轉(zhuǎn)基因動物制備的方法

關(guān)于轉(zhuǎn)基因動物制備的方法第一頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二頁，共四十四頁，2022年，8月28日第三頁，共四十四頁，2022年，8月28日第四頁，共四十四頁，2022年，8月28日第五頁，共四十四頁，2022年，8月28日1轉(zhuǎn)基因動物的概念轉(zhuǎn)基因動物就是指用試驗(yàn)的方法將人們所需要的外源基因?qū)氲絼游矬w內(nèi),使這種外源基因與動物本身的染色體整合在一起,這樣外源基因就能隨著細(xì)胞的分裂而增殖,在動物體內(nèi)得到表達(dá),并且能夠穩(wěn)定遺傳給后代的動物。

第六頁，共四十四頁，2022年，8月28日

轉(zhuǎn)基因動物自產(chǎn)生以來,隨著研究的不斷深入,近些年來得到了迅速的發(fā)展。由于它打破了自然繁殖中的種間隔離,使基因能在種系關(guān)系很遠(yuǎn)的機(jī)體間流動,實(shí)現(xiàn)了動物種間遺傳物質(zhì)的交換與重組,這不僅為遺傳物質(zhì)的研究提供了新的手段,豐富了物種的基因庫,而且擴(kuò)大了生命科學(xué)的視野。第七頁，共四十四頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)基因動物是動物基因工程在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中的突出成果。近十年來，為分子遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、腫瘤研究及優(yōu)良經(jīng)濟(jì)動物的開發(fā)研究等多方面做出了很大的貢獻(xiàn)。第八頁，共四十四頁，2022年，8月28日

Gordon等人首次成功地將含有HSV和SV40DNA片段的重組質(zhì)粒DNA以顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵的雄原核內(nèi)，得到了帶有這種外源DNA順序的TGM。

1982年P(guān)almiter等運(yùn)用此法得到的所謂“超級巨鼠”,曾引起整個(gè)生物學(xué)界的轟動。第九頁，共四十四頁，2022年，8月28日

到目前為止，人類已獲得轉(zhuǎn)基因魚、鼠、羊、豬、兔、牛等大小動物。從轉(zhuǎn)基因動物所獲得的資料幾乎涉及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等的基因研究，還涉及生物藥物的研究，基因治療的開發(fā)研究等。第十頁，共四十四頁，2022年，8月28日2轉(zhuǎn)基因動物的制備方法第十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日2.1顯微注射法也稱原核顯微注射法，是發(fā)展最早、使用最為廣泛的轉(zhuǎn)基因方法之一。利用顯微操作技術(shù)將外源基因直接注射到試驗(yàn)動物的受精卵中，注射的外源基因與胚胎基因組融合，再通過胚胎移植技術(shù)將整合有外源基因的受精卵移植到受體子宮內(nèi)發(fā)育，這樣分娩的動物體內(nèi)的每一個(gè)細(xì)胞都含有外源DNA片段。第十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日第十三頁，共四十四頁，2022年，8月28日第十四頁，共四十四頁，2022年，8月28日

以使用較多的小鼠為例，這一方法的實(shí)驗(yàn)程序如下：

⑴準(zhǔn)備假孕母鼠（養(yǎng)母）⑵受精卵的準(zhǔn)備⑶基因?qū)擘扰咛ヒ浦并蓪τ资蟮蔫b定第十五頁，共四十四頁，2022年，8月28日第十六頁，共四十四頁，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)：

外源DNA大小基本不受限制(1-50kb)

導(dǎo)入過程直觀整合率高

第十七頁，共四十四頁，2022年，8月28日

缺點(diǎn)：

設(shè)備昂貴、環(huán)節(jié)較多對操作人員有較高的技術(shù)要求

低效率（尤其是大家畜）

對卵子傷害大，胚胎存活率低基因整合隨機(jī)性轉(zhuǎn)基因沉默第十八頁，共四十四頁，2022年，8月28日2.2精子載體介導(dǎo)法將精子反復(fù)冷凍或經(jīng)過化學(xué)物質(zhì)處理后與外源DNA共同孵育,從而使外源DNA與精子結(jié)合,然后通過人工授精得到轉(zhuǎn)基因個(gè)體目前國際上極少成功模型，國內(nèi)也很少有相關(guān)報(bào)道，精子載體法很少被應(yīng)用。

第十九頁，共四十四頁，2022年，8月28日體外受精法

&

胞質(zhì)內(nèi)顯微注射法體外受精法是一種直接用精子作為外源DNA載體的轉(zhuǎn)基因方法,其過程是將成熟的精子與外源DNA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),因?yàn)樵谝欢l件下,精子核后帽區(qū)有自發(fā)結(jié)合DNA的能力,因此,精子能夠攜帶外源DNA進(jìn)入受精卵,并使之受精,從而使外源DNA整合到受體染色體中而得到轉(zhuǎn)基因動物。第二十頁，共四十四頁，2022年，8月28日2.3胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法干細(xì)胞（stemcells）：是細(xì)胞譜系分化中最原始的細(xì)胞，能終身自我更新，并具有多分化潛能，能增殖分化為特定的組織細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells,ES）：從著床前的哺乳類胚胎中分離的多能干細(xì)胞，具有在體外不分化的增殖能力，經(jīng)體外長期培養(yǎng)后仍具有分化成3種胚層的發(fā)育潛能。第二十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日通過一定的方法將外源基因?qū)氲紼S,外源基因通過隨機(jī)插入或者同源重組的方式整合到ES基因組中,再以顯微注射法把這種轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞植入正常發(fā)育的囊胚中,然后將囊胚移植到受體動物的子宮內(nèi),由于胚胎干細(xì)胞參與了胚胎生殖系的發(fā)育,所以所產(chǎn)生的嵌合體其生殖細(xì)胞中一部分細(xì)胞含有目的基因,將嵌合體連續(xù)與正常動物進(jìn)行交配,就會得到轉(zhuǎn)基因動物。第二十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二十三頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二十四頁，共四十四頁，2022年，8月28日ES細(xì)胞技術(shù)發(fā)展歷史1956年，Whitten培養(yǎng)成功小鼠的受精卵，在體外發(fā)育成囊胚；1958年，McLaren經(jīng)胚胎移植，體外培養(yǎng)的胚胎產(chǎn)生小鼠個(gè)體；1965年，Brinster建立了胚胎的微滴培養(yǎng)技術(shù)；1968年，Gardner將分離的細(xì)胞注入囊胚，獲得嵌合鼠;1970年，Steven分離成功小鼠的胚胎瘤細(xì)胞；1981年，MartinEvans從正常的小鼠囊胚中分離成功ES細(xì)胞；第二十五頁，共四十四頁，2022年，8月28日1984年，Bradley證實(shí)注射入囊胚的小鼠ES細(xì)胞可分化為成體的各種組織，并整合入生殖系。意義：里程碑，與同源重組技術(shù)的結(jié)合使得在整體水平定向改變和修飾哺乳動物的遺傳特性成為可能。1995年，Thomson從恒河猴中分離了猴的ES細(xì)胞；1998年，Thomson從人的囊胚中分離成功人的ES細(xì)胞；2000年，Bongso等建立了人的ES細(xì)胞株……第二十六頁，共四十四頁，2022年，8月28日

優(yōu)點(diǎn)：外源基因整合情況的可控性高?？深A(yù)先在細(xì)胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性。外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便。第二十七頁，共四十四頁，2022年，8月28日

缺點(diǎn)：

ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易所得個(gè)體為嵌合體第二十八頁，共四十四頁，2022年，8月28日2.4逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒是第一個(gè)用于基因轉(zhuǎn)移的病毒載體。將目的基因整合到逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA載體上,制成高滴度的病毒顆粒,人為感染著床前或著床后的胚胎,RNA病毒感染宿主細(xì)胞后反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的DNA,并在整合酶和其末端特殊核酸序列的作用下整合到宿主細(xì)胞的基因組中進(jìn)行表達(dá)和遺傳得到轉(zhuǎn)基因動物。第二十九頁，共四十四頁，2022年，8月28日

與顯微注射法的比較第三十頁，共四十四頁，2022年，8月28日

優(yōu)點(diǎn)：受精卵攜帶外源基因的陽性率高外源基因多單拷貝整合操作簡單，避免注射法對卵子的損害宿主范圍廣可同時(shí)感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高。第三十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日缺點(diǎn)：

容納大小有限；重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端容易甲基化，影響外源基因的表達(dá)。第三十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日2.5體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因法近年來新出現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)?？寺【d羊“多莉(Dolly)”的誕生是轉(zhuǎn)基因動物史上的一個(gè)里程碑。先把外源基因與供體細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng),使外源基因整合到供體細(xì)胞上,然后將供體細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到去核的卵母細(xì)胞組成重構(gòu)胚胎,再把其移植到假孕母體,待其妊娠、分娩后便可得到轉(zhuǎn)基因的克隆動物。第三十三頁，共四十四頁，2022年，8月28日核移植技術(shù)

該技術(shù)源于用微細(xì)玻璃管對阿米巴原蟲進(jìn)行的核注射1938年，Spemann提出了細(xì)胞核的全能性和將分化的細(xì)胞核移植到卵母細(xì)胞的設(shè)想；1952年，Briggs和King將蛙胚胎細(xì)胞核注射導(dǎo)卵內(nèi)，構(gòu)建的重組胚胎發(fā)育成蝌蚪和蛙；1962年，Gurdon證實(shí)已分化的細(xì)胞核可恢復(fù)其全能性；1969年，開始哺乳動物的核移植研究；第三十四頁，共四十四頁，2022年，8月28日1981年，Illmenser和Hoppe將小鼠胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞核植入去核的受精卵中，克隆出3只小鼠；1986年，Willadsen等用未分化的胚胎細(xì)胞克隆出一只核移植綿羊；1987年，Robl用胚胎細(xì)胞克隆出核移植羊；1997年，Wilmut用成年綿羊的乳腺上皮細(xì)胞為核供體，克隆出綿羊Dolly。第三十五頁，共四十四頁，2022年，8月28日

優(yōu)點(diǎn)：對體細(xì)胞進(jìn)行基因改造后，用于核移植可以提高轉(zhuǎn)基因的效率，不僅具有“ES細(xì)胞途徑”的全部優(yōu)點(diǎn)，且物種適用面廣，無需經(jīng)過嵌合體育種就可獲得純合個(gè)體，周期短，效率高。第三十六頁，共四十四頁，2022年，8月28日

缺點(diǎn)：技術(shù)上難度大，成功率極低，胚胎死亡率高，非一般實(shí)驗(yàn)室可以開展。第三十七頁，共四十四頁，2022年，8月28日2.6人工酵母染色體(YAC)法近年來發(fā)展起來的新型載體,具有克隆百萬堿基對的大片段外源DNA的能力,可以保證巨大基因的完整性。主要途徑有:①胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)入YAC后體外篩選,陽性胚胎干細(xì)胞囊胚腔注射;②YAC原核注射。第三十八頁，共四十四頁，2022年，8月28日

優(yōu)點(diǎn)：保證大片段ＤＮＡ的完整性。

保證較長外源片段在轉(zhuǎn)基因動物研究中的整合率提高。

保證了目的基因上下游的側(cè)翼序列的完整性，因而可以消除或減弱基因整合后的位置效應(yīng)。

第三十九頁，共四十四頁，2022年，8月28日

ＹＡＣ介導(dǎo)法制備轉(zhuǎn)基因動物具有廣闊的應(yīng)用前景。

第四十頁，共四十四頁，2022年，8月28日除上述幾種常用的轉(zhuǎn)基因方法外，人們?yōu)榱诉m應(yīng)于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。例如誘變技術(shù)(P265)等，這些方法都不太成熟，其應(yīng)用也正被人們驗(yàn)證。第四十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日參考文獻(xiàn)[1]耿彩霞,狄冉,儲明星.轉(zhuǎn)基因動物的制備方法及應(yīng)用評述.中國畜牧獸醫(yī),2010,37(6).[2]韓堃,劉東軍.細(xì)胞核移植