黃酮類化合物乳腺癌耐藥蛋白BCRP-PPT報告

Characterizationof3-methoxyflavonesfortheirinteractionwithABCG2assuggestedbyATPaseactivity研究目的：希望能夠從幾種化合物中找到ABCG2的一些非常有效的，低毒性的黃酮類抑制劑。

研究思路：選出幾種化合物證明有抑制作用

確定這種抑制作用

確定抑制作用類型得出結(jié)論BCRP/ABCG2:BreastCancerResistanceProteinMDCKcellsandMDCKBCRPcellsHoechst33342pheophorbideAHighFive?insectcellsAcMNPV（苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒/桿狀病毒）Fluorescencespectraofcompounds

1–7

andHoechst33342theHoechst33342andpheophorbideAassayAccumulationstudiesbyconfocalmicroscopyAccumulationmeasurementusingamicroplatereaderProteinexpressionininsectcellsSDSgel-electrophoresisandwesternblotanalysisATPaseactivitymeasurementsMTTcytotoxicityassayInhibitionkineticsmethodsFluorescencespectraof3-methoxyflavones1–7andHoechst33342Resultsanddiscussion

InvestigationofselectedcompoundsfortheiraccumulationinABCG2overexpressingcellsMeasurementofaccumulationof3-methoxyflavones.ThefluorescenceofaccumulatedcompoundsinMDCKBCRPandMDCKsensitivecellswasmeasured.Cellswithoutcompoundwereusedasnegativecontrol.(NS:not

significant，*p<0.05,**p<0.01,t-testofsignificance).#Compound6showedverylowfluorescence.ABCG2membranepreparationandATPaseassayCharacterizationofHighFivemembranesfortheoverexpressionofABCG2.

Lane1showspositivecontrolofABCG2,lane2showsmembraneproteinpreparationsofHighFiveinsectcellsinfectedwithABCG2baculovirusandlane3showsnegativecontrolofHighFiveinsectcellmembranepreparationsnotinfectedwithABCG2baculovirus.2.1ABCG2membranepreparation

2.2ATPaseassayATPaseactivityofcompounds1–7measuredusingHighFiveinsectcellmembranes.ATPaseactivityofallcompoundswasmeasuredat25

μMconcentration.Prazosinandquercetin

wereusedaspositivecontrols,whiletheinhibitoryeffectofKo143

wasusedasnegativecontrol.4.Concentrationresponsecurvesforcompound4intheATPaseassay.由以前的文獻可知，底物與轉(zhuǎn)運蛋白有兩個結(jié)合位點，其中一個結(jié)合位點對底物有高的親和力，并且是活躍的位點，另一種位點對底物具有低親和力且是抑制位點。如果兩個結(jié)合位點的親和力是彼此接近的，會形成一個鐘形曲線。如果活性結(jié)合位點的親和力比抑制位點的高得多，則會形成米氏曲線。3.Cellviabilityassay3.1CytotoxicityofselectedtestcompoundsinMDCKcellsClosedtriangle:MDCKBCRPcellsclosedcircle:MDCKsensitivecellsopencircle:dilutionsolvent實驗中所用到的最高濃度是100微摩爾，圖示，在這個濃度下，敏感細胞和耐藥細胞中都沒有顯示出細胞活性的顯著下降?？梢姡衔?是低毒性的。3.1CytotoxicityofselectedtestcompoundsinMDCKcells通常，有細胞毒性的ABCG2底物，對敏感和耐藥細胞的細胞毒性是有差異的。耐藥細胞會把底物排出，同時也就降低了底物對細胞的毒性。如果測試化合物有細胞毒性，并顯示在耐藥細胞中比在敏感細胞中有較低的細胞毒性，我們可以得出結(jié)論，這些化合物由ABCG2排出，導(dǎo)致更低的細胞內(nèi)積累和較低的毒性。由于其低毒性，沒有觀察到在敏感和抗性細胞中細胞毒性的顯著差異。3.2EffectoftestcompoundsoncytotoxicityofSN-38inABCG2overexpressingcells.ABCG2的毒性底物在過表達ABCG2的細胞中，由于被轉(zhuǎn)運蛋白排出，所以毒性會下降，如果在本身存在ABCG2的細胞毒性底物時，再加入化合物4，就可以看出化合物4對這些底物的耐藥性的影響，或者說化合物4是否能逆轉(zhuǎn)底物的耐藥性。實心方塊：沒有抑制劑的耐藥細胞；實心圈：敏感細胞?？招娜切危簼舛葹?μM的化合物4空心圓：2.2μM。相比于不加化合物4，加入不同濃度的化合物4后，曲線有明顯的左移，且濃度越大，越接近敏感細胞?；衔?逆轉(zhuǎn)了底物的耐藥性。Now………功能實驗的結(jié)果顯示1,3,4,6，這幾個化合物是ABCG2的良好的抑制劑過表達ABCG2的胞內(nèi)聚集實驗表明，這些化合物都可能是轉(zhuǎn)運蛋白的底物（除5，但化合物5的抑制作用并不好）酶活性實驗結(jié)果，同樣是說明了這幾個化合物可能是轉(zhuǎn)運蛋白的底物細胞活性實驗，說明這化合物4是低毒的，但同時卻能降低SN-38的毒性。是底物也是抑制劑。非競爭抑制非競爭性抑制的特點：⑴非競爭性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似；⑵底物和抑制劑分別獨立地與酶的不同部位相結(jié)合；⑶抑制劑對酶與底物的結(jié)合無影響，故底物濃度的改變對抑制程度無影響；⑷動力學(xué)參數(shù)：Km值不變，Vm值降低。5.InhibitionkineticsInteractionofcompound4withpheophorbideA.Interactionofcompound4withHoechst33342.

空心圓：對照組；實心圓：0.0562μM，空心方塊：0.1μM；實心正方形：0.178

μM；空心三角：0.316μM；實心三角形：0.562

μM?？招膱A：對照組；實心圓：0.1μM；空心方塊：0.316

μM；實心正方形：0.562

μM；空三角：1.0

μM；實心三角形：1.78

μM。在這個研究中，我們使用不同濃度的化合物4，分別作用于赫斯特33342或脫鎂葉綠A。改變底物的濃度，觀察他們之間的作用關(guān)系。由圖可見，兩個實驗的結(jié)果都顯示他們是非競爭的關(guān)系。也就是說底物的存在并不影響抑制劑的抑制作用，底物和抑制劑作用在不同的位點。1.Fromthecurrentstudy,wecanconcludethatallselectcompoundsexceptcompound5and6seemtobesubstratesofABCG2.Conclusions3.Incellviabilityassay,compound4wasfoundtohavelowtoxicityeveninthehighermicro-molarrangeandwasabletoreversethedrugresistanceforSN-38inABCG2overexpressingcells.Inenzymekineticstudiesofcompound4,wewereabletoshowanon-competitiveinteractionofcompound4towardsHoechst33342aswellastowardspheophorbideA.從這些研究結(jié)果表明盡管3-甲氧基黃酮類化合物是ABCG2的良好