黃酮類化合物乳腺癌耐藥蛋白BCRP-PPT報(bào)告

Characterizationof3-methoxyflavonesfortheirinteractionwithABCG2assuggestedbyATPaseactivity研究目的：希望能夠從幾種化合物中找到ABCG2的一些非常有效的，低毒性的黃酮類抑制劑。

研究思路：選出幾種化合物證明有抑制作用

確定這種抑制作用

確定抑制作用類型得出結(jié)論BCRP/ABCG2:BreastCancerResistanceProteinMDCKcellsandMDCKBCRPcellsHoechst33342pheophorbideAHighFive?insectcellsAcMNPV（苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒/桿狀病毒）Fluorescencespectraofcompounds

1–7

andHoechst33342theHoechst33342andpheophorbideAassayAccumulationstudiesbyconfocalmicroscopyAccumulationmeasurementusingamicroplatereaderProteinexpressionininsectcellsSDSgel-electrophoresisandwesternblotanalysisATPaseactivitymeasurementsMTTcytotoxicityassayInhibitionkineticsmethodsFluorescencespectraof3-methoxyflavones1–7andHoechst33342Resultsanddiscussion

InvestigationofselectedcompoundsfortheiraccumulationinABCG2overexpressingcellsMeasurementofaccumulationof3-methoxyflavones.ThefluorescenceofaccumulatedcompoundsinMDCKBCRPandMDCKsensitivecellswasmeasured.Cellswithoutcompoundwereusedasnegativecontrol.(NS:not

significant，*p<0.05,**p<0.01,t-testofsignificance).#Compound6showedverylowfluorescence.ABCG2membranepreparationandATPaseassayCharacterizationofHighFivemembranesfortheoverexpressionofABCG2.

Lane1showspositivecontrolofABCG2,lane2showsmembraneproteinpreparationsofHighFiveinsectcellsinfectedwithABCG2baculovirusandlane3showsnegativecontrolofHighFiveinsectcellmembranepreparationsnotinfectedwithABCG2baculovirus.2.1ABCG2membranepreparation

2.2ATPaseassayATPaseactivityofcompounds1–7measuredusingHighFiveinsectcellmembranes.ATPaseactivityofallcompoundswasmeasuredat25

μMconcentration.Prazosinandquercetin

wereusedaspositivecontrols,whiletheinhibitoryeffectofKo143

wasusedasnegativecontrol.4.Concentrationresponsecurvesforcompound4intheATPaseassay.由以前的文獻(xiàn)可知，底物與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)對(duì)底物有高的親和力，并且是活躍的位點(diǎn)，另一種位點(diǎn)對(duì)底物具有低親和力且是抑制位點(diǎn)。如果兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的親和力是彼此接近的，會(huì)形成一個(gè)鐘形曲線。如果活性結(jié)合位點(diǎn)的親和力比抑制位點(diǎn)的高得多，則會(huì)形成米氏曲線。3.Cellviabilityassay3.1CytotoxicityofselectedtestcompoundsinMDCKcellsClosedtriangle:MDCKBCRPcellsclosedcircle:MDCKsensitivecellsopencircle:dilutionsolvent實(shí)驗(yàn)中所用到的最高濃度是100微摩爾，圖示，在這個(gè)濃度下，敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中都沒有顯示出細(xì)胞活性的顯著下降?？梢姡衔?是低毒性的。3.1CytotoxicityofselectedtestcompoundsinMDCKcells通常，有細(xì)胞毒性的ABCG2底物，對(duì)敏感和耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒性是有差異的。耐藥細(xì)胞會(huì)把底物排出，同時(shí)也就降低了底物對(duì)細(xì)胞的毒性。如果測(cè)試化合物有細(xì)胞毒性，并顯示在耐藥細(xì)胞中比在敏感細(xì)胞中有較低的細(xì)胞毒性，我們可以得出結(jié)論，這些化合物由ABCG2排出，導(dǎo)致更低的細(xì)胞內(nèi)積累和較低的毒性。由于其低毒性，沒有觀察到在敏感和抗性細(xì)胞中細(xì)胞毒性的顯著差異。3.2EffectoftestcompoundsoncytotoxicityofSN-38inABCG2overexpressingcells.ABCG2的毒性底物在過(guò)表達(dá)ABCG2的細(xì)胞中，由于被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白排出，所以毒性會(huì)下降，如果在本身存在ABCG2的細(xì)胞毒性底物時(shí)，再加入化合物4，就可以看出化合物4對(duì)這些底物的耐藥性的影響，或者說(shuō)化合物4是否能逆轉(zhuǎn)底物的耐藥性。實(shí)心方塊：沒有抑制劑的耐藥細(xì)胞；實(shí)心圈：敏感細(xì)胞?？招娜切危簼舛葹?μM的化合物4空心圓：2.2μM。相比于不加化合物4，加入不同濃度的化合物4后，曲線有明顯的左移，且濃度越大，越接近敏感細(xì)胞。化合物4逆轉(zhuǎn)了底物的耐藥性。Now………功能實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示1,3,4,6，這幾個(gè)化合物是ABCG2的良好的抑制劑過(guò)表達(dá)ABCG2的胞內(nèi)聚集實(shí)驗(yàn)表明，這些化合物都可能是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物（除5，但化合物5的抑制作用并不好）酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同樣是說(shuō)明了這幾個(gè)化合物可能是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明這化合物4是低毒的，但同時(shí)卻能降低SN-38的毒性。是底物也是抑制劑。非競(jìng)爭(zhēng)抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)：⑴非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似；⑵底物和抑制劑分別獨(dú)立地與酶的不同部位相結(jié)合；⑶抑制劑對(duì)酶與底物的結(jié)合無(wú)影響，故底物濃度的改變對(duì)抑制程度無(wú)影響；⑷動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值不變，Vm值降低。5.InhibitionkineticsInteractionofcompound4withpheophorbideA.Interactionofcompound4withHoechst33342.

空心圓：對(duì)照組；實(shí)心圓：0.0562μM，空心方塊：0.1μM；實(shí)心正方形：0.178

μM；空心三角：0.316μM；實(shí)心三角形：0.562

μM。空心圓：對(duì)照組；實(shí)心圓：0.1μM；空心方塊：0.316

μM；實(shí)心正方形：0.562

μM；空三角：1.0

μM；實(shí)心三角形：1.78

μM。在這個(gè)研究中，我們使用不同濃度的化合物4，分別作用于赫斯特33342或脫鎂葉綠A。改變底物的濃度，觀察他們之間的作用關(guān)系。由圖可見，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都顯示他們是非競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系。也就是說(shuō)底物的存在并不影響抑制劑的抑制作用，底物和抑制劑作用在不同的位點(diǎn)。1.Fromthecurrentstudy,wecanconcludethatallselectcompoundsexceptcompound5and6seemtobesubstratesofABCG2.Conclusions3.Incellviabilityassay,compound4wasfoundtohavelowtoxicityeveninthehighermicro-molarrangeandwasabletoreversethedrugresistanceforSN-38inABCG2overexpressingcells.Inenzymekineticstudiesofcompound4,wewereabletoshowanon-competitiveinteractionofcompound4towardsHoechst33342aswellastowardspheophorbideA.從這些研究結(jié)果表明盡管3-甲氧基黃酮類化合物是ABCG2的良好