蛋白質(zhì)分析法

關(guān)于蛋白質(zhì)分析法第一頁，共二十頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)純化為了研究某一種蛋白質(zhì)，必須首先將該蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來用于分離蛋白質(zhì)的最重要的依據(jù)分子大小電荷疏水性親和性重組技術(shù)第二頁，共二十頁，2022年，8月28日凝膠過濾原理：依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的分離方法第三頁，共二十頁，2022年，8月28日電泳原理：依據(jù)蛋白質(zhì)帶凈電荷量不同從而在電場中移動速度不同而分離開來第四頁，共二十頁，2022年，8月28日親和層析原理：依據(jù)親和性進行分離，如酶與底物、受體與配體和抗原與抗體反應(yīng)。第五頁，共二十頁，2022年，8月28日重組技術(shù)在一個適合的宿主細(xì)胞中過量表達重組蛋白質(zhì)，產(chǎn)量的提高大大簡化純化過程通過在基因的5’或3’端加入6個組氨酸密碼子，形成純化的標(biāo)簽，可進一步加速純化進程，這使得含有固定金屬離子如可與組氨酸結(jié)合的Ni2+的親和柱上標(biāo)簽通常對蛋白質(zhì)的功能沒有什么影響第六頁，共二十頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)測序蛋白質(zhì)在測序之前首先需要經(jīng)過水解，得到小肽，然后用自動蛋白質(zhì)測序儀用Edman降解法測定氨基酸序列第七頁，共二十頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定依據(jù)凝膠過濾層析將樣品蛋白質(zhì)洗脫時間與已知標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫時間相比可給出樣品蛋白的近似分子量SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于確定單個肽鏈的大小質(zhì)譜測定極為精確但上限僅幾kDa且對蛋白質(zhì)是破壞性的第八頁，共二十頁，2022年，8月28日SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量第九頁，共二十頁，2022年，8月28日X-衍射晶體學(xué)和核磁共振X-晶體衍射——X射線可與蛋白質(zhì)中的電子作用得到特有的衍射圖譜，可用于確定晶體中原子的位置第十頁，共二十頁，2022年，8月28日功能分析基于氨基酸一級序列信息，利用計算機輔助方法進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。同源性分析氨基酸序列具有明顯的相似性,這種相似性稱為序列同源性。具有序列同源性的蛋白質(zhì)稱為同源蛋白質(zhì)，同源蛋白共有的相似序列稱為共義序列。

遺傳分析可揭示該蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的作用－某一蛋白質(zhì)的基因可通過突變失活或用重組DNA技術(shù)刪除，進而研究其突變體的表現(xiàn)型，揭示該蛋白質(zhì)的作用第十一頁，共二十頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)折疊蛋白質(zhì)折疊問題被列為“21世紀(jì)的生物物理學(xué)”的重要課題。研究蛋白質(zhì)特定三維空間結(jié)構(gòu)形成的規(guī)律、穩(wěn)定性和與其生物活性的關(guān)系。大家都知道的瘋牛病，它是由一種稱為Prion的蛋白質(zhì)的感染引起的，這種蛋白質(zhì)也可以感染人而引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在正常機體中，Prion是正常神經(jīng)活動所需要的蛋白質(zhì)，而致病Prion與正常Prion的一級結(jié)構(gòu)完全相同，只是空間結(jié)構(gòu)不同。這一疾病的研究涉及到許多生物學(xué)的基本問題。一級結(jié)構(gòu)完全相同的蛋白質(zhì)為什么會有不同的空間結(jié)構(gòu)，這與Anfinsen原理是否矛盾？顯然這里有蛋白質(zhì)的能量和穩(wěn)定性問題。

第十二頁，共二十頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)組學(xué)Proteomicsisthesystematicstudyofalloftheproteinsinacell,tissue,teomicshasbeenusedtoidentifyhundredsofproteinsintheovary,prostate,breast,andesophagusthatincreaseordecreaseascellsbegintogrowabnormally.第十三頁，共二十頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫第十四頁，共二十頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)芯片的定義蛋白質(zhì)芯片,又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)分子作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系。

第十五頁，共二十頁，2022年，8月28日蛋白芯片的分類蛋白質(zhì)微陣列

通過點樣機械裝置制作蛋白質(zhì)芯片，將針尖浸入裝有純化的蛋白質(zhì)溶液的微孔中，然后移至載玻片上微孔板蛋白質(zhì)芯片

利用機械手在96孔的每一個孔的平底上點樣成同樣的四組蛋白質(zhì)，每組36個點(4×36陣列)，含有8種不同抗原和標(biāo)記蛋白?？芍苯邮褂门c之配套的全自動免疫分析儀，測定結(jié)果。適合蛋白質(zhì)的大規(guī)模、多種類的篩選。三維凝膠塊芯片

是在基片上點布以10000個微小聚苯烯酰胺凝膠塊，每個凝膠塊可用于靶DNA、RNA和蛋白質(zhì)的分析。這種芯片可用于篩選抗原抗體、酶動力學(xué)反應(yīng)的研究。該系統(tǒng)的優(yōu)點是：凝膠條的三維化能加進更多的已知樣品，提高檢測的靈敏度；蛋白質(zhì)能夠以天然狀態(tài)分析，可以進行免疫測定、受體、配體研究和蛋白質(zhì)組分分析。第十六頁，共二十頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用用于基因表達的篩選

從人胎兒腦的cDNA文庫中選出92個克隆的粗提物制成蛋白質(zhì)芯片，用特異性的抗體對其進行檢測，結(jié)果的準(zhǔn)確率在87％以上用于特異性抗原抗體的檢測蛋白質(zhì)芯片上的抗原抗體反應(yīng)體現(xiàn)出很好的特異性，在一塊蛋白質(zhì)芯片上10800個點中，根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合可檢測到唯一的1個陽性位點。生化反應(yīng)的檢測

對酶活性的測定一直是臨床生化檢驗中不可缺少的部分，酶作為一種特殊的蛋白質(zhì)，可以用蛋白質(zhì)芯片來研究酶的底物、激活劑、抑制劑等。

第十七頁，共二十頁，2022年，8月28日藥物篩選疾病的發(fā)生發(fā)展與某些蛋白質(zhì)的變化有關(guān)，如果以這些蛋白質(zhì)構(gòu)筑芯片，對眾多候選化學(xué)藥物進行篩選，直接篩選出與靶蛋白作用的化學(xué)藥物，將大大推進藥物的開發(fā)。第十八頁，共二十頁，2022年，8月28日疾病診斷蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著潛在的廣闊應(yīng)用前景。蛋白質(zhì)芯片能夠同時檢測生物樣品中與某種疾病或者環(huán)境因素?fù)p傷可能相關(guān)的全部蛋白質(zhì)的含量情況，即表型指紋