不同菊花品種數(shù)量性狀與SRAP分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性分析,園藝學(xué)論文

不同菊花品種數(shù)量性狀與SRAP分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性分析,園藝學(xué)論文【研究意義】菊花〔ChrysanthemummorifoliumRamat.〕是中國傳統(tǒng)名花，深受人們的喜歡。在世界范圍內(nèi)，菊花是市場上主要的鮮切花之一，也是重要的盆花、地被花卉。菊花起源于中國，是菊屬部分野生種天然雜交再經(jīng)人工選育構(gòu)成的，其主要親本為毛華菊〔C.vestitumHemsl.〕、野菊〔C.indicumL.〕與紫花野菊〔C.zawadskiiHerb.〕等，經(jīng)過長期天然雜交、人工選擇和培育，產(chǎn)生了大量的種下變異，具有豐富的遺傳多樣性。菊花的表型性狀大部分是數(shù)量性狀，變異極其豐富，因其極易受環(huán)境因素的影響，多年來對菊花復(fù)雜性狀的研究始終極為困難。對菊花重要表型性狀的基因型進(jìn)行解析，尋找與目的性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，將為復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳學(xué)研究、品種鑒定及品種保衛(wèi)和分子標(biāo)記輔助育種奠定重要基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】分子標(biāo)記技術(shù)已成功應(yīng)用于菊花的起源研究、品種鑒定和遺傳多樣性分析等領(lǐng)域。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，利用全基因組的分子標(biāo)記和適宜的分離群體尋找連鎖標(biāo)記、開展遺傳連鎖作圖是當(dāng)前植物數(shù)量性狀研究的主要方式方法之一。菊花長期進(jìn)行無性繁衍，基因組高度雜合，且存在近交衰退現(xiàn)象，所以，菊花的遺傳圖譜構(gòu)建一直是個難題，在這里方面的研究工作剛剛起步。趙婧媛等利用地被菊和盆栽小菊的雜交F1代群體，通過集團(tuán)分離分析〔bulkedsegregantanalysis，BSA〕法尋找到與菊花匍匐性顯著相關(guān)的RAPD標(biāo)記。Zhang等根據(jù)雙-假測交作圖策略，利用兩個高度雜合的菊花品種作為親本，將其雜交F1代作為作圖群體，使用RAPD、ISSR、AFLP和SRAP等分子標(biāo)記成功構(gòu)建了雙親的遺傳連鎖圖譜，并挑選出與菊花初花期和開花持續(xù)期相關(guān)的SRAP標(biāo)記，還對花徑、舌狀花數(shù)等花器性狀進(jìn)行了數(shù)量性狀位點(diǎn)〔quantitativetraitloci，QTL〕定位。盡管部分連鎖圖已經(jīng)在菊花中建立起來，但是標(biāo)記密度較低、連鎖群不完好，制約了其應(yīng)用潛力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)聯(lián)分析，又稱關(guān)聯(lián)作圖或連鎖不平衡作圖，曾廣泛用于人類遺傳學(xué)研究，是一種研究復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳學(xué)方式方法。它是以自然群體為研究對象，以長期重組后保存下來的等位基因〔位點(diǎn)〕間連鎖不平衡〔linkagedisequilibrium，LD〕為基礎(chǔ)，將目的表型性狀的多樣性與基因〔位點(diǎn)〕的多態(tài)性結(jié)合起來分析，可直接鑒定出與表型變異密切相關(guān)且具有特定功能的基因位點(diǎn)或標(biāo)記位點(diǎn)。與傳統(tǒng)的連鎖作圖相比，關(guān)聯(lián)分析有下面優(yōu)點(diǎn)：以自然群體為材料，無需構(gòu)建作圖群體；能夠同時檢測同一座位的多個等位基因，而連鎖作圖只能牽涉來自親本的2個等位基因；廣泛的遺傳材料可同時考察多個性狀的大多數(shù)QTL的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)及其等位變異，不受連鎖作圖中兩親本范圍及群體分離情況的限制。鑒于利用連鎖作圖開展菊花園藝性狀QTL定位的難度大、周期長，因而能夠考慮利用關(guān)聯(lián)分析的特點(diǎn)，充分發(fā)揮中國菊花種質(zhì)資源豐富多樣的優(yōu)勢，以自然群體為基礎(chǔ)開展關(guān)聯(lián)分析，鑒定與重要表型性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，進(jìn)而為菊花分子輔助育種服務(wù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在分析群體構(gòu)造的基礎(chǔ)上，用關(guān)聯(lián)分析對58個大菊品種的18個數(shù)量性狀與SRAP分子標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)，希望鑒定出與上述性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)，為菊花育種工作的深切進(jìn)入開展和品種鑒定提供一些有價值的參考資料。1材料與方式方法1.1供試材料本研究所有材料均來自北京林業(yè)大學(xué)菊花資源圃。在20082018連續(xù)3年對菊花資源圃內(nèi)800余個大菊品種表型性狀進(jìn)行觀測分析的基礎(chǔ)上，以盡可能覆蓋大菊品種出現(xiàn)的所有性狀變異為原則，在資源圃中選擇具有代表性的58個大菊品種〔涵蓋5個瓣型，30個花型；包括50個中國品種和8個日本品種〕，為無直接親緣關(guān)系的自然群體〔表1〕。所有品種于5月在日光溫室中扦插繁衍，67月定植于直徑30cm瓦盆中，根據(jù)獨(dú)本菊的栽培技法常規(guī)田間管理。1.2方式方法1.2.1表型性狀的測定與分析本研究中測定18個數(shù)量性狀，包括：花部性狀11個〔花徑大小、花瓣長度、花瓣寬度、花梗長度、花高、花梗粗度、舌狀小花數(shù)、筒狀小花數(shù)、筒狀花長度、筒狀花部直徑、花托大小〕；葉部性狀4個〔葉柄長度、葉片長度、葉片寬度、葉厚〕；莖部性狀2個〔節(jié)間長度、莖粗〕；整體性狀1個〔植株高度〕。性狀的測定方式方法參照雒新艷等的描繪敘述。每個品種測量10個單株，取平均值。計算各性狀在品種內(nèi)和品種間的變異系數(shù)，計算公式為：CV=S/X，S={[EX2-(EX)2/N]/N-1}1/2華而不實(shí)，CV為變異系數(shù)，S為標(biāo)準(zhǔn)差，X為樣本均值。1.2.2DNA提取田間取植株嫩葉，用改進(jìn)CTAB法提取基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定DNA質(zhì)量和濃度，并將濃度稀釋至50ngL-1，樣品在-20℃下保存?zhèn)溆谩?.2.3SRAP分析選用正向引物13條，反向引物10條，共130對SRAP引物用于引物挑選。SRAP分析參照張飛等的方式方法，經(jīng)過體系優(yōu)化及引物挑選后，對供試品種進(jìn)行擴(kuò)增。將具有一樣遷移率的擴(kuò)增片段，根據(jù)二進(jìn)制方式方法進(jìn)行記錄，即有帶的記為1，無帶的記為0，僅記錄清楚明晰、穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶，最終構(gòu)成0/1矩陣輸入計算機(jī)。遺傳多樣性分析采用多態(tài)性信息量〔PolymorphismInformationContent，PIC〕指標(biāo)。根據(jù)Anderson等的計算方式方法，標(biāo)記i的PIC值計算公式為：【1】華而不實(shí)，pij表示標(biāo)記i第j種帶型出現(xiàn)的頻率，標(biāo)記i的帶型數(shù)從1到n。PIC值的范圍為01，0表示無多態(tài)性，1表示具有非常高的多態(tài)性。1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析群體結(jié)構(gòu)分析用STRUCTURE軟件對菊花品種群體構(gòu)造進(jìn)行基于數(shù)學(xué)模型的類群劃分。先設(shè)定群體數(shù)目〔K〕為29，將MCMC〔MarkovchainMonteCarlo〕開場時的不作數(shù)迭代〔Lengthofburn-inperiod〕設(shè)為10000次，再將不作迭代后的MCMC設(shè)為100000次，然后計算出每個K值對應(yīng)的lnP〔D〕值，根據(jù)似然值最大的原則，選擇適宜的K值，并計算得到每個品種相應(yīng)的Q值〔第i品種其基因組變異源于第k群體的概率〕。關(guān)聯(lián)分析應(yīng)用TASSEL軟件GLM〔GeneralLinearModel，一般線性模型〕程序，將各個菊花品種的Q值作為協(xié)變量，將18個數(shù)量性狀的表型性狀數(shù)據(jù)分別對SRAP標(biāo)記變異逐一進(jìn)行回歸分析，確認(rèn)表型性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)并計算位點(diǎn)對表型變異的解釋率。GLM回歸方程是:【2】華而不實(shí)，Aj是第j個材料數(shù)量性狀測定值，是群體各位點(diǎn)各等位變異的平均效應(yīng)，Cpj是第j材料第P等位變異出現(xiàn)的指示變量，B1jBkj是第j個材料基因組變異源于第lk群體的概率Q值，1k是亞群體各位點(diǎn)各等位變異的平均效應(yīng)，ε是殘差。2結(jié)果2.1數(shù)量性狀的變異分析本研究中應(yīng)用變異系數(shù)來表示觀測的數(shù)量性狀在品種內(nèi)和品種間的離散性程度。品種內(nèi)變異系數(shù)反映了性狀在同一品種內(nèi)的穩(wěn)定程度，品種間變異系數(shù)反映了性狀在不同品種間的離散情況。由各性狀變異系數(shù)計算結(jié)果〔表2〕可知，18個數(shù)量性狀在品種內(nèi)穩(wěn)定性較好，花梗長度品種內(nèi)變異系數(shù)最高，為0.22，其余均未超過0.2，均值為0.13；花部性狀的品種間變異系數(shù)較大，而葉部、莖部等性狀在品種間的差異不如花部性狀明顯。因而，在關(guān)聯(lián)分析中可能更容易在不同基因型間找到與花部性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。2.2SRAP分析在130對SRAP引物組合中挑選出19對條帶清楚明晰穩(wěn)定的引物組合對所選擇的58個大菊品種進(jìn)行擴(kuò)增，共產(chǎn)生擴(kuò)增片段283條，華而不實(shí)多態(tài)性片段為225條，多態(tài)性位點(diǎn)占80%。每對引物組合檢測等位基因數(shù)為723個，平均為11.84個〔表3〕。多態(tài)性信息量PIC值在0.760.94，平均為0.87，為高度多態(tài)性座位，講明選擇的大菊品種群體的遺傳差異非常大，具有豐富的遺傳多樣性，這有利于在關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)與表型性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。圖1是引物Me1/Em6在供試品種中擴(kuò)增產(chǎn)物的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。2.3供試品種的群體構(gòu)造分析利用SRAP標(biāo)記，基于數(shù)學(xué)模型的群體構(gòu)造分析表示清楚，樣本的等位變異頻率特征類型數(shù)K=5〔即服從Hardy-Weinberg平衡的亞群數(shù)目為5〕時，其模型的后驗(yàn)概率[lnP(D)]最大〔圖2〕。由此判定58個大菊品種群體可被分為5個亞群。根據(jù)上述揣測的K值繪制供試品種群體構(gòu)造圖〔圖3〕。從群體構(gòu)造圖能夠看出，58個大菊品種中存在5個亞群。分析各亞群的生物學(xué)意義，發(fā)現(xiàn)菊花品種劃分與瓣型和地域相關(guān)，可基本被辨別為平瓣類、管瓣類、畸瓣類、桂瓣類和日本品種亞群。各亞群存在明顯的差異，具有一定獨(dú)立性，這講明供試群體存在著明顯的群體構(gòu)造。日本品種亞群獨(dú)立性最強(qiáng)，而桂瓣類亞群與平瓣類、管瓣類、日本品種亞群基因間浸透性最高；管瓣類亞群與平瓣類亞群有一定浸透性。為避免群體構(gòu)造的存在通過影響位點(diǎn)LD進(jìn)而影響關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性，本研究將各品種Q值〔各品種個體歸入各亞群的概率〕作為協(xié)變量納入SRAP標(biāo)記與表型性狀變異的回歸分析中。2.4SRAP標(biāo)記與表型性狀的回歸關(guān)聯(lián)分析將58個大菊品種各品種相應(yīng)的Q值作為協(xié)變量，將18個數(shù)量性狀的表型變異對SRAP標(biāo)記變異進(jìn)行回歸分析，尋找與性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記及其等位變異。結(jié)果顯示，在所檢測的225個SRAP標(biāo)記位點(diǎn)中，共有6個SRAP標(biāo)記位點(diǎn)與5個數(shù)量性狀〔莖粗度、葉厚度、花梗粗度、花瓣寬度和筒狀小花數(shù)量〕在P＜0.01水平上相關(guān)。與花部性狀〔花梗粗度、花瓣寬度和筒狀小花數(shù)量〕相關(guān)位點(diǎn)共5個，與莖部〔莖粗度〕、葉部性狀〔葉厚度〕相關(guān)位點(diǎn)各1個，華而不實(shí)位點(diǎn)Me1/Em9-10同時與莖粗度、花梗粗度相關(guān)。各位點(diǎn)對表型變異的解釋率在0.07380.4791，解釋率最大〔0.4791〕的SRAP位點(diǎn)是Me3/Em7-10，與葉厚度相關(guān)，而解釋率最小〔0.0738〕的位點(diǎn)是Me1/Em9-10，與莖粗度相關(guān)〔表4〕。【表4】3討論3.1基于數(shù)學(xué)模型的菊花群體構(gòu)造分析利用SRAP標(biāo)記，使用STRUCTURE軟件對供試菊花種質(zhì)進(jìn)行的基于數(shù)學(xué)模型的類群劃分，與筆者基于遺傳距離的SRAP標(biāo)記UPGMA聚類結(jié)果〔未列出〕基本一致。發(fā)現(xiàn)中國大菊品種可分為平瓣類、管瓣類、畸瓣類和桂瓣類4個亞群構(gòu)造，各亞群構(gòu)造存在廣泛的基因溝通，匙瓣類品種并未單獨(dú)構(gòu)成亞群，而是分散在平瓣類和管瓣類亞群內(nèi)，講明匙瓣類品種在演化關(guān)系中是處于平瓣類和管瓣類之間的過渡狀態(tài)，這與張樹林提出的不把匙瓣作為單獨(dú)瓣型的觀點(diǎn)相一致。盡管所選日本品種多為平瓣類和管瓣類，但并未與中國大菊的平瓣類與管瓣類聚為一群，而是單獨(dú)聚為1個亞群，講明可能由于地理隔離的因素，其種質(zhì)來源與演化經(jīng)過與中國品種相比有一定的差異；但其與各亞群也都存在基因溝通，表示清楚日本品種和中國品種在菊花的栽培育種史上存在廣泛的種質(zhì)浸透現(xiàn)象。本研究利用SRAP基于數(shù)學(xué)模型的菊花群體構(gòu)造分析與前人利用形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)或其它分子標(biāo)記基于遺傳距離的聚類方式方法得到的結(jié)果基本一致，證明其可有效對菊花群體構(gòu)造進(jìn)行判定和劃分。相比基于遺傳距離的聚類方式方法，利用數(shù)學(xué)模型來分析群體構(gòu)造可排除亞群劃分的人為因素，更精到準(zhǔn)確地確定亞群數(shù)目，并且可更清楚明晰地觀察各亞群間的基因溝通情況。3.2與表型性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記位點(diǎn)在植物中初次進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析的是Hansen等對野生甜菜生長習(xí)性的研究，發(fā)現(xiàn)17個引物組合擴(kuò)增的440個全基因組范圍內(nèi)的AFLP標(biāo)記中，有2個與控制抽薹前能否需要春化的B基因顯著關(guān)聯(lián)。Kraakman等對236個AFLP標(biāo)記和春大麥品種的產(chǎn)量及產(chǎn)量穩(wěn)定性進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，分別發(fā)現(xiàn)8個和5個AFLP標(biāo)記與產(chǎn)量和產(chǎn)量穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)。何靜等應(yīng)用SRAP和EST-SSR分子標(biāo)記對木薯品種農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在1471個SRAP標(biāo)記位點(diǎn)檢測到73個位點(diǎn)與21個農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)，華而不實(shí)46個SRAP標(biāo)記位點(diǎn)同時與多個性狀相關(guān)聯(lián)；在993個EST-SSR標(biāo)記位點(diǎn)中有20個位點(diǎn)與20個性狀變異相關(guān)。本研究在225個SRAP標(biāo)記位點(diǎn)檢測到6個位點(diǎn)與大菊品種5個數(shù)量性狀相關(guān)〔P＜0.01〕，與數(shù)量性狀相關(guān)聯(lián)的SRAP位點(diǎn)較少，可能是由于SRAP標(biāo)記數(shù)量較少造成。嚴(yán)格意義上講，全基因組關(guān)聯(lián)分析需要成千上萬的標(biāo)記以及盡可能多的無親緣關(guān)系的個體。即便是基因組很小的擬南芥，也需要檢測2000個分子標(biāo)記。本研究在18個數(shù)量性狀中只找到5個有標(biāo)記與之關(guān)聯(lián)的性狀，除了標(biāo)記數(shù)量較少外，供試群體的大小也是影響因素之一。本研究選擇的菊花品種群體較小，每個瓣型的代表性品種約10個，每個花型的代表性品種約2個，因而在表型性狀多樣性分析中可能并未完全覆蓋各個性狀的全部變異，SRAP標(biāo)記檢測到的變異位點(diǎn)也特別有限。因而本研究只能算粗略意義上的全基因組關(guān)聯(lián)分析，在進(jìn)一步的關(guān)聯(lián)分析研究中還需增加標(biāo)記密度，增大群體規(guī)模。本研究所找到的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中，與花部性狀顯著相關(guān)SRAP位點(diǎn)共5個，而與莖部、葉部性狀相關(guān)位點(diǎn)各1個，這可能與花部性狀在品種間存在較大程度變異有關(guān)，更利于關(guān)聯(lián)標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。位點(diǎn)Me1/Em9-10同時與莖粗度、花梗粗度相關(guān)。與花梗粗度相關(guān)的位點(diǎn)有2個，分別是Me1/Em9-10和Me3/Em5-9，與花瓣寬度相關(guān)的位點(diǎn)有2個，分別是Me1/Em6-8和Me5/Em8-5。在中國大菊中，最為困擾育種者的難題之一就是由于花梗纖細(xì)造成花頭易折，需要綁扎，消耗損費(fèi)人力物力。本研究發(fā)現(xiàn)與花梗粗度相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)2個，這為大菊育種中培育粗壯品種提供了根據(jù)。當(dāng)前應(yīng)用于植物關(guān)聯(lián)分析的分子標(biāo)記主要是SSR和SNP標(biāo)記，本研究應(yīng)用的是SRAP分子標(biāo)記。SRAP標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性比SSR或EST-SSR高，并結(jié)合了RAPD和AFLP的優(yōu)點(diǎn)，引物的多態(tài)性可能由于包含了內(nèi)含子、啟動子和間隔序列在品種間的變異而產(chǎn)生，具有簡便、穩(wěn)定、高通量等特點(diǎn)。但是SRAP應(yīng)用于關(guān)聯(lián)分析也存在缺點(diǎn)：SRAP標(biāo)記是顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純合顯性和雜合顯性；不能直接獲得位點(diǎn)大小信息，需要根據(jù)marker片段估測，增大了位點(diǎn)統(tǒng)計誤差。因而在以后的菊花關(guān)聯(lián)分析中增加SSR〔或EST-SSR〕、SNP等共顯性分子標(biāo)記是研究的趨勢，而菊花中尚未開發(fā)出這兩類標(biāo)記。鑒于當(dāng)前菊花基因組的研究水平，利用各種方式方法開發(fā)出菊花的SSR標(biāo)記是當(dāng)前迫切并且可行的研究任務(wù)。3.3菊花的關(guān)聯(lián)分析與連鎖作圖家系連鎖作圖〔Family-basedmapping，F(xiàn)BLmapping〕與關(guān)聯(lián)分析是解析植物重要數(shù)量性狀基因型的主要方式方法。本研究利用關(guān)聯(lián)分析的方式方法通過回歸分析檢測菊花品種表型變異和SRAP位點(diǎn)等位變異的關(guān)聯(lián)性。在缺乏高密度菊花分子遺傳連鎖圖譜的情況下，利用自然群體開展QTL分析，無疑是一種較簡便且有效的方式方法。研究表示清楚，利用關(guān)聯(lián)分析檢測到的分子標(biāo)記位點(diǎn)，大多與定位于遺傳連鎖圖上的QTL位點(diǎn)相一致