2022年醫(yī)學專題-生化反應器-第五章-動植物細胞培養(yǎng)動力學

第五章

動植物細胞培養(yǎng)動力學

第一頁，共四十八頁。5．1動植物細胞培養(yǎng)的特性(tèxìng)動植物細胞培養(yǎng)技術是一項將動植物組織、器官或細胞在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行離體培養(yǎng)的技術。組織是指由結構和功能相似的細胞和細胞間質組成，具有(jùyǒu)一定形態(tài)和生理功能的聚集體。器官是指機體中具有特殊結構和完成特殊功能的分化部分。組織與器官的培養(yǎng)是指在人工條件下，使它們得以繼續(xù)生存或發(fā)展的一種培養(yǎng)方法。根據(jù)培養(yǎng)對象的不同，細胞培養(yǎng)分為動物細胞培養(yǎng)與植物細胞培養(yǎng)兩類，下面介紹這兩類細胞培養(yǎng)的基本特征。

第二頁，共四十八頁。5．1．1動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)的特性由于動物細胞體外培養(yǎng)具有明顯的表達產物的優(yōu)點，為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵所無法取代，因此，生物技術中許多有價值的生物制品，需要借助于動物細胞培養(yǎng)而獲得，這種需求極大地促進(cùjìn)了動物細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展。

第三頁，共四十八頁。早在1907年，美國的Harrison在世界上首次將蛙的神經(jīng)組織在試管內培養(yǎng)成功，建立起動物組織體外培養(yǎng)的第一塊基石。1950年前后，Enders及其同事發(fā)表了第一篇關于在培養(yǎng)細胞中生長病毒的報告，開拓(kāituò)了以動物病毒為研究對象的新領域。當時人們已知道在細胞培養(yǎng)物中存在一些有特殊功能的蛋白質，如干擾素、抗生素、疫苗等，但是由于動物細胞的營養(yǎng)要求復雜，培養(yǎng)要求嚴格，長期以來未能利用細胞培養(yǎng)來進行有經(jīng)濟價值的物質的生產。第四頁，共四十八頁。作為大規(guī)模細胞培養(yǎng)，Copsik等成功地進行(jìnxíng)了有關倉鼠腎細胞(BHK)的懸浮培養(yǎng)。隨后，細胞培養(yǎng)的原理與方法日臻完善。采用在培養(yǎng)液中添加人工合成的小球狀惰性聚合體載體，大幅度提高了細胞的產量，并在10000L發(fā)酵罐內成功地進行深層培養(yǎng)。第五頁，共四十八頁。隨著基因工程技術的發(fā)展，人們逐漸認識到有許多基因產物不能在原核細胞內表達，它們需要經(jīng)過真核細胞所特有的翻譯后修飾，以及正確的切割、折疊后，才能形成與自然分子一樣的功能和抗原性，使得動物細胞一躍成為一種重要的宿主細胞，用以生成多種生物制品，如病毒疫苗、淋巴因子(如r干擾素等)、單克隆體、紅細胞生成素、纖維蛋白溶酶原激活劑、第八因子、腫瘤壞死因子、上皮生長因子和過氧化物(ɡuòyǎnɡhuàwù)歧化酶等。采用大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術生產貴重藥品在臨床診斷、治療和預防等方面都有重要意義。第六頁，共四十八頁。動物細胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)對比有許多不同點(表5—1)。主要是動物細胞無細胞壁，機械強度低，適應環(huán)境能力差；生長速度緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時需要抗生素，且大多數(shù)哺乳動物的細胞需附著在固體或半固體的表面才能(cáinéng)生長；對營養(yǎng)要求嚴格；大規(guī)模培養(yǎng)時，不可簡單地套用微生物培養(yǎng)的經(jīng)驗等。

第七頁，共四十八頁。第八頁，共四十八頁。大規(guī)模細胞培養(yǎng)的主要危險之一是微生物污染。設備、培養(yǎng)基、懸浮系統(tǒng)和操作方法等的復雜性都易引起微生物污染，這是細胞培養(yǎng)都存在的一個普遍問題(wèntí)，在大規(guī)模培養(yǎng)中更為嚴重。動物細胞生長十分緩慢，并易被大多數(shù)微生物污染物所破壞。支原體(mycoplasma)對動物細胞培養(yǎng)的威脅最大，因為其感染力強且不易檢出。因此，大規(guī)模細胞培養(yǎng)成功的必要條件是要有一個設備精良的細胞庫(cellbank)。在細胞庫中的冷凍細胞不受污染。

第九頁，共四十八頁。由于動物細胞(xìbāo)無細胞(xìbāo)壁，因此人們一般認為細胞(xìbāo)的脆性是導致培養(yǎng)控制(如溶氧)復雜化的關鍵。然而，選擇堅韌的細胞(xìbāo)，就不存在上述問題。經(jīng)仔細設計的培養(yǎng)裝置可使細胞(xìbāo)懸浮液很好混合，在向培養(yǎng)基內流加基質和輸送氣體時也不會損壞細胞(xìbāo)。第十頁，共四十八頁。動物細胞培養(yǎng)基的配方十分復雜，并且還需補充血清和蛋白胨。原料(yuánliào)的質量控制和培養(yǎng)基的生產是大規(guī)模細胞培養(yǎng)的主要問題。因為血清來源困難，質量不穩(wěn)定，殘留血清給產物提純帶來困難等，所以，常采用無血清培養(yǎng)基。但是，在無血清培養(yǎng)基中更可能出現(xiàn)細胞毒(與水中的微量元素或有機污染有關)。

第十一頁，共四十八頁。因此，與培養(yǎng)物相接觸的水必須采用高純度的水。高純度水的腐蝕性很強，并且(bìngqiě)有從金屬物瀝出元素的能力，所以，凡是與純水接觸的不銹鋼容器和管道的表面都必須進行適當處理。培養(yǎng)基一般需經(jīng)膜過濾器過濾。常用的膜過濾器可保證其無菌狀態(tài)，甚至支原體也可被0．1um的過濾膜濾出。第十二頁，共四十八頁。目前，利用(lìyòng)動物細胞培養(yǎng)的方法生產的有用產品大致可分為4大類：①疫苗；②干擾素；③單克隆抗體；④遺傳重組產品。

第十三頁，共四十八頁?？傊瑒游锛毎囵B(yǎng)過程的特征是：(1)生長速率慢，易被微生物污染，但可采用在培養(yǎng)基中加入抗生素等措施來解決。(2)細胞個體大且無壁，對環(huán)境敏感，因此應慎重解決供氧(攪拌與通風)與細胞脆弱的矛盾(máodùn)。(3)設備放大是一新課題，不能完全按照微生物反應過程的經(jīng)驗。(4)反應過程成本高，主要用于高附加值產物的生產。第十四頁，共四十八頁。第十五頁，共四十八頁。5．1.2植物(zhíwù)細胞培養(yǎng)的特性

有關植物細胞培養(yǎng)的基礎研究很多，而工業(yè)規(guī)模應用卻較少。早在1902年，出生于奧地利的德國植物學家巳Haberlandt就預言植物細胞培養(yǎng)的可能性。1937年前后，法國和美國科學家分別成功地進行了胡蘿卜和煙草的組織培養(yǎng)。隨后，人們(rénmen)認識到生長素等植物激素在組織培養(yǎng)中的作用。第十六頁，共四十八頁。1966年Klein指出，能利用植物(zhíwù)細胞培養(yǎng)物代替栽培植株來生產生化制品。近40年來，植物(zhíwù)細胞培養(yǎng)研究成功的例子已有不少，如用紫草懸浮培養(yǎng)物生產紫草寧，煙草細胞的大量培養(yǎng)等。第十七頁，共四十八頁。與微生物相比，植物細胞具有這樣一些特性(表4—1)：①細胞個大，并且細胞壁是以纖維素為主要成分，耐拉不耐扭，因此，抗剪切能力(nénglì)低。②與動物細胞培養(yǎng)類同，生長速率慢，為防止培養(yǎng)過程中染菌，需加抗生素。③細胞培養(yǎng)需氧，而培養(yǎng)液黏度大，且不能強力通風攪拌。④產物在細胞內且產量低。⑤培養(yǎng)的植物細胞常生長成各種大小的團塊(從幾個細胞到幾百個細胞)，增加了懸浮培養(yǎng)的難度等。第十八頁，共四十八頁。生長緩慢等是植物細胞的先天不足，然而它能產生一些微生物所不能合成的特有代謝產物(chǎnwù)，如朝鮮參皂角苷、桉樹油和某些生物堿等。植物細胞培養(yǎng)技術為大規(guī)模生產這些有用物質提供了新途徑。細胞培養(yǎng)用于試管苗生產，如蘭花等名貴花卉的培育，可以不受環(huán)境的影響。

第十九頁，共四十八頁。利用植物細胞培養(yǎng)技術進行工業(yè)化生產，有產品規(guī)格好；易達到供需平衡；生產占地少等優(yōu)點。進入20世紀90年代以來，伴隨著紫杉醇的研究成功并應用于臨床，植物細胞培養(yǎng)及其次級代謝(dàixiè)產物的研究進入了新的發(fā)展時期，尤其是誘導子、前體飼喂、兩相法培養(yǎng)、質體轉化、毛狀根和冠癭瘤組織培養(yǎng)等新技術和新方法的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展，更顯示了植物細胞培養(yǎng)工程在制藥領域的廣闊發(fā)展前景。第二十頁，共四十八頁。另外，將固定化技術(jìshù)應用于植物細胞培養(yǎng)中的研究對有效改善植物細胞培養(yǎng)中出現(xiàn)的不足有一定成效。可以認為，固定化技術有可能在植物細胞培養(yǎng)中得以應用。

第二十一頁，共四十八頁。5．2生長(shēngzhǎng)模型與培養(yǎng)條件

5．2．1動植物細胞的生長模型微生物的生長是多種環(huán)境因子與細胞內復雜的代謝(dàixiè)反應的綜合結果，生長與環(huán)境因子的關系目前還難以用簡單的方程式來表達。同理，動植物細胞生長是細胞與影響細胞生長的環(huán)境因子相互作用的綜合結果，并且其研究還處于萌芽階段。

第二十二頁，共四十八頁。5．2．1．1碳源與生長(shēngzhǎng)模型

微生物反應中，細胞的生長速率與限制性基質間的關系(guānxì)常用Monod方程來描述。同理，Monod方程也可以用于表達某些碳源與動植物細胞生長速率間的關系。例如，在植物細胞培養(yǎng)過程中，多以蔗糖為碳源，據(jù)安田報道，煙草細胞在分批培養(yǎng)中，細胞的生長速率與蔗糖濃度的關系可利用Monod方程來表達，此時umax＝0．023h-1，Ks＝2．35g/L。第二十三頁，共四十八頁。蔗糖為碳源時，植物細胞首先分解蔗糖為葡萄糖和果糖(guǒtáng)，然后優(yōu)先利用葡萄糖。分別以果糖(guǒtáng)或葡萄糖為碳源分批培養(yǎng)煙草細胞時，前者有umax＝0．038h-1，Ks=0．25g／L，后者為umax=0．038h-1，Ks＝0．94g／L。第二十四頁，共四十八頁。5．2．1．2呼吸(hūxī)與生長模型

由于動植物細胞的培養(yǎng)過程是好氧過程，因此，許多科技工作者研究了與細胞呼吸速率相關的因素。例如，人參細胞培養(yǎng)中，添加椰子汁后細胞的生長速率加快，耗氧量比不添加椰子汁時明顯增大。另外，也有報道，Acer．PsedoplatanusL．細胞培養(yǎng)中，細胞體內(tǐnèi)的含氮量與耗氧量有正比關系。第二十五頁，共四十八頁。一般(yībān)好氧微生物的比生長速率u與菌體的維持常數(shù)m及氧的比消耗速率Qo2有如下關系：第二十六頁，共四十八頁。據(jù)加藤等所獲得的煙草細胞分批培養(yǎng)的結果表明，當氧為細胞生長的限制性因素時,u與Q02有與(5—1)式相似的關系。這說明，植物細胞培養(yǎng)中氧的消耗(xiāohào)，部分用于維持代謝，部分用于生長繁殖，所獲得的m＝0．09mmol／(g·h)，Y＝0．061g／mmol，與一般微生物的m和Y值相比，m很小而Y較大。這可能是植物細胞培養(yǎng)過程中的重要特性。第二十七頁，共四十八頁。5．2．1．3胞內物質與生長(shēngzhǎng)模型

微生物培養(yǎng)中，把細胞內RNA含量作為描述其生長速率的指標，且隨微生物比生長速率的增加，RNA含量增大。植物細胞培養(yǎng)中，也有類似的報道。吉田等在進行人參細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在對數(shù)(duìshù)生長期，細胞的RNA含量顯著增大。培養(yǎng)煙草細胞時，人們詳細研究了細胞的比生長速率與細胞內RNA的關系，發(fā)現(xiàn)其與一般微生物相似，可以用一次方程表達，即第二十八頁，共四十八頁。綜上所述，動植物細胞生長動力學的研究，在很大程度上是借鑒了微生物反應動力學理論(lǐlùn)。從已有的實例看，又多屬于定性探討。

第二十九頁，共四十八頁。5．2．2動植物細胞(xìbāo)的培養(yǎng)操作

5．2．2．1植物細胞的培養(yǎng)操作植物細胞的培養(yǎng)方式根據(jù)植物細胞所處狀態(tài)的不同，分為懸浮培養(yǎng)法與固定(gùdìng)化植物細胞培養(yǎng)法，根據(jù)操作方式的不同，又分為分批式、反復分批式和連續(xù)式培養(yǎng)3種。下面以懸浮培養(yǎng)法(分批、反復分批和連續(xù)培養(yǎng))為例進行介紹。

第三十頁，共四十八頁。(1)分批培養(yǎng)植物細胞的分批培養(yǎng)與微生物的分批培養(yǎng)類同。由于操作簡單，從實驗室到大型罐廣泛應用。分批培養(yǎng)中，植物細胞的生長曲線一般呈s形，可明顯觀察出誘導期、對數(shù)生長期、減速期、靜止期和衰亡期(死亡期)，但是與細菌和酵母菌的培養(yǎng)相比(xiānɡbǐ)，即使是生長速率快的煙草細胞，分批培養(yǎng)時間(一個周期)也要6d以上，這也就是前面所說的植物細胞培養(yǎng)的先天不足——生長緩慢。

第三十一頁，共四十八頁。表5—2表示某些植物細胞分批培養(yǎng)中對數(shù)生長期的u與微生物的比較。即使已知生長較快的煙草細胞的平均世代時間也要15．8h(u＝0.044h-1)，不到酵母(jiàomǔ)比生

長速率的l／10。因此，有必要開發(fā)長期無菌培養(yǎng)技術。

第三十二頁，共四十八頁。第三十三頁，共四十八頁。目前，無論在實驗室還是在工廠中，大至20t罐，廣泛采用(cǎiyòng)分批式操作。藤田開發(fā)的二步培養(yǎng)法是分批培養(yǎng)法的一種變形，同時使用兩個反應器，第一個反應器主要是為大量培養(yǎng)細胞，第二個反應器是為增加目的產物的含量。分批培養(yǎng)中，在一定范圍內增加底物濃度，可增加目的產物的產量，但濃度過高又會造成接種細胞的死亡。第三十四頁，共四十八頁。(2)反復式分批培養(yǎng)若反應器內培養(yǎng)液體積為V，補加(bǔjiā)量為F'(等于取出量)，則比值F'／V稱為替換率D'。D'與連續(xù)培養(yǎng)中的稀釋率D不同，其與培養(yǎng)液取出至加入完成期間的比生長速率u'有如下關系：第三十五頁，共四十八頁。第三十六頁，共四十八頁。(3)連續(xù)培養(yǎng)由于連續(xù)培養(yǎng)可以保證細胞生長環(huán)境長時間的穩(wěn)定，因此，在研究細胞的生理或代謝等方面時，連續(xù)培養(yǎng)是一種重要的培養(yǎng)方法。與微生物的連續(xù)培養(yǎng)相同，對于單罐連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)，與細胞生長相關(xiāngguān)的物料衡算式為：第三十七頁，共四十八頁。第三十八頁，共四十八頁。第三十九頁，共四十八頁。一般連續(xù)培養(yǎng)的細胞產率高于分批培養(yǎng)的，但由于(yóuyú)植物細胞生長速率慢，維持長時間的無菌狀態(tài)是需要解決的基本技術問題。另外，單罐連續(xù)培養(yǎng)法并不能適應各種反應，因此，有必要開發(fā)一些新的方法。

第四十頁，共四十八頁。5．2．2．2動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)方法

動物細胞培養(yǎng)方法有兩種類型，一類是非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)，來源于血液、淋巴組織的細胞，許多腫瘤(zhǒngliú)細胞(包括雜交瘤細胞)和某些轉化細胞屬于這一類型，其可采用類似微生物培養(yǎng)的方法進行懸浮培養(yǎng)。另一類是貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)，大多數(shù)動物細胞，包括非淋巴組織的細胞和許多異倍體體系的細胞屬于這一類型，它們需要附著于適量正電荷的固體或半固體的表面生長。

第四十一頁，共四十八頁。能夠進行懸浮培養(yǎng)(péiyǎng)的動物細胞是一類能無限繁殖的細胞，這樣的細胞又稱為確立細胞株。由于動物細胞對剪切力的敏感，豐富培養(yǎng)(péiyǎng)基容易形成過多泡沫，這都增加了反應器操作的難度。懸浮培養(yǎng)(péiyǎng)多采用分批式操作方法，其原理與植物細胞的類同。另外，適用于動物細胞的還有一種連續(xù)式操作方法——灌流培養(yǎng)(péiyǎng)法。這種方法是把細胞置于某種封閉系統(tǒng)中，連續(xù)注入新鮮培養(yǎng)(péiyǎng)基的同時，連續(xù)等量排出用過的培養(yǎng)基，但不排出懸浮的細胞。

第四十二頁，共四十八頁。采用這種方法后，從產物開始分泌時起，便可用快速純化方法不斷地從流出培養(yǎng)基中收集目的產物。雖然灌流培養(yǎng)系統(tǒng)具有以上優(yōu)點，但也存在培養(yǎng)基消耗量比一般(yībān)懸浮培養(yǎng)高幾倍，工作過程復雜，培養(yǎng)物易受污染和培養(yǎng)細胞不穩(wěn)定等缺點。第四十三頁，共四十八頁。灌流培養(yǎng)系統(tǒng)可分為3類：①微小均質系統(tǒng)，如灌流懸浮細胞培養(yǎng)，微載體系統(tǒng)；②巨大均質系統(tǒng)，如把細胞包埋在微小球或凝膠中；③非均質系統(tǒng)，如邊灌流邊用過濾(guòl(fā)ǜ)膜將細胞加以固定。上述灌流培養(yǎng)方法屬于微小均質系統(tǒng)中的灌流懸浮細胞培養(yǎng)。第四十四頁，共四十八頁。大多數(shù)動物細胞需附著在固體或半固體表面生