第七原核基因的表達(dá)與調(diào)控

第七原核基因的表達(dá)與調(diào)控第一頁，共七十一頁，2022年，8月28日6.1原核基因表達(dá)調(diào)控總論闡明的科學(xué)問題真核與原核生物如何調(diào)控數(shù)以千、萬計的基因以最為經(jīng)濟(jì)、有效的時空模式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而實現(xiàn)對環(huán)境的適應(yīng)、細(xì)胞的分化,組織的特化和個體的發(fā)育。第二頁，共七十一頁，2022年，8月28日隨著生物個體的發(fā)育，DNA分子能有序地將其所承載的遺傳信息，通過密碼子-反密碼子系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)，執(zhí)行各種生理生化功能?？茖W(xué)家把從DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達(dá)（geneexpression），對這個過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控（generegulation或genecontrol）。第三頁，共七十一頁，2022年，8月28日原核生物與真核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有驚人的相似性共同的起源與共同的分子基礎(chǔ)調(diào)控機(jī)理上調(diào)控層次上核酸分子間的互作核酸與蛋白質(zhì)分子間的互作蛋白質(zhì)分子間的互作transcriptionallevelpost—transcriptionalleveltranslationallevelpost—translationallevel第四頁，共七十一頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最為經(jīng)濟(jì),

靈活，又是最為重要，復(fù)雜的調(diào)控●在復(fù)雜的基因組內(nèi)，確定需要基因轉(zhuǎn)錄的起始位點●精細(xì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的水平,以保證生物體對環(huán)境的適應(yīng)●cisfactor&transfactor間嚴(yán)格而又靈活的互作●保證RNApolymerase的進(jìn)行式轉(zhuǎn)錄（不中斷，準(zhǔn)確終止）第五頁，共七十一頁，2022年，8月28日圖6-1基因表達(dá)的第一步是由RNA聚合酶拷貝DNA雙鏈中的模板鏈，生成與該序列完全互補(bǔ)的RNA鏈。第六頁，共七十一頁，2022年，8月28日基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下二方面：轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控（transcriptionalregulation）；轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控（post-transcriptionalregulation），包括（1）mRNA加工成熟水平調(diào)控（differentialprocessingofRNAtranscrpt）；（2）翻譯水平調(diào)控（differentialtranslationofmRNA）。第七頁，共七十一頁，2022年，8月28日第八頁，共七十一頁，2022年，8月28日基本概念：操縱子：指原核生物中由一個或多個相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控元件組成的基因表達(dá)單元。（如：乳糖操縱子，包括啟動子操縱基因和結(jié)構(gòu)基因三部分，調(diào)控的最小單位）順式作用元件：調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，如啟動子，增強(qiáng)子等，位于染色體上的一段DNA序列反式作用因子：可溶性蛋白，可作用于不同染色體上的順式作用元件，如阻遏蛋白等第九頁，共七十一頁，2022年，8月28日誘導(dǎo)物：也稱效應(yīng)物，指小分子物質(zhì)，誘導(dǎo)反應(yīng)進(jìn)行的物質(zhì)，如乳糖。誘導(dǎo)和阻遏：誘導(dǎo)即有利于反應(yīng)的順利進(jìn)行；阻遏即阻止反應(yīng)的進(jìn)行。正調(diào)控和負(fù)調(diào)控：正調(diào)控即促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行；負(fù)調(diào)控即不利于反應(yīng)的順利進(jìn)行組成型基因和誘導(dǎo)型基因第十頁，共七十一頁，2022年，8月28日

原核生物的基因調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控：調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor）阻遏蛋白作用于操縱區(qū)。負(fù)控誘導(dǎo)：阻遏蛋白不與誘導(dǎo)物結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄負(fù)控阻遏：阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。正轉(zhuǎn)錄調(diào)控：調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）正控誘導(dǎo)：誘導(dǎo)物的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)正控阻遏：誘導(dǎo)物分子的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)第十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日OperoncontrolmodelnegativepositiveInd.Rep.activeactiveinactiveinactive第十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日6.2乳糖操縱子與負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)

大腸桿菌乳糖操縱子（lactoseoperon）包括3個結(jié)構(gòu)基因：Z、Y和A，以及啟動子、控制子和阻遏子等。轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是在啟動區(qū)和操縱區(qū)進(jìn)行的。LacoperonIpoZYA第十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日第十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日3個結(jié)構(gòu)基因各決定一種酶：Z編碼-半乳糖苷酶；Y編碼-半乳糖苷透過酶；A編碼-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。第十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日β-半乳糖苷酶是一種β-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的β-半乳糖苷透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。第十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日6.2.1酶的誘導(dǎo)—lac體系受調(diào)控的證據(jù) 一般情況下，lac+基因型大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶和透過酶的濃度很低，每個細(xì)胞只有1～2個酶分子。但是，在乳糖培養(yǎng)基上酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的6%或7%，超過105個酶分子/細(xì)胞。第十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日

在無葡萄糖有乳糖的培養(yǎng)基中，lac+細(xì)菌中將同時合成β-半乳糖苷酶和透過酶。

用32P標(biāo)記的mRNA與模板DNA進(jìn)行定量分子雜交，表明培養(yǎng)基中加入乳糖1～2分鐘后，編碼β-半乳糖苷酶和透過酶的lacmRNA量就迅速增加，去掉乳糖后，lacmRNA量立即下降。第十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日第十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日

實驗室常用兩種乳糖類似物—異丙基巰基半乳糖苷（IPTG）和巰甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用發(fā)色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因為它們都不是半乳糖苷酶的底物，所以又稱為安慰性誘導(dǎo)物（gratuitousinducer）。第二十頁，共七十一頁，2022年，8月28日第二十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日用35S標(biāo)記大腸桿菌細(xì)胞（培養(yǎng)基中沒有半乳糖），將這些帶有放射性的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到不含35S的培養(yǎng)基中，加入誘導(dǎo)物后β-半乳糖苷酶便開始合成。分離純化β-半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)這種酶無35S標(biāo)記，說明這種酶是加入誘導(dǎo)物后新合成的。第二十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日6.2.2操縱子模型及其影響因子

Jacob和Monod認(rèn)為誘導(dǎo)酶（他們當(dāng)時稱為適應(yīng)酶）現(xiàn)象是個基因調(diào)控問題，而且可以用實驗方法進(jìn)行研究，他們通過大量實驗及分析，建立了現(xiàn)在已經(jīng)被人們廣泛接受的乳糖操縱子的控制模型。第二十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日圖6-9Lac操縱子的調(diào)控模式。第二十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日A.Z、Y、A基因產(chǎn)物由同一條多順反子mRNA分子所編碼。B.該mRNA分子的啟動區(qū)（P）位于阻遏基因（I） 與操縱區(qū)（O）之間，不能單獨起始半乳糖苷酶 和透過酶基因的高效表達(dá)。C.操縱區(qū)是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結(jié)合位點。D.當(dāng)阻遏物與操縱區(qū)相結(jié)合時，lacmRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。E.誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變其三維構(gòu)象，使 之不能與操縱區(qū)相結(jié)合，誘發(fā)lacmRNA的合成。第二十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日阻遏物lacI基因產(chǎn)物及功能lac操縱子阻遏物mRNA是由弱啟動子控制下永久型合成的，該阻遏蛋白有4個相同的亞基，每個亞基均含有347個氨基酸殘基，并能與1分子IPTG結(jié)合,每個細(xì)胞中有5～10個阻遏物分子。第二十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日

β-半乳糖苷酶在乳糖代謝中的作用是把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果將葡萄糖和乳糖同時加入培養(yǎng)基中，大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前不會誘發(fā)lac操縱子（圖6-11）。第二十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日第二十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日6.2.3lac操縱子的調(diào)控區(qū)域—P、O區(qū)

P區(qū)（即啟動子區(qū)）一般是從I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點下游5-10bp，而O區(qū)（即阻遏物結(jié)合區(qū)）位于-7～+28位，該區(qū)的堿基序列有對稱性，其對稱軸在+11位堿基對。第二十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日圖6-16不同操縱子啟動區(qū)及O區(qū)相對位置的比較。第三十頁，共七十一頁，2022年，8月28日6.2.4lac操縱子中的其他問題

1、lac基因產(chǎn)物數(shù)量上的比較

在完全被誘導(dǎo)的細(xì)胞中，β-半乳糖苷酶、透過酶及乙酰基轉(zhuǎn)移酶的拷貝數(shù)比例為1：0.5：0.2，這個比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作為唯一碳源時細(xì)胞的需要。不同的酶在數(shù)量上的差異是由于在翻譯水平上受到調(diào)節(jié)所致。第三十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日①lacmRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質(zhì)鏈的翻譯。因此，存在著從mRNA的5'末端到3'末端的蛋白質(zhì)合成梯度。第三十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日②在lacmRNA分子內(nèi)部，A基因比Z基因更易受內(nèi)切酶作用發(fā)生降解，因此，在任何時候Z基因的完整拷貝數(shù)要比A基因多。第三十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日2、操縱子的融合與基因工程

pur操縱子在染色體上位于lac操縱子沿轉(zhuǎn)錄方向的下游，中間只隔了一個控制細(xì)胞對T6噬菌體敏感性的tsx基因。pur操縱子被“嫁接”到lac啟動子上，形成融合基因。因為lac啟動子是一個很強(qiáng)的啟動子，通過它可以使較弱啟動子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。第三十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日6.3色氨酸操縱子與負(fù)控阻遏系統(tǒng)trp體系參與生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的調(diào)控。色氨酸的合成主要分5步完成，有7個基因參與整個合成過程（圖6-17）。第三十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日圖6-17細(xì)菌中色氨酸生物合成途徑。第三十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日第三十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日6.3.1trp操縱子的阻遏系統(tǒng)trpR基因突變常引起trpmRNA的永久型合成，該基因產(chǎn)物因此被稱為輔阻遏蛋白（aporepressor）。除非培養(yǎng)基中有色氨酸，否則這個輔阻遏蛋白不會與操縱區(qū)結(jié)合。輔阻遏蛋白與色氨酸相結(jié)合形成有活性的阻遏物，與操縱區(qū)結(jié)合并關(guān)閉trpmRNA轉(zhuǎn)錄。第三十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日

效應(yīng)物分子色氨酸是trp操縱子所編碼的生物合成途徑的末端終產(chǎn)物。 當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸含量較高時，它與游離的輔阻遏蛋白相結(jié)合，并使之與操縱區(qū)DNA緊密結(jié)合；當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸供應(yīng)不足時，輔阻遏物失去色氨酸并從操縱區(qū)上解離，trp操縱子去阻遏。第三十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日第四十頁，共七十一頁，2022年，8月28日6.3.2弱化子與前導(dǎo)肽1、弱化子

在trpmRNA5’端有一個長162bp的mRNA片段被稱為前導(dǎo)區(qū)，其中123～150位堿基序列如果缺失，trp基因表達(dá)可提高6-10倍。mRNA合成起始以后，除非培養(yǎng)基中完全沒有色氨酸，轉(zhuǎn)錄總是在這個區(qū)域終止，產(chǎn)生一個僅有140個核苷酸的RNA分子，終止trp基因轉(zhuǎn)錄。這個區(qū)域被稱為弱化子，該區(qū)mRNA可通過自我配對形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。第四十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日第四十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日2、前導(dǎo)肽分析前導(dǎo)序列發(fā)現(xiàn)，它包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA，能產(chǎn)生一個含有14個氨基酸的多肽，這個假設(shè)的多肽被稱為前導(dǎo)肽。在前導(dǎo)序列的第10和第11位上有相鄰的兩個色氨酸密碼子。組氨酸操縱子含有7個相鄰的組氨酸密碼子，苯丙氨酸操縱子也有7個苯丙氨酸密碼子，這些密碼子參與了操縱子中的轉(zhuǎn)錄弱化機(jī)制。第四十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日3、mRNA前導(dǎo)區(qū)的序列分析

trp前導(dǎo)區(qū)的堿基序列已經(jīng)全部測定，引人注目的是其中4個分別以1、2、3和4表示的片段能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對，有時以1-2和3-4配對，有時只以2-3方式互補(bǔ)配對。第四十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日第四十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日

RNaseT1降解實驗（此酶不能水解配對的RNA）表明，純化的trp前導(dǎo)序列中確有1-2和3-4的配對方式，由此定位的3-4配對區(qū)正好位于終止密碼子的識別區(qū)，當(dāng)這個區(qū)域發(fā)生破壞自我配對的堿基突變時有利于轉(zhuǎn)錄的繼續(xù)進(jìn)行（圖6-23）。第四十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日第四十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日4、轉(zhuǎn)錄弱化作用

培養(yǎng)基中色氨酸濃度低，負(fù)載有色氨酸的tRNATrp就少，翻譯通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度就慢，當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時，核糖體才進(jìn)行到1區(qū)（或停留在兩個相鄰的trp密碼子處），前導(dǎo)區(qū)2-3配對，不形成3-4配對的終止結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行。第四十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日

培養(yǎng)基中色氨酸濃度高，核糖體順利通過兩個相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前就到達(dá)2區(qū)，3-4區(qū)自由配對形成莖-環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止。所以，弱化子對RNA聚合酶的影響依賴于前導(dǎo)肽翻譯中核糖體所處的位置。第四十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日圖6-24trp操縱子前導(dǎo)序列的變構(gòu)與轉(zhuǎn)錄的弱化。第五十頁，共七十一頁，2022年，8月28日

一般認(rèn)為，阻遏物從有活性向無活性的轉(zhuǎn)變速度較慢，需要有一個能更快地做出反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)纳彼崴健Ｈ趸幽茌^快地通過抗終止的方法來增加trp基因表達(dá)，迅速提高內(nèi)源色氨酸濃度。第五十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日那么，為什么還要有阻遏體系呢？阻遏物的作用是在有大量外源色氨酸存在時，阻止非必需的先導(dǎo)mRNA的合成，它使這個合成系統(tǒng)更加經(jīng)濟(jì)。第五十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日6.4轉(zhuǎn)錄后調(diào)控6.4.1翻譯起始的調(diào)控

遺傳信息的翻譯起始于mRNA上的核糖體結(jié)合位點（RBS）----起始密子AUG上游的一段非翻譯區(qū)。在RBS中有SD序列，與核糖體16SrRNA的3’端互補(bǔ)配對，促使核糖體與mRNA相結(jié)合。

RBS的結(jié)合強(qiáng)度取決于SD序列的結(jié)構(gòu)及與AUG之間的距離。SD與AUG之間相距一般以4～10核苷酸為佳，9核苷酸最佳。第五十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日圖7-2真核基因表達(dá)調(diào)控的主要步驟示意圖第五十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日7.1.1基因家族（genefamily）

真核細(xì)胞中許多相關(guān)的基因常按功能成套組合，被稱為基因家族。 同一家族中的成員有時緊密地排列在一起，成為一個基因簇，也可能分散在同一染色體的不同部位，甚至位于不同的染色體上，具有各自不同的表達(dá)調(diào)控模式。第五十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日1、簡單多基因家族簡單多基因家族中的基因一般以串聯(lián)方式前后相連。細(xì)菌中所有rRNA和部分tRNA都來自這個分子量為30S（約6500個核苷酸）的前rRNA。

在真核生物中，前rRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分子量為45S，（約有14000個核苷酸），包括18S，28S和5.8S三個主要rRNA分子。第五十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日2、復(fù)雜多基因家族復(fù)雜多基因家族一般由幾個相關(guān)基因家族構(gòu)成，基因家族之間由間隔序列隔開，并作為獨立的轉(zhuǎn)錄單位。海膽組蛋白基因家族（圖7-4）：編碼不同組蛋白的基因處于一個約為6000bp的片段中，分別被間隔序列所隔開。這5個基因組成的串聯(lián)單位在整個海膽基因組中可能重復(fù)多達(dá)1000次。第五十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日7.1.2真核基因的斷裂結(jié)構(gòu)1、外顯子與內(nèi)含子

“intron”是指存在于原始轉(zhuǎn)錄物或基因組DNA中，但不存在于成熟mRNA、rRNA或tRNA中的那部分核苷酸序列。大多數(shù)真核基因都是由蛋白質(zhì)編碼序列和非蛋白質(zhì)編碼序列兩部分組成的。第五十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日7.1.3真核生物DNA水平上的基因表達(dá)調(diào)控DNA水平的調(diào)控是真核生物發(fā)育調(diào)控的一種形式，包括基因丟失、擴(kuò)增、重排和移位等。第五十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日7.3反式作用因子第六十頁，共七十一頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子定義：指具有同真核啟動子特定DNA序列結(jié)合活性的蛋白質(zhì)分子，或者是指具有已知DNA結(jié)合域結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)分子，其主要功能是激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子可被分為兩大類：通用轉(zhuǎn)錄因子和特異轉(zhuǎn)錄因子。通用轉(zhuǎn)錄因子是所有基因轉(zhuǎn)錄都需要的，特異轉(zhuǎn)錄因子是那些能提高或降低基因轉(zhuǎn)錄速率的蛋白質(zhì)，它們?yōu)檎婧思?xì)胞提供了非常精確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)：轉(zhuǎn)錄激活域DNA結(jié)合域N1281C88147222圖：酵母轉(zhuǎn)錄因子GCN4結(jié)構(gòu)域第六十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄因子由四個功能區(qū)域組成：DNA結(jié)合域（DNA-bindingdomain）轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptionalactivationdomain)核定位信號區(qū)(nuclearlocalizationsignal)寡聚化位點(oligomerizationsite)第六十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日一、DNA結(jié)合域DNA結(jié)合域：可識別效應(yīng)基因上游的一種特定區(qū)段，即上游激活序列，并與之結(jié)合，從而使轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)與DNA順式作用元件之間發(fā)生相互作用，最終激活效應(yīng)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。DNA結(jié)合域有若干種結(jié)構(gòu)類型：螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序、鋅指結(jié)構(gòu)基序、亮氨酸拉鏈基序、螺旋-環(huán)-螺旋基序等。第六十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日

1、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序(HTH)123同源異型域Helix1Helix2Turn第六十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日2、鋅指結(jié)構(gòu)模型αhelixβsheetZn2+(a)(b)圖(a)