液質聯用法測定甲磺酸侖伐替尼中甲磺酸酯類基因毒性雜質含量

液質聯用法測定甲磺酸侖伐替尼中甲磺酸酯類基因毒性雜質含量摘要：甲磺酸酯類屬于烷化劑，可能引起基因損傷，具有潛在的遺傳毒性，根據ICHM7指導原則，按毒理學關注閾值TTC法計算：每日攝入限度為1.5用/人/天，本品每日最大攝入量為29.4mg，TTC=（1.5用/人/天）/（29400用/天）=0.005%，故擬定362項目中磺酸酯類的限度均為0.005%。本公司采用氣相色譜法和質譜法自主開發(fā)四種磺酸酯類的測定方法，根據中國藥典2015年版四部通則對測定方法進行方法學驗證，驗證的內容包括專屬性、檢測限與定量限、線性和范圍、準確度、重復性和耐用性。關鍵詞：甲磺酸酯；含量測定；方法分析1.試劑信息表1驗證使用的儀器與試藥信息3.分析方法色譜柱：AgilentDB-624毛細管柱（30mx0.32mmx1.8Rm）柱溫：120°C保持5分鐘，25°C/分鐘升溫至230°C，保持10分鐘進樣口溫度：250C柱流速：1.5ml/min進樣方式：直接進樣檢測器：質譜檢測器（EI），選擇SIM模式，甲磺酸甲酯選擇離子為65/79/95；甲磺酸乙酯選擇離子為79/97/109；甲磺酸異丙酯選擇離子為79/123；甲磺酸丙酯選擇離子為79/97/109o離子源溫度：230C四級桿溫度：150C進樣體積：1Rl分流比：5：1載氣：氮氣稀釋劑：二氯甲烷供試品溶液：取本品約40mg,精密稱定，置于15ml離心管中，加5ml二氯甲烷和5ml水，振搖2min，于每分鐘8000rpm的轉速下離心5分鐘，取下層二氯甲烷層濾過作為供試品溶液。對照品溶液：取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯和甲磺酸異丙酯各適量，精密稱定，分別加稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1ml中各約含甲磺酸甲酯0.4曲、甲磺酸乙酯0.4曲、甲磺酸丙酯0.4曲、甲磺酸異丙酯0.4曲的溶液，作為對照品溶液?；旌先軇┤芤海喝”惐?、乙醇、乙酸正丙酯、乙酸異丙酯、正丙醇、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、毗啶、甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯和甲磺酸異丙酯各適量，精密稱定，加溶劑定量稀釋制成每lml中分別含丙酮100曲、異丙醇100曲、乙醇100曲、正丙醇100曲、乙酸正丙酯100曲、乙酸異丙酯100曲、二甲基亞砜100曲、N，N-二甲基甲酰胺17.6曲、毗啶4曲、甲磺酸酯類各0.4曲的混合溶液，即得；標記供試品溶液：取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯和甲磺酸異丙酯各適量，精密稱定，分別加稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1ml中各約含甲磺酸甲酯40曲、甲磺酸乙酯40曲、甲磺酸丙酯40曲、甲磺酸異丙酯40曲的溶液，作為混合對照品溶液；取362-1約40mg，精密稱定，置于15ml離心管中，加入混合對照品溶液50叫，加5ml二氯甲烷和5ml水，振搖2min，于每分鐘8000rpm的轉速下離心5分鐘，取下層二氯甲烷層濾過作為標記供試品溶液。照上述色譜條件，分別精密量取上述溶液各1B，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，要求空白溶劑和工藝有關溶劑不干擾各溶劑測定，各溶劑峰之間分離度大于1.5，樣品不干擾各溶劑測定。具體試驗結果見表3?表4，圖1?圖5。表3專屬性試驗結果結果表明：在質譜的SCAN模式確定各已知雜質特征離子分別為甲磺酸甲酯選擇離子（m/z）為65/79/95，甲磺酸乙酯選擇離子為79/97/109，甲磺酸異丙酯選擇離子為79/123，甲磺酸丙酯選擇離子為79/97/109；選擇豐度較強的雜質作為檢測離子分別為甲磺酸甲酯m/z79，甲磺酸乙酯m/z79，甲磺酸異丙酯m/z123和甲磺酸丙酯m/z109在各離子通道下，空白溶劑不干擾雜質檢測，二甲基亞砜與甲磺酸甲酯之間分離度為1.6；標記供試品溶液與混合對照品溶液中各成分峰保留時間一致，樣品不干擾各溶劑測定。線性和范圍取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯和甲磺酸異丙酯各適量，精密稱定，用稀釋劑定量稀釋制成相當于各溶劑限度濃度的10%、20%、40%、80%、100%、120%、150%與200%系列濃度的溶液，分別作為系列線性溶液。照上述色譜條件，分別精密量取上述線性溶液各1B，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。以進樣濃度（Rg/ml）為橫坐標（x），平均峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸分析，要求峰面積與濃度呈良好線性關系，線性相關系數（r）不小于0.990，Y軸截距偏差不大于25%，響應因子RSD不大于15%。檢測限與定量限取已知濃度的各溶劑對照品貯備液用稀釋劑逐級定量稀釋到低濃度溶液，照上述色譜條件，分別精密量取1B，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，根據信噪比法確定檢測限（LOD）與定量限（LOQ）。要求LOD濃度溶液連續(xù)進樣3次，測定的信號與空白處的信號（基線噪音）進行比較（S/N）均不小于3；定量限濃度溶液連續(xù)進樣6次，測定的信號與空白處的信號（基線噪音）進行比較（S/N）均不小于10，定量限濃度不大于限度的50%，定量限6針各溶劑峰保留時間的RSD不大于1%，峰面積的RSD不大于20%，來證實方法具有良好的靈敏度。結果表明：各溶劑檢測限濃度相當于樣品濃度量的0.000125%，檢測限溶液連續(xù)進樣3針各溶劑峰信噪比均大于3，定量限濃度相當于樣品濃度量的0.00025%，定量限濃度均低于限度的30%，定量限溶液連續(xù)進樣6針信噪比均大于10，峰面積的RSD在8.1%?14.4%范圍內，保留時間的RSD在0.0%?0.1%范圍內，符合靈敏度要求。準確度準確度是通過在供試品中加入限度濃度30%、50%、100%、150%三個不同濃度各溶劑，每個濃度平行配制3份溶液，共12份溶液，照上述色譜條件，分別測定。計算加標供試品溶液中各溶劑含量（測得量）和供試品溶液中各溶劑含量（原有量），計算各溶劑測定值與理論值（加入量）之間的比值獲取回收率，要求各溶劑平均回收率在80%?120%之間，RSD不大于15%，證實方法具有良好的準確度。精密度8.1進樣精密度照"專屬性”項下配制對照品溶液，照上述色譜條件，精密量取1R1，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算峰面積和保留時間RSD。要求各溶劑峰保留時間的RSD不大于1%，峰面積的RSD不大于5%，來證實儀器方法具有良好的精密度。試驗結果見表5。表5進樣精密度試驗結果表9標記供試品溶液穩(wěn)定性試驗結果從以上數據可以看出，對照品溶液放置24h內，各考察時間點待測溶劑的峰面積的RSD在12.9%?13.9%范圍內，標記供試品溶液放置24h內，各考察時間點待測溶劑的峰面積的RSD在11.0%?13.9%范圍內，均符合驗證要求。因此對照品溶液和標記供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。10耐用性照"專屬性”項下配制100%限度濃度的標記供試品溶液和對照品溶液。適當調整色譜參數（具體色譜參數見表20），考察色譜參數微小變動后對系統(tǒng)適用性及供試品測定結果的影響。要求各溶劑峰分離度大于1.5，不同條件下標記供試品中各溶劑測定結果與原條件測定結果的比值在70%?130%之間，則該方法在相應色譜參數下耐用。結果表明，將色譜條件中的參數作適度變化，如初始柱溫變化（120±5°C）、升溫速率（25±2°C/min）、載氣流速變化（1.5±0.3ml/min）、進樣口溫度變化（250±5°C），各成分峰之間的最小分離度（甲磺酸乙酯與甲磺酸異丙酯）最小值為6.1，理論板數均大于10000，不同條件下各成分測定結果于規(guī)定條件下測定結果的比值在75.0%?112.5%之間，說明方法的耐用性良好。經過上述方法學驗證，總結甲磺酸侖伐替尼中甲磺酸酯類基因毒雜質測定方法如下：取本品約40mg，精密稱定，置20ml離心管中，精密加入水5ml和二氯甲烷5ml，振搖萃取2分鐘，每分鐘8000轉離心5分鐘，取下層有機相濾過，作為供試品溶液。取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯和甲磺酸異丙酯對照品各適量，精密稱定，用二氯甲烷溶解并定量稀釋制成每1ml中約含甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯、甲磺酸異丙酯均為0.4曲的混合溶液，作為對照品溶液。照氣相色譜法（中國藥典2015年版四部通則0521）和質譜法（中國藥典2015年版四部通則0431）測定，以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液［AgilentDB-624UI（60mx0.32mm，1.8^m）或極性相近的色譜柱］的毛細管柱為色譜柱;起始溫度為120°C，維持5分鐘，以每分鐘25°C的速率升溫至230°C，維持10分鐘；進樣口溫度為250C；載氣為氦氣，流速為每分鐘1.5ml；分流比為5：1；采用質譜檢測器，電子轟擊離子源（EI），電壓為70eV，接口溫度為280C，離子源溫度為230C，四級桿溫度為150C；檢測模式為SIM模式；甲磺酸甲酯檢測離子（m/z）為79，甲磺酸乙酯檢測離子（m/z）為79，甲磺酸丙酯檢測離子（m/z）為109，甲磺酸異丙酯檢測離子（m/z）為123。取對照品溶液1B，注入氣相色譜-串聯質譜儀，記錄色譜圖，出峰順序依次為甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯與甲磺酸丙酯，各色譜峰之間分離度應符合規(guī)定。精密量取供試品溶液與對照品溶液各1B，分別注入