第一章核酸的化學組成

一、核酸的一般化學組分二、核酸的修飾組分三、核酸及其組分的化學反應(yīng)四、核酸組分的分離鑒定第一章核酸化學組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)一、核酸的一般化學組分DNA、RNA中主要的堿基、核苷和核苷酸

戊糖堿基核苷核苷酸

RNAD-核糖

A腺苷A5’-腺苷酸（AMP）G鳥苷G5’-鳥苷酸（GMP）C胞苷C5’-胞苷酸（CMP）U尿苷U5’-尿苷酸（UMP）DNAD-2-脫氧核糖A脫氧腺苷dA5’-脫氧腺苷酸（dAMP）G脫氧鳥苷dG5’-脫氧鳥苷酸（dGMP）C脫氧胞苷dC5’-脫氧胞苷酸（dCMP）T脫氧胸苷dT5’-脫氧胸苷酸（dTMP）1.組成核酸的堿基

腺嘌呤鳥嘌呤

嘌呤Adenineguanine

A

G9NNNN123465871.組成核酸的堿基

尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶

uracilcytosinethymine

NN654321嘧啶UCTH3C2，4-二氧嘧啶2-氧-4-氨基嘧啶5-甲基-2，4-二氧嘧啶核酸中除了5類基本的堿基外，還有一些含量甚少的堿基，稱為稀有堿基。組成核酸的稀有堿基NNNNONNNH2O—CH3Im5CDHU堿基的結(jié)構(gòu)特征堿基都具有芳香環(huán)的結(jié)構(gòu)特征。嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)均呈平面或接近于平面的結(jié)構(gòu)。堿基的芳香環(huán)與環(huán)外基團可以發(fā)生酮式—烯醇式或胺式—亞胺式互變異構(gòu)。胺式

亞胺式互變異構(gòu)酮式烯醇式互變異構(gòu)已公認：氫原子在堿基上有固定的位置2.戊糖組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的戊糖為β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的戊糖則為β-D-核糖。糖環(huán)的折疊構(gòu)象

核酸中糖環(huán)的折疊形式是一個構(gòu)象問題。所謂構(gòu)象是指化合物中可以自由轉(zhuǎn)動的單鍵上的原子或基團繞單鍵旋轉(zhuǎn)或隨單鍵扭轉(zhuǎn)時產(chǎn)生的若干種不同的空間排列形式；構(gòu)象的改變不伴隨著共價鍵的破壞。構(gòu)型是指共價鍵化合物分子中各原子在空間的相對排列關(guān)系。由于共價鍵具有方向性，所以每一分子具有一定的幾何構(gòu)型，如乳酸的D和L型、單糖的α和β型。構(gòu)型的改變涉及共價鍵的破壞。核酸中的戊糖只有一種構(gòu)型，即β-D型，但它們的構(gòu)象卻有許多種。核酸中戊糖的五元糖環(huán)不呈一個平面，其中的C1’-O-C4’這3個原子一般在一個平面上，而C2’和C3’偏離平面0.05～0.06nm，這種偏離就使糖環(huán)具有不同的構(gòu)象。若C2’或C3’偏離平面的方向與C5’同向，則稱為內(nèi)式（endo)構(gòu)象；若與C5’反向，則稱為外式（exo）構(gòu)象。綜合C2’和C3’偏離平面的情況，糖環(huán)的折疊形式有兩大類：（1）信封式糖環(huán)的C2’和C3’中只有一個原子偏離平面則稱為信封式折疊（Envelope,簡寫為E）。如C2’-endo（2E),C2’-exo(E2)，C3’-

endo(3E),C3’-exo(E3)。上述幾種構(gòu)象可分別以側(cè)視簡圖表示：3’2’C5’4’1’ONC2’-endo（2E)2’C5’4’1’ON3’C3’-

endo(3E)C5’4’1’ON2’3’C3’-exo(E3)C5’4’1’ON3’2’C2’-exo(E2)（2）扭轉(zhuǎn)式糖環(huán)的C2’和C3’都偏離平面而且偏離方向相反稱為扭轉(zhuǎn)式折疊（Twist,簡寫為T）。如C2’-endo-C3’-exo（23T),C2’-exo-C3’-

endo(3T2)。上述幾種構(gòu)象可分別以側(cè)視簡圖表示：3’2’C5’4’1’ONC2’-endo-C3’-exo（3T)2’3’C5’4’1’ONC2’-exo-C3’-

endo(3T2)23.核苷(nucleoside)核苷由戊糖和堿基縮合而成，嘌呤的N9或嘧啶的N1與戊糖C-1’-OH以C-N糖苷鍵相連接。dANNNNNH2OHHOHOCH2HHHH9NONOOHOCH2HHHHOHOHU1假尿苷胸腺嘧啶核糖核苷稀有核苷（tRNA）4.核苷酸(nucleotide)核苷酸是核苷的磷酸酯。作為DNA或RNA結(jié)構(gòu)單元的核苷酸分別是5′-磷酸-脫氧核糖核苷和5′-磷酸-核糖核苷。核苷酸的衍生物ATP是生物體內(nèi)分布最廣和最重要的一種核苷酸衍生物。它的結(jié)構(gòu)如下：（1）ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸)

(2)GTP(鳥嘌呤核糖核苷三磷酸)（3）環(huán)化核苷酸cAMP和cGMPcAMP(3’,5’-環(huán)腺嘌呤核苷一磷酸)和cGMP(3’,5’-環(huán)鳥嘌呤核苷一磷酸)的主要功能是作為細胞之間傳遞信息的信使。cAMP

和cGMP

的環(huán)狀磷酯鍵是一個高能鍵。在pH7.4條件下,cAMP

和cGMP

的水解能約為43.9kj/mol，比ATP水解能高得多。（1）參與DNA、RNA的合成、蛋白質(zhì)的合成、糖與磷脂的合成。（2）在能量轉(zhuǎn)化中起重要作用，ATP是生物體內(nèi)能量的通用貨幣。（3）是構(gòu)成多種輔酶的成分：NAD、NADP、FAD、FMN和CoA。（4）參與細胞中的代謝與調(diào)節(jié)（cAMP、cGMP）。5．核苷酸的生物學作用一、核酸的一般化學組分二、核酸的修飾組分三、核酸及其組分的化學反應(yīng)四、核酸組分的分離鑒定第一章核酸化學組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)到目前為止，核酸中發(fā)現(xiàn)了近80種特別的組分，它們絕大多數(shù)是基本組分的衍生物，即在堿基或核糖的某些位置上附加或取代掉某些基團。把這些特別的組分稱為修飾組分（也稱稀有組分或附加組分）。二、核酸的修飾組分1948年Hotchkiss在小牛胸腺DNA中檢測到5－甲基胞嘧啶脫氧核苷，這使人們認識到，除了基本組分外，核酸中還有一些特別的組分存在。1.含有修飾堿基的核苷目前在RNA和DNA中已檢測到60多種核苷含有修飾堿基。比較簡單的修飾是原有的嘌呤或嘧啶上某個原子被甲基、甲硫基、羥甲基等取代，或經(jīng)脫氨、加氫等成為修飾組分。如：m5C、S4U、DHU、I、m6A、m7G等。2.含有修飾核糖的核苷目前只發(fā)現(xiàn)一種修飾核糖，即核糖2’－OH上的H原子被甲基取代，生成β－D－2’－O-甲基核糖，如：Cm(2’-o-甲基胞苷）。含有修飾核糖的核苷只存在于RNA中，其中有些是堿基和核糖同時被修飾。3.含有C-C糖苷鍵的核苷目前所知只有假尿嘧啶核苷及其衍生物屬此。尿嘧啶核苷中糖苷鍵是N1-C1’,而假尿苷（ψ）中是C5-C1’相連。tRNA中修飾組分種類最多，有60多種。rRNA中的修飾組分有10多種，其中多數(shù)是甲基化修飾。原核mRNA分子中至今未發(fā)現(xiàn)有修飾組分，真核mRNA中的修飾組分只有幾種，主要是在帽子結(jié)構(gòu)中的m7G、m22,7G、m32,2,7G、Nm和分子內(nèi)部順序中的m6A、m5C。4.DNA的甲基化修飾

甲基化是基因組DNA的一種主要表觀遺傳修飾形式,是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段。

DNA的甲基化修飾發(fā)生在DNA中一定的堿基順序上，而且呈180°旋轉(zhuǎn)對稱。如脊椎動物DNA的甲基化多數(shù)在5’CpG3’順序的C上，與它互補的3’GpC5’順序中的C也是甲基化的。各種生物體中DNA甲基化的特征≤90%的位點特征脊椎動物植物大腸桿菌甲基化堿基甲基化順序甲基化程度甲基化位點的180°旋轉(zhuǎn)對稱性m5dCm5dCm5dC,m6dACGCG,CXG(X=A,C,T)CCA(T)GG,GATC≤90%的位點～100%的位點＋＋＋DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一個重要機制，它能從一個DNA序列產(chǎn)生不同模式的基因表達。它對正常發(fā)育至關(guān)重要，其功能失?？梢鸢┌Y和其他異常?，F(xiàn)在，研究人員利用高通量亞硫酸氫鹽測序與單分子測序相結(jié)合的方法，以核苷酸分辨率獲得了在胚胎干細胞中和在由它們形成的各種不同的細胞類型中DNA甲基化的一個分布圖。該分布圖顯示了基因組中甲基化隨細胞發(fā)育（如當胚胎干細胞成熟成為神經(jīng)細胞時）而變化的特定點。更具普遍意義的是，這種方法對于與發(fā)育生物學、癌癥和再生醫(yī)學相關(guān)的細胞群的表觀遺傳分析將會是有價值的。DNA甲基化修飾DNA甲基化修飾的作用E.coli中，可以保護DNA免受本身限制性核酸內(nèi)切酶的切割，而從外界侵入的外源DNA卻會被E.coli的限制性核酸內(nèi)切酶降解，這樣就大大減少了無關(guān)種類之間的基因轉(zhuǎn)移效率。最近幾年研究表明，DNA甲基化在E.coliDNA的錯配修復(fù)中也有重要作用。在高等生物中，DNA甲基化可能影響蛋白質(zhì)和DNA的相互作用，從而調(diào)節(jié)基因的表達和胚胎發(fā)育。一些研究結(jié)果表明，低甲基化是基因活躍轉(zhuǎn)錄的必要條件之一。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機理用組蛋白Hl與含CCGG序列的甲基化和非甲基化DNA實驗后發(fā)現(xiàn)：甲基化達到一定程度時會發(fā)生從常規(guī)的B-DNA向Z-DNA的過渡。由于Z-DNA結(jié)構(gòu)收縮，螺旋加深，使許多蛋白質(zhì)因子賴以結(jié)合的元件縮入大溝而不利于基因轉(zhuǎn)錄的起始。DNA甲基化導致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化，影響蛋白質(zhì)與DNA的相互作用；抑制轉(zhuǎn)錄因子與啟動區(qū)DNA的結(jié)合效率。用序列相同但甲基化水平不同的DNA為材料，比較其作為RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄模板的活性，發(fā)現(xiàn)甲基的引入不利于模板與RNA聚合酶的結(jié)合，降低了其體外轉(zhuǎn)錄活性。5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是隨機分布的，基因的5'端和3’端往往富含甲基化位點，而啟動區(qū)DNA分子上的甲基化密度與基因轉(zhuǎn)錄受抑制的程度密切相關(guān)。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機理一、核酸的一般化學組分二、核酸的修飾組分三、核酸及其組分的化學反應(yīng)四、核酸組分的分離鑒定第一章核酸化學組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)三、核酸及其組分的化學反應(yīng)1.水解反應(yīng)2.β-消除反應(yīng)3.肼解反應(yīng)4.與羥胺的反應(yīng)5.親電取代反應(yīng)6.加成反應(yīng)7.脫氨反應(yīng)8.與甲基氫氧化汞的反應(yīng)9.核糖的氧化反應(yīng)（1）化學水解:

N-糖苷鍵對堿穩(wěn)定，磷酸二酯鍵一般也對堿穩(wěn)定，但RNA分子由于核糖上有2’-羥基，在堿催化下能生成2’-核苷酸和3’-核苷酸。DNA一般不被堿水解。N-糖苷鍵對酸不穩(wěn)定，嘌呤比嘧啶的糖苷鍵不穩(wěn)定，DNA比RNA的更不穩(wěn)定。磷酸二酯鍵對酸也不穩(wěn)定。DNA中的N-糖苷鍵比磷酸二酯鍵更不穩(wěn)定，一般得到的是游離堿基，而不是脫氧單核苷酸，堿基脫落后變成多聚核糖磷酸，其磷酸二酯鍵因β-消除反應(yīng)而斷裂。RNA中的磷酸二酯鍵的酸不穩(wěn)定性小于嘌呤糖苷鍵而大于嘧啶糖苷鍵，所以RNA酸水解的產(chǎn)物一般是嘌呤堿基和嘧啶核苷酸。酸水解DNA時，一般用甲酸、高氯酸或鹽酸。高氯酸水解時，部分胸腺嘧啶會分解，用鹽酸水解時則腺嘌呤稍有分解。1.水解反應(yīng)水解DNA和RNA生成單核苷酸時，最常用的酶是核酸酶P1（桔青霉5’-磷酸二酯酶）和蛇毒磷酸二酯酶，它們可將DNA和RNA水解成5’-單核苷酸。得到單核苷酸后，如果用磷酸單酯酶或單核苷酸酶進一步水解，就得到相應(yīng)的核苷。（2）酶水解當與磷酸基團相連的β-碳原子上有強烈的吸電子基團存在時，會引起α-碳原子與氧原子之間化學鍵的斷裂，這個反應(yīng)叫β-消除反應(yīng)?；瘜W法測定DNA一級結(jié)構(gòu)時，嘌呤堿基發(fā)生甲基化反應(yīng)后，在中性或酸性條件下堿基脫落處的C1’成為醛基形式。2.β-消除反應(yīng)β-消除反應(yīng)3.肼解反應(yīng)

肼解反應(yīng)也是化學直讀法測定DNA和RNA順序的重要反應(yīng)。肼解反應(yīng)使嘧啶開環(huán)，經(jīng)過一系列中間步驟最后生成糖腙，用哌啶等胺類催化進行β-消除反應(yīng)，被肼解的核苷酸兩邊的磷酸二酯鍵就斷裂?？刂齐陆鈼l件，肼可選擇性地只與胞嘧啶反應(yīng)。肼解反應(yīng)羥胺（NH2OH)可與尿嘧啶和胞嘧啶反應(yīng)，而不與胸腺嘧啶、鳥嘌呤反應(yīng)，與腺嘌呤的反應(yīng)速度比胞嘧啶低2個數(shù)量級。在pH10和90℃高溫條件下，羥胺選擇性地只與尿嘧啶反應(yīng)，而不與胞嘧啶反應(yīng)。4.與羥胺的反應(yīng)與羥胺的反應(yīng)嘌呤和嘧啶堿基上存在有高的電子云密度，這些部位易受到親電試劑的攻擊，發(fā)生取代反應(yīng)。烷化劑和鹵素都是親電試劑。常用的烷化劑是硫酸二甲酯（CH3）2SO4。5.親電取代反應(yīng)親電取代反應(yīng)嘧啶的C5和C6雙鍵可發(fā)生加成反應(yīng)。如尿嘧啶加氫后生成二氫尿嘧啶，一條核酸鏈中相鄰2個嘧啶的C5和C6間也可發(fā)生加成，形成二聚體。胸腺嘧啶形成二聚體的反應(yīng)力最強，尿嘧啶次之，胞嘧啶最小。所以DNA經(jīng)紫外光照射后常形成TT二聚體，這種DNA酸水解的產(chǎn)物中有TT。鳥嘌呤C6和尿嘧啶、胸腺嘧啶C4的-C=O鍵可與碳二亞胺（HN=C=NH)發(fā)生可逆的加成反應(yīng)。6.加成反應(yīng)7.脫氨反應(yīng)

核酸分子中的腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤在pH4.5經(jīng)亞硝酸作用脫氨分別生成尿嘧啶和黃嘌呤。前兩個反應(yīng)會使DNA發(fā)生