無病毒苗的培育

無病毒苗的培育第一頁，共七十一頁，2022年，8月28日主要內容果樹病毒的特點培育無病毒苗的意義培育無病毒苗的方法（脫毒方法）無病毒苗的鑒定方法無病毒苗的擴大繁殖第二頁，共七十一頁，2022年，8月28日前言無性繁殖植物易感染病毒植物感染病毒呈增多趨勢受病毒侵染的植株生長遲緩、產量下降、品質變劣第三頁，共七十一頁，2022年，8月28日前言大部分病毒不能通過種子傳播，但對一些園藝植物，種子繁殖易產生變異；有些植物可以用種子進行繁殖，但主要以無性繁殖為主馬鈴薯、大蒜、甘薯等第四頁，共七十一頁，2022年，8月28日病毒virus（8）病毒virus類病毒viroid類細菌BLO螺原體spiroplasma植原體phytoplasma類菌原體MLO衛(wèi)星病毒satellite類立克次氏體RLO第五頁，共七十一頁，2022年，8月28日一、果樹病毒病特點果樹多年生，營養(yǎng)繁殖或嫁接繁殖為主，會導致病毒侵染逐年積累增多。一旦染毒，終生帶毒，持久受害。嫁接是果樹傳播的主要途徑。難以應用化學藥劑或生物制品進行有效的防治。系統(tǒng)侵染，染毒后，植株各部位均帶毒。第六頁，共七十一頁，2022年，8月28日世界各地報道的主要果樹病毒種類數（1997）樹種病毒及類似病害類病毒衛(wèi)星病毒植原體螺原體小計仁果類69204075蘋果40103044梨21101023溫勃700007山楂100001核果類115010101162桃35104141李31001022杏18002020櫻桃66002068棗000101第七頁，共七十一頁，2022年，8月28日世界各地報道的主要果樹病毒種類數（1997）樹種病毒及類似病害類病毒衛(wèi)星病毒植原體螺原體小計漿果類59234270葡萄37222144草莓22012025柿000011堅果類600208板栗100102核桃500106合計2845323315第八頁，共七十一頁，2022年，8月28日病毒病害舉例草莓：使日本草莓產量嚴重減產，幾乎遭受滅頂之災CTV：曾毀滅巴西大部分柑桔園，圣保羅州80%甜橙因病毒病死亡；美國、阿根廷、委內瑞那等也遭受重創(chuàng)觀賞植物病毒病造成觀賞價值下降。第九頁，共七十一頁，2022年，8月28日獲得無病毒苗獲得無病毒苗獲得無病毒苗獲得無病毒苗第十頁，共七十一頁，2022年，8月28日無病毒苗Virus-freeseedlingsVirus-detectedseedlings第十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日二、無病毒苗的特點（4）1、無病毒苗木根系發(fā)達，生長健壯，整齊一致，結果早；草莓無病毒苗草莓有病毒苗第十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日蘋果無病毒苗蘋果有病毒苗第十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日無病毒苗的特點無病毒苗木根系發(fā)達，生長健壯，整齊一致，結果早；2、無病毒果樹樹勢強，穩(wěn)妥高產，一般增產40%以上第十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日無病毒苗的特點無病毒苗木根系發(fā)達，生長健壯，整齊一致，結果早；無病毒果樹樹勢強，穩(wěn)妥高產，一般增產40%以上3、果個大，果面光潔度好，果品質量顯著提高第十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日無病毒苗的特點無病毒苗木根系發(fā)達，生長健壯，整齊一致，結果早；無病毒果樹樹勢強，穩(wěn)妥高產，一般增產40%以上果個大，果面光潔度好，果品質量顯著提高4、需肥量少，抗逆性強第十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日三、培育無病毒苗的意義從根本上消除只靠種苗傳播的病毒病的危害。無病毒栽培可充分利用優(yōu)良砧木，改善果樹品質，提高豐產性、抗逆性及利用砧木的其化優(yōu)良必狀，而不要考慮砧木對某些病害的敏感性無病毒苗可以減少農藥的使用，降低生產成本，減少農藥殘留，避免對環(huán)境的污染第十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日四、脫毒方法（7）熱處理莖尖培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)莖尖微體嫁接珠心胚培養(yǎng)花藥培養(yǎng)脫毒法熱處理和莖尖培養(yǎng)結合法第十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日1、熱處理脫毒原理研究簡況熱處理方法不足第十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日1.1熱處理脫毒原理病毒和寄主細胞對高溫的忍耐程度不同，選擇適當的溫度和處理時間，就能使寄主體內病毒的濃度降低，運行速度減慢或失活，而寄主細胞仍然存活，并加快分裂和生長，在生長點附近有可能脫除病毒，從而達到脫毒的目的。菊花和番茄在35-36oC時栽培2個月，可除去菊花萎縮類病毒和番茄不孕病毒香石竹在40oC栽培1-2個月可除去某些病毒。第二十頁，共七十一頁，2022年，8月28日1.2熱處理的研究1889年：印度尼西亞人發(fā)現患枯萎病的甘蔗放在50-52的熱水中30分鐘，可去除枯萎病1936年Kunkel報道患有桃黃萎病的植株，在34-36溫度下處理2周，可使病毒失去活性。第二十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日果樹熱處理脫除病毒的種類果樹病毒種類溫度時間脫毒難易柑桔CTV3928天易CEV3833周很難脈突病毒40/308周難碎葉病毒40/30+44/306+2周難蘋果褪綠葉斑病毒3720天易莖痘病毒3720天易花葉病毒372-3周易梨環(huán)紋花葉病毒3720天易梨脈黃化病毒363周易第二十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日果樹熱處理脫除病毒的種類果樹病毒種類溫度時間脫毒難易核果類李屬壞死環(huán)斑病毒3817天

易李痘病毒3714-21天

易李矮縮病毒3817天

易櫻桃綠化環(huán)斑病毒3814天易桃X病37.53周易桃黃化病3514天易櫻桃綠化斑駁病毒386周難李線紋斑病毒3721-28天易葡萄扇葉病毒358周易卷葉病毒3821天難栓皮病毒3814天很難第二十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日1.3植物生長區(qū)與熱處理區(qū)關系溫度生長量熱處理區(qū)病原菌被消除寄主被殺死第二十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日1.4熱處理方法溫水浸漬熱空氣處理第二十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日蘋果熱處理方法盆栽脫毒材料的準備在4-5月間果樹發(fā)芽前，用切接法將帶毒接穗接在盆栽實生砧上，或于8-9月用芽接法在每盆砧木上接2-3個病芽。次年將接苗剪至20cm左右，留3-5個芽高溫空氣處理待苗木長出3-5片葉時，放入熱處理箱或室內，首先在25-30oC處理1-2周，然后轉至37±1oC處理30天左右嫩芽嫁接熱處理28天后，處理苗長出長約15-25cm的新梢，用發(fā)片切取新梢頂端0.5-1cm的頂芽，皮下嫁接到預先盆栽的實生砧上，再套上塑料袋，鑒定第二十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日病芽嫁接熱處理嫩芽嫁接鑒定獲得無病毒苗第二十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日1.5熱處理的不足之處不能排除所有病毒，而且處理效果不一康乃馨花葉病毒在38處理要2個月，用40高溫處理枝條，頂部病毒雖有減少，但基部病毒仍然很多馬鈴薯熱處理后，塊莖品質降低，塊莖顏色改變，推遲發(fā)芽或完全不發(fā)芽。熱處理對部分球狀病毒（葡萄扇葉病毒、蘋果花葉病毒）或線狀病毒（馬鈴薯X、Y病毒、蘋果褪綠葉斑病毒）有效，而對桿狀病毒則不起作用第二十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.莖尖培養(yǎng)脫毒原理研究簡況脫毒程序已脫毒植物影響因素第二十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.1莖尖培養(yǎng)脫毒原理病毒在植物體內的布不均勻，頂端分生組織無病毒或病毒濃度低。在生長點含有病毒數量極少，幾乎檢測不出病毒傳遞途徑：維管束和胞間連絲在分生區(qū)域內無維管束；在胞間連絲中，病毒移動速度慢于不斷分裂和活躍的細胞，從而在分生組織中，病毒移動和復制受阻。第三十頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.2莖尖培養(yǎng)脫毒研究簡況1943年：White培養(yǎng)番茄根，發(fā)被煙草花葉病毒侵染的番茄根切段的病毒含量不一致，在近根尖的切段低，而在根尖頂端則全部無病毒1948-1949年：Holmes和Masset等發(fā)現，由病毒感染的植株，不同部位病毒分布不一致。在老葉和成熟的組織及其器官中含量高，而幼嫩的和未成熟組織及其器官中含量低，在生長點0.1-1mm區(qū)域，則幾乎不含病毒。1952年：Mores等從感染花葉病毒的大麗花植株分離了莖尖0.25mm大小的分生組織培養(yǎng)獲得植株，嫁接在大麗花實生砧木上，經檢測為無病毒植株。1955年：Mores以馬鈴薯為材料，也獲得了無病毒種苗已有近100種園藝植物通過莖尖培養(yǎng)方法獲得無病毒苗第三十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.3莖尖培養(yǎng)獲得的無病毒植物植物種類病毒莖尖大小甘薯斑紋花葉病毒1-2縮葉花葉病毒1-2羽毛狀花葉病毒0.3-1馬鈴薯Y病毒1-3X病毒0.2-0.5卷葉病毒1-3G病毒0.2-0.3S病毒0.2大麗菊花葉病毒0.6-1第三十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日莖尖培養(yǎng)獲得的無病毒植物（續(xù)）植物種類病毒莖尖大小香石竹花葉病毒0.2-0.8百合花葉病毒0.2-1大蒜花葉病毒0.3-1矮牽牛煙草花葉病毒0.1-0.3菊花花葉病毒0.2-草莓各種病毒0.2-1甘蔗花葉病毒0.7-0.8春山芥蕪青花葉病毒0.5第三十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.4莖尖培養(yǎng)脫毒程序材料的選擇取出莖尖培養(yǎng)再生第三十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.4.1材料的選擇品種要可靠選擇高產優(yōu)質的品種作為脫毒材料名貴稀有的植物良種第三十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.4.2莖尖的剝取剝去生長點（錐）外圍的幼葉和葉原基，露出圓滑的生長錐。剝取莖尖時：迅速（防污染），準確（防損傷生長錐），用顯微鐿第三十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日莖尖形狀、大小和外圍幼葉、葉原基著生方式草莓大蒜蘭花青芋山芋香石竹第三十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日第三十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.5影響莖尖成活及脫毒效果的因素3（1）莖尖大小大，容易成活，獲得植株多，但病毒難以除去P121香石竹不同大小莖尖培養(yǎng)與脫毒率的關系莖尖太大不易脫除病毒康乃馨0.1mm和1mm莖尖脫除病毒的效率分別為66%和10%不同植物脫毒莖尖大小不一，康乃馨、百合、鳶尾、菊花和草莓脫除花葉病時：0.2-1mm大麗花脫除花葉病毒：0.6-1mmmm不同病毒種類要求莖尖大小不一樣馬鈴薯Y病毒和卷葉病毒，脫毒莖尖大小為1-3mmG和Xmm；S病毒0.2mm（2）葉原基有無：有則難于脫毒第三十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日影響莖尖成活及脫毒效果的因素（3）培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基生長調節(jié)劑：有機物質：碳源：葡萄糖和蔗糖，濃度2%-4%第四十頁，共七十一頁，2022年，8月28日3.莖尖微芽嫁接Shoottipgrafting,micrograftingmm的莖尖作為接穗，在解剖鏡下嫁接到試管實生苗上，獲得完整植株的操作過程。1975年在柑桔上取得成功，現在蘋果、桃、梨上獲得成功。第四十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日3.1意義培育無病毒苗解決常規(guī)培養(yǎng)不能再生根的問題提早開花結果第四十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日3.2方法田間材料取莖尖種子播種獲得黃化苗嫁接消毒取小莖尖培養(yǎng)再生移栽第四十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日圖解第四十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日4.種子或胚心胚培養(yǎng)脫毒法脫毒原理：珠心與維管束系統(tǒng)無真接聯系成功的實例1969年：美Rangan培養(yǎng)授粉后100天左右的柚、Temple珠心組織，獲得無病毒苗1973年：西班牙Sicilia播種帶病毒甜橙種子得到避毒系1977年：美Button培養(yǎng)華盛頓臍橙珠心組織獲得無病毒苗1979年：西班牙Navarro克里邁丁桔無病毒珠心苗1990年：高峰柑桔未授精胚珠離體培養(yǎng)獲得華臍無病毒苗第四十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日5.愈傷組織培養(yǎng)脫毒法P126（自學）第四十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日6.花藥培養(yǎng)脫毒法1974年日本：花藥培養(yǎng)可以脫除草莓病毒；花藥采取時期單核期：花蕾4-6mm，花藥1mm花藥誘導愈傷組織培養(yǎng)基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+瓊脂7g/L增殖培養(yǎng)基MS+GA1mg/L+IBA0.2-0.5mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+瓊脂7g/L生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+瓊脂7g/L第四十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日7.熱處理和莖尖脫毒法馬鈴薯蘋果第四十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日五、脫毒苗的鑒定直觀測定法指示植物鑒定法病毒的汁液感染法(saptransmission)抗血清測驗法電鏡觀察法第四十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日1、直觀測定法時間長敏感度不夠杏紅斑病香蕉束頂病第五十頁，共七十一頁，2022年，8月28日2、指示植物法1929年美國病毒學家Holmes發(fā)現利用病毒在植物上產生枯斑來鑒定病毒的一種方法。有些病毒可能在一種或幾種植物上產生枯斑，便有一種或幾種指示植物鑒定同一種病毒。指示植物是指對某種或某幾種病毒及類似病原物或株系有敏感反應，并表現明顯癥狀的植物。第五十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日（1）指示植物法的意義確認一種病毒類病原物在癥狀不明顯或不確定的植株中存在；用于檢測隱形病毒的存在或某些品種的隱形病毒，確定無病癥的植株上是否存在病毒；標記病毒復合物的存在以及鑒定病毒。第五十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日（2）指示植物的要求指示植物對所指示的病毒類病原物敏感指示植物對所指示的病毒類病原物專一表現癥狀快易于繁殖第五十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日指示植物（仁果）樹種木本指示植物嫁接株數鑒定時間（年）病毒種類蘋果大果海棠32褪綠葉斑病毒、鱗皮病毒、矮縮病毒弗吉尼亞小蘋果33莖痘病毒、莖溝病毒、反卷病毒蘇俄蘋果32褪綠葉斑病毒梨雜種溫勃32脈黃病毒、衰退病、樹皮壞死病哈代32環(huán)紋花葉病毒、脈黃病毒、裂皮病、樹皮壞死病威謙斯姆32粗皮病、裂皮病第五十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日指示植物（核果）樹種木本指示植物嫁接株數鑒定時間（年）病毒種類桃薩姆32壞死銹斑駁病毒鈦爾頓33櫻桃扭葉病毒青膚櫻32綠環(huán)斑駁李櫻桃李32美洲線紋斑病毒杏青膚櫻32綠環(huán)斑駁病毒櫻桃青膚櫻56周-1年綠環(huán)斑駁病毒第五十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日常用草本指示植物藜科：昆諾藜、莧色藜、墻生藜等；豆科：菜豆茄科：心葉煙、克利夫蘭煙莧科：千日紅、青葙葫蘆科：黃瓜第五十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日葡萄卷葉病指示植物—麗株—葉片反卷、紅葉第五十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日蘋果莖痘病指示植物—司派—葉片反卷第五十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日蘋果褪綠葉斑病指示植物西方煙（葉雛縮）莧色藜（壞死斑）第五十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日（3）指示植物法的類型分為兩種汁液鑒定法（草本指示植物法）嫁接鑒定法（木本指示植物法）第六十頁，共七十一頁，2022年，8月28日I、汁液鑒定法脫毒處理再生植株幼葉1-3克在研缽中加10ml水及少量磷酸緩沖液（0.1M，pH7），研磨過濾在指示植物葉片上產生小傷口濾液在葉片傷口涂抹2-3次清水沖洗，15-25保溫2-6天產生病斑，（）脫毒不產生病斑，（）脫毒第六十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日II、嫁接鑒定法雙重芽接法在8月中旬進行砧木脫毒苗芽指示植物芽指示植物芽脫毒芽實生砧木雙重切接法在春季進行指示植物直接嫁接法第六十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日4、抗血清（antiserum）測驗法病毒在肌體內產生抗體，抗體主要存在于血清中，故名曰抗血清。不同病毒產生的抗血清不同，因此可以用已知病毒的抗血清，鑒定未知的病毒種類，即血清反應法。第六十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日血清學方法沉淀反應凝聚反應熒光抗體法單克隆抗體法酶