動(dòng)物重要病原菌功能基因組與分子致病機(jī)理研究

項(xiàng)目名稱：動(dòng)物重要病原菌功能基因組與分子致病機(jī)理研究

周銳華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2012.1-2016.8教育部湖北省科技廳一、關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題及研究?jī)?nèi)容（一）擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題病原菌在動(dòng)物和人中的流行與傳播機(jī)制結(jié)核病是全球死亡人數(shù)最高的人類傳染病，主要由結(jié)核分枝桿菌引起，但10％973為人結(jié)核分枝332414162病原菌的蛋白質(zhì)互作與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在后基因組時(shí)代，生命科學(xué)領(lǐng)域的研究人員面臨的問(wèn)題不再僅僅是某個(gè)基提供新的藥物靶標(biāo)和策略。病原菌的致病與免疫逃避的機(jī)制傳染病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸是病原微生物與宿主相互作用的結(jié)果，不同病深入研究的重要基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題。（二）主要研究?jī)?nèi)容以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌等重要?jiǎng)游锊≡鸀檠芯繉?duì)象，綜合運(yùn)用分子流行病學(xué)、現(xiàn)代細(xì)菌學(xué)、分子免疫學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)等研究手段，開展如下研究：進(jìn)一步開展牛結(jié)核、豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病的病原學(xué)與流行病學(xué)研多樣性和抗原多樣性的遺傳基礎(chǔ)。菌的全菌蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)掘與細(xì)菌生長(zhǎng)、代謝、毒力調(diào)控和耐藥相關(guān)的新關(guān)鍵因子和藥物靶標(biāo)。以結(jié)核分枝桿菌、豬鏈球菌等病原菌為研究對(duì)象，進(jìn)行細(xì)菌糖組學(xué)研究，面多糖的合成途徑和生物學(xué)作用，深化對(duì)這兩種病原菌的生長(zhǎng)及感染機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為抗菌藥物開發(fā)新策略提供理論基礎(chǔ)。研究人結(jié)核分枝桿菌對(duì)牛的致病性，鑒定牛分枝桿菌、豬鏈球菌和副豬嗜號(hào)傳導(dǎo)途徑，研究豬鏈球菌與副豬嗜血桿菌的協(xié)同致病作用及其機(jī)制。研究結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中炎性因子的變化及其調(diào)控機(jī)制，牛分亂的機(jī)制。二、預(yù)期目標(biāo)（一）總體目標(biāo)以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌為研究對(duì)象，初步闡明DNA（二）五年預(yù)期目標(biāo)500200（及牛型2000完善和構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌和豬鏈球菌的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄調(diào)損傷修復(fù)與耐藥之間的關(guān)系。Sir2Sir2蛋白與牛分枝桿菌致病性及藥物作用機(jī)理之間的關(guān)聯(lián)性。鑒定結(jié)核分枝桿菌和豬鏈球菌表面多糖及結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁多糖的105種重要表面多糖的組分和結(jié)構(gòu)，明確其在細(xì)菌生長(zhǎng)及致病中的關(guān)鍵作用。初步闡明人結(jié)核分枝桿菌對(duì)牛的致病特征；鑒定豬鏈球菌、副豬嗜血桿208－10協(xié)同致病作用和機(jī)制。發(fā)表SCI50－60/15－205－6100－150三、研究方案（一）總體研究思路、項(xiàng)目研究的技術(shù)路線及可行性分析總體研究思路結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌是嚴(yán)重危害畜牧業(yè)健康發(fā)技術(shù)路線ORF組的克隆及蛋白質(zhì)互作與基因調(diào)控ORF組的克隆及蛋白質(zhì)互作與基因調(diào)控菌株分離鑒定糖基供體合成酶和糖基轉(zhuǎn)移酶基( 因的克隆與功能網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建一)病原菌在動(dòng)物和人中的流行和傳播機(jī)制DNA代謝相關(guān)蛋白相互作用亞網(wǎng)絡(luò)解析研究研究血清型/基因型（二）蛋白質(zhì)互作與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（三）胞外多糖的結(jié)構(gòu)與功能耐藥性代表菌株復(fù)制與損傷修復(fù)及耐藥機(jī)制功能基因和蛋白質(zhì)新藥靶標(biāo)胞外多糖流行環(huán)節(jié)與溯源析致病性豬鏈球菌與副豬嗜血桿菌協(xié)同致病機(jī)制與宿主相互作用及信號(hào)傳導(dǎo)通路結(jié)核病發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中炎性因子變化及調(diào)控牛分枝桿菌的免疫逃避機(jī)制豬鏈球菌誘導(dǎo)炎癥紊亂機(jī)制（四）感染與分子致病機(jī)制 （五）免疫應(yīng)答與免疫逃避機(jī)制可行性分析工作基礎(chǔ)：本項(xiàng)目是在2010年結(jié)題驗(yàn)收的973計(jì)劃重大傳染病基礎(chǔ)研究專（2006-2010的基礎(chǔ)上滾動(dòng)申報(bào)的。已結(jié)題的973973人才隊(duì)伍：本項(xiàng)目的研究隊(duì)伍來(lái)自教育部屬大學(xué)、中科院和中國(guó)農(nóng)科院等優(yōu)勢(shì)單位，結(jié)構(gòu)合理，年富力強(qiáng)，專業(yè)特長(zhǎng)突出，學(xué)科交叉。項(xiàng)目組絕大多數(shù)人973本項(xiàng)目有優(yōu)秀的人才隊(duì)伍保障。技術(shù)平臺(tái)：本項(xiàng)目涉及的關(guān)鍵研究技術(shù)平臺(tái)，包括分子流行病學(xué)、基因組支撐條件：本項(xiàng)目涉及的七個(gè)單位擁有與該申請(qǐng)項(xiàng)目研究領(lǐng)域相關(guān)的4個(gè)31III（二）項(xiàng)目的創(chuàng)新點(diǎn)與特色在我國(guó)，結(jié)核病在動(dòng)物（特別是牛）樣性與抗原多樣性的遺傳基礎(chǔ)，為三種傳染病的防控提供科學(xué)決策依據(jù)。從結(jié)核分枝桿菌和豬鏈球菌的全局性蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和基因調(diào)控網(wǎng)從克隆鑒定參與結(jié)核分枝桿菌和豬鏈球菌的表面多糖合成途徑的重要糖從病原菌及其重要組分（蛋白質(zhì)、表面多糖）與宿主相互作用及其信號(hào)為揭示三種細(xì)菌性傳染病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸機(jī)制提供科學(xué)數(shù)據(jù)。（三）課題設(shè)置課題1、病原菌在動(dòng)物和人中的流行與傳播機(jī)制1．主要研究目標(biāo)揭示結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群在牛和人中的流行規(guī)律與傳播機(jī)制、豬鏈球菌和的遺傳基礎(chǔ)，為這三種傳染病的防治提供理論依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容究人結(jié)核分枝桿菌在牛等動(dòng)物中的流行情況與致病性及牛分枝桿菌在人間的流行情況；通過(guò)流行環(huán)節(jié)和溯源研究，揭示結(jié)核在牛－人間的傳播規(guī)律與機(jī)制。細(xì)菌分離鑒定和保藏：從動(dòng)物和/或人中分離鑒定一批結(jié)核分枝桿菌定，為基因變異和分子流行病學(xué)研究積累材料與資料。病原菌基因變異研究：通過(guò)全基因組重測(cè)序和/或全基因組掃描分析三種病原菌的基因組序列的變異（SNPs、基因缺失和基因重排等，確定變異的基礎(chǔ)。承擔(dān)單位、課題負(fù)責(zé)人和主要學(xué)術(shù)骨干承擔(dān)單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、寧夏大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：郭愛珍主要學(xué)術(shù)骨干：劉思國(guó)、王玉炯、蔡旭旺經(jīng)費(fèi)比例：22％課題2、病原菌的蛋白質(zhì)互作與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)1．主要研究目標(biāo)構(gòu)建或完善結(jié)核分枝桿菌和豬鏈球菌的蛋白質(zhì)相互作用與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，Sir2Sir2關(guān)系。主要研究?jī)?nèi)容DNADNA2牛分枝桿菌蛋白質(zhì)乙?；捌渑c致病性和耐藥性的關(guān)系研究：鑒定牛Sir2Sir2病性及藥物作用機(jī)理之間的關(guān)聯(lián)性。承擔(dān)單位、課題負(fù)責(zé)人和主要學(xué)術(shù)骨干承擔(dān)單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所課題負(fù)責(zé)人：周銳主要學(xué)術(shù)骨干：張華、谷晶、徐卓菲、金卉經(jīng)費(fèi)比例：26％課題3、病原菌表面多糖的結(jié)構(gòu)與功能1．主要研究目標(biāo)以結(jié)核分枝桿菌、豬鏈球菌等病原菌的表面多糖為對(duì)象，通過(guò)對(duì)參與其生疫苗及藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容的基因；合成途徑；菌細(xì)胞表面多糖的生物學(xué)與免疫學(xué)功能；合成病原菌多糖或類似物，分析驗(yàn)證多糖的生物學(xué)作用，進(jìn)行病原菌承擔(dān)單位、課題負(fù)責(zé)人和主要學(xué)術(shù)骨干承擔(dān)單位：中國(guó)科學(xué)院微生物研究所、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、大連醫(yī)科大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：李學(xué)兵主要學(xué)術(shù)骨干：馬郁芳、譚臣經(jīng)費(fèi)比例：16％課題4、病原菌感染與分子致病機(jī)制主要研究目標(biāo)初步闡明人結(jié)核分枝桿菌在牛群中的感染與致病特征；闡明豬鏈球菌和副理?yè)p傷及其機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容毒力因子。染后對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的影響及致病力的變化，研究病原間協(xié)同致病機(jī)制。承擔(dān)單位、課題負(fù)責(zé)人和主要學(xué)術(shù)骨干行病研究所課題負(fù)責(zé)人：陸承平主要學(xué)術(shù)骨干：范紅結(jié)、姜永強(qiáng)經(jīng)費(fèi)比例：16％課題5、病原菌的免疫應(yīng)答與免疫逃避機(jī)制1．主要研究目標(biāo)鑒定結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸過(guò)程的分子標(biāo)識(shí)；初步闡明自噬在牛分枝桿菌感染的先天性免疫和獲得性免疫中的作用及其機(jī)制，揭示牛分枝桿菌免疫逃避以及引起慢性炎癥的機(jī)制；闡明豬鏈球菌引起急性炎癥和導(dǎo)致炎癥紊亂的機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的研究：研究結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程牛分枝桿菌免疫逃避以及引起慢性炎癥的機(jī)制研究：比較研究牛分枝（ROS/siRNA承擔(dān)單位、課題負(fù)責(zé)人和主要學(xué)術(shù)骨干承擔(dān)單位：揚(yáng)州大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：焦新安主要學(xué)術(shù)骨干：金梅林、張安定、貝為成經(jīng)費(fèi)比例：20%（四）各課題間的相互關(guān)系本項(xiàng)目的總體目標(biāo)是：進(jìn)一步闡明動(dòng)物結(jié)核桿菌、豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌的流行特征與傳播機(jī)制，解析三種病原菌的重要基因、蛋白質(zhì)和多糖的結(jié)構(gòu)、功能及其相互作用與調(diào)控網(wǎng)路，深入揭示病原菌的致病機(jī)理和免疫機(jī)理，為這三種傳染病的防控提供必要的科學(xué)理論依據(jù)。51）病原菌在動(dòng)物和人中的流行與傳播機(jī)制（2）（3）病原菌表面多糖的結(jié)構(gòu)與功能（4）（5）病原菌的免疫應(yīng)答與免疫逃避機(jī)制。課題設(shè)置的思路：緊密圍繞細(xì)菌性傳染病的三要素病原菌、宿主和環(huán)境及123454523務(wù)于項(xiàng)目總體目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。病原菌環(huán)境病原菌環(huán)境課題一、病原菌在動(dòng)物和人中的流行與傳播機(jī)制課題二、蛋白質(zhì)互 課題三、胞外多作與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 的結(jié)構(gòu)與功能基因、蛋白質(zhì) 表面多糖課題四、感染與分子致病機(jī)制課題五、免疫應(yīng)答與免疫逃避機(jī)制宿主圖1.課題設(shè)置思路示意圖四、年度計(jì)劃年度

研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo)確定病原菌流行病學(xué)樣品的采對(duì)方案和規(guī)范進(jìn)行示范和調(diào)研；病原菌新毒力相關(guān)基因的發(fā)掘糖鏈合成相關(guān)基因簇,克隆、表達(dá)部分關(guān)鍵基因。結(jié)核分枝桿菌：研究人結(jié)核分第DNAmbSir2；一豬鏈球菌：細(xì)菌雙雜交載體和表達(dá)載體改造及豬鏈球菌ORF年（中篩選可誘導(dǎo)技術(shù)鑒定出病原菌感染過(guò)程差異。

31305050鑒定三種細(xì)菌新毒力相關(guān)基因1058-10關(guān)蛋白；初步完成結(jié)核分枝桿菌代謝蛋白質(zhì)亞網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建；完成mbSir2完成載體改造，豬鏈球菌ORFPCR完成精細(xì)文庫(kù)構(gòu)建；重組表達(dá)個(gè)豬鏈球菌表面蛋白和分泌蛋白；確定豬鏈球菌可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞炎性因子釋放的組份；鑒定在病原菌感染過(guò)程中宿主細(xì)胞內(nèi)磷酸化水平改變蛋白；鑒定一批副豬嗜血桿菌強(qiáng)弱毒發(fā)表SCI6-9項(xiàng)。年 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目度獲得三種細(xì)菌流行病學(xué)樣本，序列變異的分析；構(gòu)建篩選用細(xì)菌雙雜交重組質(zhì)完善結(jié)核分枝桿菌DNA代謝蛋白質(zhì)mbSir2化蛋白及其乙?；稽c(diǎn)的確認(rèn)。第對(duì)結(jié)核分枝桿菌和豬鏈球菌的關(guān)鍵基因進(jìn)行生物化學(xué)分析并測(cè)定3D二基轉(zhuǎn)移酶缺陷株。建立豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌年研究結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸鑒定牛分枝桿菌的免疫應(yīng)答與免疫部分細(xì)菌蛋白為誘餌篩選宿主的相定與豬鏈球菌感染相關(guān)的宿主免疫素分子。

獲得160成分型鑒定；對(duì)所收集菌株進(jìn)行全基>503302000ORF20-30個(gè)表達(dá)純化的豬鏈球菌蛋白質(zhì)；完成DNA2-3DNA基因的酶特性分析；得到關(guān)鍵基因的3D5破血腦屏障的細(xì)胞模型；程中炎性因子的變化規(guī)律；篩選3-5種牛分枝桿菌免疫應(yīng)答或逃逸新蛋50-60SILAC5個(gè)副豬嗜血桿菌毒素分子，表達(dá)純化毒素蛋白；發(fā)表SCI12-152-3年 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目度繼續(xù)獲得三種細(xì)菌流行病學(xué)樣因組序列變異的分析；豬鏈球菌文庫(kù)的雙雜交篩選；表達(dá)及純化結(jié)核分枝桿菌重要（去乙?；；瘜?duì)相關(guān)蛋白質(zhì)功能的影響；第構(gòu)建分枝桿菌和豬鏈球菌關(guān)鍵三桿菌胞壁多糖的結(jié)構(gòu)和豬鏈球菌莢化學(xué)與酶法結(jié)合的合成研究；年（4）毒力因子與宿主細(xì)胞互作及互作的信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究；（5）篩選結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸ThCTL

獲得160成分型鑒定；對(duì)所收集菌株進(jìn)行全基>50320基本完成豬鏈球菌文庫(kù)的雙雜DNA61-2菌突破血腦屏障的機(jī)制；爭(zhēng)取獲得結(jié)核病的分子標(biāo)識(shí)，闡1-2表達(dá)純化全部豬鏈球菌表面蛋白和分51-2發(fā)表SCI12-154-5年 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目度繼續(xù)獲得三種細(xì)菌流行病學(xué)樣因組序列變異的分析；對(duì)鑒定的豬鏈球菌相互作用共現(xiàn)的部分重要互作蛋白進(jìn)行共沉淀系統(tǒng)；完成結(jié)核分枝桿菌重要復(fù)制修復(fù)基因敲除菌株及超量表達(dá)機(jī)理和對(duì)牛分枝桿菌毒力的影響;第分析結(jié)核分枝桿菌和豬鏈球菌糖基轉(zhuǎn)移酶及多糖鏈對(duì)感染過(guò)程的四活性;比較豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌年系統(tǒng)的影響及致病力的變化;比較研究牛分枝桿菌強(qiáng)弱菌株探索自噬在天然免疫和獲得性免疫中與細(xì)菌的相互作用以及這些過(guò)程

獲得150成分型鑒定，同時(shí)獲得基因組的完成300完成豬鏈球菌互作蛋白的基因500系，完成10-15個(gè)互作蛋白的共沉淀和功能分析；得到結(jié)核分枝桿菌DNA復(fù)制修復(fù)基因敲除菌株及超量表達(dá)菌株；建立牛分枝桿菌蛋白質(zhì)乙?；瘜?duì)細(xì)菌耐藥性的關(guān)聯(lián)性及立蛋白質(zhì)乙?；c細(xì)菌毒力的關(guān)聯(lián)性；獲得關(guān)鍵基因及多糖鏈的免疫5-82揭示病原菌在樹突狀細(xì)胞內(nèi)存8-10SCI15-204-5年 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目度建立流行菌株菌種庫(kù)；分析基因組序列的變異與致病性及發(fā)病特DNA復(fù)基因突變菌株在不同生長(zhǎng)條件下的差異表達(dá)分析；繪制豬鏈球菌全局性蛋白質(zhì)相第毒力相關(guān)的新功能基因及蛋白質(zhì)；菌毒力和藥物作用機(jī)理的影響;五研究酶底物類似物（抑制劑）糖鏈或糖鏈類似物的免疫原性;年以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為模型研究結(jié)核分的機(jī)制。研究分枝桿菌等相關(guān)分子在逃項(xiàng)目總結(jié)。

菌株菌種庫(kù)，總結(jié)結(jié)核分枝桿菌、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌在我國(guó)流行的基因型與血清型的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，及結(jié)核菌在人和牛之間的傳播規(guī)律與機(jī)制；DNA復(fù)制修復(fù)基因的功能