，在加工過(guò)程中，過(guò)分的熱處理會(huì)明顯改變?nèi)庵破返馁|(zhì)地及外觀，加入Nisin后僅需45%的熱處理即可延長(zhǎng)其貯存期。Nisin在我國(guó)肉制品的應(yīng)用僅限于研究階段。在香腸中應(yīng)用在傳統(tǒng)的香腸生產(chǎn)中，普遍使用業(yè)硝酸鹽等發(fā)色劑進(jìn)行發(fā)色并抑制肉蠹梭狀芽抱桿菌的生長(zhǎng)，隨后業(yè)硝酸鹽與肉蠹素反應(yīng)產(chǎn)生腌制紅色和腌制風(fēng)味。當(dāng)人們食用香腸的同時(shí)，也食用一定量的業(yè)硝酸鹽，與體內(nèi)的胺類物質(zhì)作用生成一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)一一業(yè)硝胺化合物，若添加 Nisin到香腸中可降低業(yè)硝酸鹽的用量，乂能有效地延長(zhǎng)香腸的保質(zhì)期。據(jù)袁秋萍的試驗(yàn)表明，按傳統(tǒng)工藝制作的香腸，業(yè)硝酸鹽的添加量為0.15g/kg,經(jīng)檢測(cè)菌落總數(shù)為12000個(gè)/g,若添加0.2g/kgNisin,業(yè)硝酸鹽的添加量減少到0.04g/kg,則香腸中的菌落總數(shù)降低到3200個(gè)/g,抑菌效果明顯，而且香腸的色、香、味與傳統(tǒng)的比較，沒(méi)有明顯的區(qū)別。在豬肉絲中的應(yīng)用目前，在豬肉絲等肉十制品的生產(chǎn)中，普遍使用山梨酸鉀作為防腐劑，由于山梨酸鉀適用于 pH5.5以下的食品防腐，而肉類制品是中性食品，因此山梨酸鉀對(duì)肉類制品的防腐效果不其理想。袁秋萍采用乳酸鏈球菌素代替山梨酸鉀進(jìn)行試驗(yàn)，添加量為 0.4g/kg時(shí)，所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)［6］,這說(shuō)明革蘭氏陰性菌在煮制、加料燒十及烘培等工序中已被完全殺滅，受到熱損傷的耐熱芽抱桿菌此時(shí)也基本上完全被控制，其抑菌效果明顯優(yōu)于山梨酸鉀，在口感上，添加Nisin的樣品口味純正，有利于提高產(chǎn)品的質(zhì)量。在烤肉中的應(yīng)用焦曉霞為了適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)烤肉的貨架期，考慮在烤肉中添加適量的 Nisin,進(jìn)行了大量試驗(yàn)。在其方案一中，Nisin的抑菌效果并不理想，樣品在28C恒溫保存5-6d，就發(fā)生了質(zhì)變酸??；在方案二中，另加入了0.04%的山梨酸，效果比空白實(shí)驗(yàn)的保質(zhì)期延長(zhǎng)了一星期之久；在方案三中，找出了一種更有效便捷的添加方式，保質(zhì)期得到了大大的延長(zhǎng)。因此，從她的實(shí)驗(yàn)來(lái)看，在烤肉中添加適量的Nisin對(duì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期確實(shí)起到了一定作用，產(chǎn)品的保質(zhì)期可以從的4-5d延長(zhǎng)到了20d［7］。在冷卻牛肉中的應(yīng)用山東農(nóng)大的羅欣［8］(2000)將Nisin首次添加于牛肉冷卻肉中，用于牛肉的保鮮。探討了不同濃度的乳酸鏈球菌素對(duì)高檔牛肉的保鮮效果，以及與其他類型的防腐保鮮劑之間的相互作用。羅欣將鮮牛肉在2C條件下經(jīng)24h預(yù)冷，用不同濃度的Nisin溶液浸漬30s,瀝十，真空包裝，80C熱水浸漬2s,4C下貯存觀察。結(jié)果表明，75mg/L的Nisin在牛肉冷卻肉的保鮮中起到明顯的抑菌作用，細(xì)菌總數(shù)明顯降低，且保鮮效果隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增強(qiáng)。 Nisin與食品常用保鮮劑丙酸鈣問(wèn)無(wú)交互作用，與乳酸鈉具有協(xié)同作用，與山梨酸鉀具有拮抗作用。在扒雞中的應(yīng)用為了提高扒雞的質(zhì)量，延長(zhǎng)貨架期，還連棟［9］(2000)等將Nis