第五章其他分離方法

第5章其它色譜方法2023/2/6紙層析和柱層析法

薄層色譜高效毛細(xì)管電泳

超臨界流體色譜2023/2/6紙層析2023/2/6一、紙層析分離過程

紙層析也屬于色譜分析法。但與其它色譜方法不同的是在分離過程中一般不使用動力源。

紙層析流動相的移動是依靠毛細(xì)作用。將試樣點(diǎn)在色譜濾紙或?qū)游霭宓囊欢?，并將該端浸在作為流動相的溶劑（常稱之為展開劑）中，隨著溶劑向上的移動，經(jīng)過試樣點(diǎn)時，帶動試樣向上運(yùn)動。Rf值相差越大，分離效果越好

2023/2/6二、操作技術(shù)1.層析紙和層析板特制的色層濾紙。按需要剪裁成長條形（或筒型）。層析板是用專門的涂布器把漿狀的吸附劑（硅膠或氧化鋁，200～250目）均勻地涂在長條形玻璃板上（厚度0.15～0.5mm）。干燥后即可使用。2023/2/62.展開劑由一種或多種溶劑按一定比例組成。如用紙層析分離氨基酸時，常用的展開劑組成和配比為：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。2023/2/63.點(diǎn)樣用微量注射器或玻璃毛細(xì)管吸取一定量試樣點(diǎn)在原點(diǎn)上。試樣點(diǎn)的直徑一般應(yīng)小于5mm?？刹⑴劈c(diǎn)多個試樣同時展開。2023/2/64.顯色、檢測有些組份在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，可在紫外燈下用鉛筆將組份斑點(diǎn)描繪出來。常用的顯色方法有噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或氨水熏等。2023/2/6三、特點(diǎn)及應(yīng)用

平板色譜簡單、方便、及操作費(fèi)用低，可以在一塊層析板上同時展開多個試樣及將多條濾紙同時展開。采用方形薄層板還可以方便的進(jìn)行二維展開，即按一般方法展開后，改變方向和展開劑再次展開，進(jìn)一步改善分離效果。試樣一般不需要經(jīng)過預(yù)處理即可分離。

2023/2/6缺點(diǎn)：分離效率較低，不適用揮發(fā)性試樣分離。定性定量不便。

應(yīng)用：平板色譜法在染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、有機(jī)酸堿類化合物、糖類化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)及中草藥中有效成分的分離分析中經(jīng)常被使用。也可以用于無機(jī)離子的分離。還經(jīng)常作為高效液相色譜的一種預(yù)試方法。2023/2/6柱層析2023/2/6柱層析：是吸附色譜的一種，它利用吸附劑對不同物質(zhì)吸附能力的差異，用溶劑將混合物的組分逐一洗脫分離的一種分離方法。

微型柱層析實(shí)驗(yàn)2023/2/6實(shí)例:凝膠過濾層析純化細(xì)胞色素C

2023/2/6一、目的要求1.學(xué)習(xí)和掌握凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)的原理與方法。2.通過凝膠過濾柱層析對細(xì)胞色素C進(jìn)行純化2023/2/6二、原理凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離。2023/2/62023/2/6優(yōu)點(diǎn)：a.條件溫和b.操作簡便c.損失少回收率高d.層析柱可反復(fù)使用凝膠的類型：Sephadex:交聯(lián)葡聚糖Sepharose：瓊脂糖凝膠Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝膠分子篩Sephacryl：用N，N-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖凝膠G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝膠）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范圍（肽與蛋白）D<700<1500<50001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-5000002023/2/6凝膠及柱的選擇2023/2/6凝膠的處理及裝柱凝膠干粉的溶脹（熱溶脹）、浮選、抽氣、裝柱、藍(lán)色葡聚糖檢查、平衡裝柱時要注意操作壓。2023/2/6裝柱的兩種方法：a.手工操作

1/3床體積水→加入少許凝膠積起1-2厘米凝膠床→打開出水口→連續(xù)緩慢加入凝膠b.電動攪拌下的裝柱法

2023/2/6樣品上柱分析用量：柱床體積的1—2%制備用量：柱床體積的20—30%洗脫收集部分收集器、核酸蛋白檢測儀凝膠的保存方法0.02%疊氮鈉或0.002%洗必泰2023/2/6三、試劑與器材試劑：0.01mol/lTris-HCl緩沖液，PH7.5，含0.2mol/lNaCl器材：層析柱、部分收集器、核酸蛋白質(zhì)檢測儀、記錄儀2023/2/6（二）裝柱

1.裝柱前，必須用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將凝膠上面過多的溶液傾出。

2.先關(guān)閉層析柱出水口，向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，然后邊攪拌，邊將薄漿狀的凝膠液連續(xù)傾入柱中，使其自然沉降，等凝膠沉降約2-3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關(guān)閉出水口。（三）凝膠柱的平衡通過2-3倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時凝膠被沖起，并始終保護(hù)凝膠上端有一段液體。

2023/2/6（四）加樣1.準(zhǔn)備好部分收集器、核酸蛋白檢測儀及記錄儀2.打開柱上端的螺絲帽塞子，吸出層析柱中多余液體直至與膠面相切。沿管壁將細(xì)胞色素C樣品溶液1mL小心加到凝膠床面上，應(yīng)避免將床面凝膠沖起，打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時收集流出液，當(dāng)樣品溶液流至與膠面相切時，夾緊下口夾子。按加樣操作，用1mL洗脫液沖洗管壁2次。最后加入3－4mL洗脫液于凝膠上，旋緊上口螺絲帽，柱進(jìn)水口連通恒壓瓶，柱出水口與核酸蛋白質(zhì)檢測儀比色池進(jìn)液口相連，比色池出液口再與自動部分收集器相連。（五）洗脫洗脫時，打開上、下進(jìn)出口夾子，用0.025mol/LTris-HCl，以每管3mL/10min流速洗脫，用自動部分收集器收集流出液。2023/2/62023/2/6六、注意事項(xiàng)1）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。2）裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，最好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此壓緊凝膠。3）始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分蒸發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動。2023/2/6薄層層析法（TLC）2023/2/6引言歷史：薄層層析法TLC：50年代后在紙層析和柱層析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來1951年J.G.kirchner首先對其進(jìn)行了系統(tǒng)的研究1958年E.Stahl對薄層層析用的吸附劑和涂層工具進(jìn)行改進(jìn)并使之標(biāo)準(zhǔn)化，克服了技術(shù)上的困難，使TLC獲得迅速發(fā)展定義：TLC是把固定相吸附劑鋪在玻璃板上鋪成均勻的薄層，把試液點(diǎn)在層析板（即薄層）的一端試樣中各組分就被吸附劑所吸附，由于薄層的毛細(xì)管作用，展開劑沿著吸附薄層上升，試樣溶解在展開劑中，在固定相和流動相之間不斷的發(fā)生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配過程。優(yōu)點(diǎn)：快速，做一次薄層層析只需10-60min；分離效率高；靈敏度可達(dá)0.01μg；層析后可用各種方法顯色，甚至可噴強(qiáng)腐蝕性的濃硫酸，可高溫灼熱；應(yīng)用面廣，可以進(jìn)行定性及定量測定對于各種試劑，可選用不同的吸附劑和展開劑可做吸附層析、分配層析以及離子交換層析。薄層層析法2023/2/6原理展開劑在薄層中的流速與展開劑的表面張力、粘度及吸附劑的種類、粒度、均勻度等等因素有關(guān)，即和層析系統(tǒng)（固定相和流動相）有關(guān)，也和展開距離有關(guān)。塔板理論亦可應(yīng)用于TLC中，將塔板高度和展開距離聯(lián)系起來。TLC中層析效率同樣可用分離度表示。

Rs=2(x2-x1)/(w1+w2)。當(dāng)Rf=0.33時，Rs值最大，分離最好。選擇合適的吸附劑和展開劑是TLC分離能否獲得成功的關(guān)鍵。

2023/2/6原理吸附劑：最常用的是氧化鋁和硅膠。展開劑：可用單一的溶劑并且還常常把各種溶劑按不同比例混合配成混合溶劑以作展開劑。鋪層：干法鋪層--簡單快速、隨鋪隨用，但不能保存，易被吹散。分離效果差。層析展開較快。濕法鋪層--常用有傾倒法、刮層法、涂鋪器鋪層法。點(diǎn)樣：需用易于揮發(fā)、極性和展開劑相似的溶劑溶解試樣以得到

0.5-1%的試液。可用毛細(xì)管或微量注射器把試樣點(diǎn)成小圓點(diǎn)或長條。力求快速展開：上行法--常用干板近水平方向展開硬板采用近垂直方向展開下行法--比上行法快，但分離效果較差。2023/2/6SW-86過去的TLC2023/2/67照相

SOP1預(yù)制板2點(diǎn)樣3

展開4

衍生5檢測6

報(bào)告8現(xiàn)代平面色譜2023/2/6應(yīng)用1傳統(tǒng)中藥中糖的分析糖廣泛存在于中草藥中，干重占整個植物的80-90%中藥中多糖的分析在制藥上有非常重要的意義TLC可以用來純化測量和從寡糖、多糖中確認(rèn)單糖2023/2/6應(yīng)用2低分子量化合物快速成像TLC-MALDI-TOFMS對微量分析展開以及原位操作有高速度和選擇性。對于低分子量分析物，基質(zhì)的背景離子常引起嚴(yán)重的干擾。使用UV吸收質(zhì)子給體離子液體（Et3N·α-CHCA）作為基質(zhì)分析低分子量物質(zhì)如生物堿ArborescidineA、B、C，麻醉劑Levobupivacaine、Mepivacaine和抗體Tetracycline。

2023/2/6應(yīng)用3TLC-MALDI-TOFMS分析粗型脂

多糖LPSs）和LipidA?內(nèi)毒素LPSs的混合物，其脂結(jié)構(gòu)域稱為LipidA，與多種生物活動相關(guān)，沒有O鏈的LPSs稱為粗型LPS

?使用TLC，選用合適的溶劑在硅膠上選擇性的萃取分離完整細(xì)胞的LPS組分，所得分子物種的譜帶在無損傷成像后從板上刮下來直接和基質(zhì)混合，用MALDI-TOFMS進(jìn)行分析?基質(zhì)加入檸檬酸極大改善譜圖

?TLC直接從細(xì)胞中萃取分離出LPSs并進(jìn)行表征，快速、靈敏，可用于結(jié)構(gòu)和血清分析。2023/2/6應(yīng)用4TLC-VC-MALDIMS分析神經(jīng)節(jié)苷脂神經(jīng)節(jié)苷脂廣泛存在于動物細(xì)胞外膜表面，代謝、生物合成、生理性質(zhì)均引起人們注意。其中TLC是分析這類糖脂混合物以及其生物行為的標(biāo)準(zhǔn)工具[17-18]。TLC和MS偶聯(lián)起來可以滿足結(jié)構(gòu)分析使用1-10mbar達(dá)到振動冷卻（vibrationalcooling）即用TLC-VC-MALDI-FTMS分析神經(jīng)節(jié)苷脂

VeraB.Ivlevaetc.Anal.Chem.2004,76,6484.

?TLC-VC-MALDI-FTMS聯(lián)用樣品處理簡單，可以二維成像?傅里葉變換有高分辨率和準(zhǔn)確度，可以更好的分析結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)?外置離子源可規(guī)避TLC板的不規(guī)則表面引起的分辨率和準(zhǔn)確度的降低?TLC板還可直接與MALDI相連，不需對分析物進(jìn)行再次萃取。2023/2/65TLC板熒光成像分析神經(jīng)節(jié)苷脂TomohiroHayakawa等人利用100oC以下僅有唾液酸發(fā)熒光的特征，通過熒光成像定量測定神經(jīng)節(jié)苷脂神經(jīng)節(jié)苷脂上唾液酸濃度與熒光強(qiáng)度的線性范圍47pM-4.5nMTLC板上的熒光成像分析可以測量更寬范圍的神經(jīng)節(jié)苷脂通過調(diào)整加熱溫度，可分析糖脂類物質(zhì)。該方法簡單、低廉、重現(xiàn)性好、不需特殊試劑、不需熒光標(biāo)記，可以定量測定。

TomohiroHayakawa;MitsuhiroHiraiAnal.Chem.2003,75,6728.

2023/2/6進(jìn)展

解析電噴霧電離（DESI）是新的大氣壓解析電離方法DESI主要應(yīng)用于表面分析，TLC可以通過DESI和MS偶聯(lián)2023/2/6總之TLC省時、省原料，可以同時分析多種樣品。耗資少，所需儀器少，所需操作培訓(xùn)少，它是一種平面的分離手段，極易和MALDI-MS(基體輔助激光解吸電離質(zhì)譜法

)聯(lián)用，甚至可以在原位分析多種物質(zhì)，也有許多嘗試應(yīng)用不同的電離源來進(jìn)行結(jié)構(gòu)和定量測定，在許多領(lǐng)域都有潛在的應(yīng)用前景。2023/2/6高效毛細(xì)管電泳一、高效毛細(xì)管電泳基本原理二、儀器裝置三、影響柱效的因素及改進(jìn)方法四、主要特點(diǎn)和應(yīng)用2023/2/6高效毛細(xì)管電泳儀器（1）2023/2/6高效毛細(xì)管電泳儀器（2）2023/2/6高效毛細(xì)管電泳儀器（3）2023/2/6一、高效毛細(xì)管電泳基本原理

在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同可實(shí)現(xiàn)分離。1.經(jīng)典電泳分離法的不足所用分離柱的柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠(yuǎn)低于HPLC），溫度影響大。高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)。2023/2/62.高效毛細(xì)管電泳技術(shù)上的重要突破高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管,；二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長增加，高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。2023/2/63.電泳現(xiàn)象與電滲流現(xiàn)象

電泳現(xiàn)象：帶電離子在電場作用下的遷移，速度ν電泳

電滲流現(xiàn)象：玻璃表面存在硅羥基,pH>3時,形成雙電層，在高電場的作用下引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動，速度ν電滲流。2023/2/64.分離過程

電場作用下，柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和。正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向一致，在負(fù)極最先流出；中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向相反，ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。2023/2/65.分離類型八種分離類型(1)

毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）

最普遍、最基本的一種分離模式。(2)毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）

將聚丙烯酰胺在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高?？煞蛛x測定蛋白質(zhì)、DNA等。2023/2/6(3)毛細(xì)管膠束電動色譜（MECC）

在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。在電場力的作用下，膠束在柱中移動。由于電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，則帶負(fù)電的膠束以較慢的速度向負(fù)極方向移動，中性試樣分子在膠束相和溶液（水相）兩相間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時間長?？捎脕矸蛛x中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍。2023/2/6二、儀器裝置電壓：0～30KV。分離柱不涂敷任何固定液，紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器（可檢測到：10-19～10-21

mol/L）2023/2/6三、影響柱效的因素及改進(jìn)方法熱效應(yīng)：焦耳熱仍是影響柱效的主要因素。采用外部冷卻的方法散熱，擇合適的電壓和電解質(zhì)也是提高柱效的有效途徑。選擇合適的電解質(zhì)降低電阻，電流低于200微安，一般幾十微安。電滲流控制：電滲流的大小和方向依賴于毛細(xì)管壁與溶液間電勢的極性和大小。使用添加劑可以改變電滲流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低電滲流；加入乙腈則可以增大電滲流。加入反轉(zhuǎn)劑。則可以改變電滲流的方向。2023/2/6四、主要特點(diǎn)和應(yīng)用高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬塊，甚至數(shù)千萬塊。高靈敏度：可檢測出低至10-21

mol/L濃度的物質(zhì)。高分析速度：可在3分鐘內(nèi)分離30種陰離子；1.7分鐘分離19種陽離子;4分鐘可分離10種蛋白質(zhì).試樣用量少：僅需幾nL（10-9L）的試樣儀器簡單，操作成本低：分析一個試樣僅需幾毫升流動液。不足之處：進(jìn)樣不夠方便。應(yīng)用范圍相對較窄。分析陰離子時，由陰極進(jìn)樣，在陽極檢測。但電滲流方向與陰離子受電場力作用移動方向相反，出峰時間較長。2023/2/6

超臨界流體色譜一、超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理featureandprincipleofSFC二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)流程structureandgeneralprocessofSFC

三、超臨界流體色譜的應(yīng)用applicationofSFCsupercriticalfluidchromatograph,SFC2023/2/6Berger(產(chǎn)地：美國)超臨界流體色譜儀(SFC)

技術(shù)參數(shù)

1.流量0--70ml/min

2.改性劑0-100%

3.多階程序升溫

4.壓力程序主要特點(diǎn)1.分析速度比HPLC提高3-10倍

2.溶劑成本是HPLC的1/3-1/40

3.可以連接氣相的FID檢測器,也可連接液相的UV,DAD等檢測器，更有MS檢測器

4.杰出的手性化合物分離能力

5.精密的超臨界流體控制技術(shù)2023/2/6JASCO(產(chǎn)地：日本)超臨界色譜儀(SFC)

技術(shù)參數(shù)1.流量范圍:0.001-10ml/min

2.最高壓力:30MPa主要特點(diǎn)

1.與泵一體的泵頭制冷裝置設(shè)計(jì)便于操作

2.獨(dú)有的SSQD系統(tǒng),確保了被輸送介質(zhì)的流速穩(wěn)定

3.泵頭電子冷卻裝置保持泵頭溫度低于－4℃

4.系統(tǒng)控制單元包括各種操作模式,如加入有機(jī)改性試劑2023/2/6一、超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理

principleandcharacterofsupercriticalfluidchromatography1.概述

超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。超臨界流體色譜(SFC)，80年代快速發(fā)展，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點(diǎn):（1）可處理高沸點(diǎn)、不揮發(fā)試樣；（2）比LC有更高的柱效和分離效率。2023/2/62.超臨界流體性質(zhì)（1）性質(zhì)介于液體和氣體之間;具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴(kuò)散系數(shù)位于兩者之間。（2）可通過改變超臨界流體的密度（程序改變）調(diào)節(jié)組分分離（類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗）。

超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。2023/2/63.原理

SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3

SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細(xì)管柱SFC；

分離機(jī)理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被分離；通過調(diào)節(jié)流動相的壓力（調(diào)節(jié)流動相的密度），調(diào)整組分保留值；2023/2/6壓力效應(yīng)：SFC的柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大30倍），對分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)