第三章 層析概況

做純化似拂輕塵,制填料如煮小鮮

第三章層析概況2023/2/51層析法或稱色譜法（chromatography）是一種物理或物理化學的分離分析方法。2023/2/52層析方法的分類：柱層析：名稱原理基質或載體吸附層析疏水力和靜電引力硅膠、氧化鋁、羥基磷灰石、活性炭等分配層析、反向分配層析溶解度纖維素、硅藻土、硅膠等反向層析、疏水層析疏水力和靜電引力苯基、辛基、丁基葡聚糖凝膠或C18離子交換層析離子間結合力樹脂、離子型纖維素和葡聚糖凝膠，人造沸石。親和層析親和力帶配基的葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠凝膠過濾層析排阻效應交聯(lián)葡聚糖凝膠和交聯(lián)瓊脂糖凝膠聚焦層析電荷效應及離子間結合力多緩沖離子交換劑高效液相層析隨固定相變化而變化離子交換，親和，凝膠過濾等填料氣相層析與吸附層析和分配層析同吸附劑或有機溶劑液膜2023/2/53薄層層析：紙層析：濾紙分配層析：溶解度，濾紙。名稱原理基質或載體吸附層析疏水力和靜電引力硅膠、氧化鋁等分配層析溶解度纖維素、硅膠、硅藻土離子交換層析離子間結合力各種離子交換劑凝膠過濾層析排阻效應交聯(lián)葡聚糖聚酰胺薄膜層析疏水力和靜電引力聚酰胺2023/2/54一、常用術語：1、固定相：是由層析基質組成?；|包括固體物質（吸附劑、離子交換劑）和液體物質（固定在纖維素或硅膠上的溶液），這些物質能與相關的化合物進行可逆性的吸附、溶解和交換作用。2、流動相：層析過程中推動固定相上的物質向一定方向移動的液體或氣體稱為流動相。在柱層析時，流動相又稱為洗脫劑。在薄層層析時流動相又稱為展層劑。3、層析：以基質為固定相，以液體或氣體為流動相，有效成分和雜質在這兩個相中連續(xù)多次的進行分配、吸附或交換作用，最終使混合物得到分離。4、操作容量：在特定條件下，某種成分與基質反應達到平衡時，存在于基質上的飽和容量，一般以每克（或毫升）基質結合某種成分的毫摩爾數或毫克數開表示。其數值大表示對某成分的結合力強。5、膨脹度：在一定溶液中，單位重量的基質充分溶脹后所占有的體積用Vβ表示。即每克溶脹基質所具有的床體積。一般親水性基質的膨脹度比疏水性的大。第一節(jié)：柱層析2023/2/556、外水體積（Vo）：是基質顆粒之間的體積總和。7、內水體積（Vi）：是基質顆粒內部的體積總和。8、基質體積（Vg）：是基質自身所具有的體積。

Vo、Vi、Vg都是隨著床體積和基質性質變化而變化的。9、床體積（Vt）：通常床體積是指膨脹后的基質在層析柱中所占有的體積（Vt）。Vt是基質的外水體積Vo和內水體積Vi以及自身體積Vg的總合。

Vt=Vo+Vi+Vg10、洗脫體積（Ve）：是指某一組分從柱頂部到底部的洗脫液中出現濃度達到最大值時的流動相體積。11、分配系數和遷移率：分配系數是指一組分在固定相與流動相中含量的比值，常用K表示。而遷移率是指一組分在相同時間內，在固定相移動的距離與流動相移動距離之比值，常用Rf表示。K值越大，表明該組分與固定相的親和力大，遷移率小。K值可以作為定性參數。2023/2/56二、基本原理A+BA+BABBA色譜法的分離原理主要是利用物質在流動相與固定相中的分配系數的差異而被分離。當兩相相對運動時，樣品中各組分將在兩相中多次分配，分配系數大的組分遷移速度慢，反之遷移速度快而被分離。2023/2/57混合組分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應2023/2/58三、色譜參數色譜法中常用的參數包括：定性參數、定量參數、柱效參數、分離參數及相平衡參數等。1、色譜流出曲線：樣品被流動相沖洗，通過色譜柱，留經檢測器所形成的濃度信號隨洗脫時間或洗脫體積而繪制的曲線，稱為色譜流出曲線，即濃度-時間曲線。檢測器（一）色譜流出曲線與色譜峰2023/2/592、基線（baseline）：檢測器中只有流動相通過或雖有樣品的濃度變化而不能被檢測器所檢出時，所給出的流出曲線稱為基線。正常基線：基線的高低反映檢測器的本底高低，基線主要由流動相中所含的雜質等因素決定。噪音（noise；RN）：各種未知的偶然因素引起的基線起伏的現象稱為噪音。噪音的大小用噪音帶的寬度來衡量。漂移（drift；d）：極限隨時間朝某一方向的緩慢變化，稱為漂移。主要由實驗條件不穩(wěn)定引起的。3、色譜峰（peak）或色譜帶（band）：色譜流出曲線上突起的部分稱為色譜峰。正常的色譜峰為對稱形正態(tài)分布曲線，曲線有最高點，以此點的橫坐標為中心，曲線對稱地向兩側快速單調下降。不正常的色譜峰：拖尾峰及前延峰。對稱因子（fs）：正常峰和不正常峰可用對稱因子來衡量，

fs=（B+A）/2A峰高（或峰面積）：用于定量；峰位：用于定性；峰寬：用于衡量柱效。2023/2/510（二）定性參數1、保留時間：保留時間（tR）：從進樣開始到某個組分的色譜峰頂的時間間隔，稱為該組分的保留時間。死時間（t0）不被固定相吸附或溶解的組分的保留時間稱為死時間。調整保留時間：

tR`=tR-t02、保留體積（VR）：又稱洗脫體積。保留體積：流動相攜帶樣品進入色譜柱，由進樣開始，到某個組分在柱后出現濃度極大值時，所需流動相通過色譜柱的體積。死體積：由進樣器到檢測器出口，未被固定相所占有的空間。包括管路，固定相顆粒間隙及檢測器內腔等。死體積大，被分離組分擴散，色譜峰變寬。調整保留體積：扣除死體積后的保留體積稱為調整保留體積。3、比移值（Rf）定時展開：薄層色譜中，一般都采用定時展開：觀察同一展開時間中，組分與展開溶劑的遷移距離。Rf=l/l0定距展開：記錄組分與流動相通過相同距離所需時間的展開方式，成為定距展開。在液相色譜中都采用這種方式。Rf=t0/tR2023/2/511（三）柱效參數色譜柱的柱效通常用理論塔板數或有效塔板數來衡量，而他們取決于區(qū)域寬度。1、區(qū)域寬度標準偏差（δ）：標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中物質的分散程度。δ小，則分散程度小，峰形窄、柱效高。反之，峰形寬，柱效低。半峰寬（W1/2）：色譜峰高一半處的峰寬。峰寬（W）：又稱基線寬度。W=1.699W1/22023/2/512理論塔板數（n）：是衡量柱效的指標。理論塔板數取決于固定相種類、性質（粒度、粒度分布等），填充（或涂布）狀況、柱長（或板長），流動相的流速及測定柱效（或板效）所用物質有關。在液相色譜法中還與流動相的種類性質有關。n=(tR/δ)2;δ=1/2.355×W1/2n=5.54(tR/W1/2)2理論塔板高度（H）：H=L/n2、理論塔板數與理論塔板高度塔板理論是把色譜柱假想為一個精餾塔，塔內存在許多塔板，組分在每個塔板的氣相和液相間進行分配，達成一次分配平衡。然后隨著流動相按一個塔板、一個塔板的方式向前移動。經過多次分配平衡后，分配系數小的組分，先離開蒸餾塔（色譜柱），分配系數大的組分后離開蒸餾塔（色譜柱），從而使分配系數不同的組分彼此得到分離。

2023/2/513范德姆特方程1956年，荷蘭學者范德姆特（VanDeomter）等提出一個描述色譜柱分離過程中復雜因素使色譜峰擴寬而致柱效降低（即：使H增大）影響的方程。此方程經簡化后寫為:

A——渦流擴散項,

反映溶質分子受固定相顆粒障礙改變移動方向，形成渦流引起擴散。與填充顆粒的大小及填充的均勻性有關，而與流動相的流速無關。A越大，色譜峰變寬更嚴重。——

分子擴散項，溶質區(qū)帶前后存在著濃度差，因而產生縱向擴散使區(qū)帶（色譜峰）擴寬，擴散的嚴重與否，關鍵是取決于流動相的線速度。——固定相傳質阻力項——流動相傳質阻力項此兩項對色譜峰的影響均與流速成正比。在流速很高的情況下，由于沒有足夠的時間建立平衡，偏離更為嚴重。U－流動相的平均線速度2023/2/514（四）分離參數1、分離度（resolution，R）：相鄰兩峰分開的距離是平均峰寬[(W1+W2)/2]的幾倍，稱為分離度。①分離效果差，柱效低，選擇性（

）低②完全分離，柱效高，峰窄，選擇性（

）低；③完全分離，選擇性（

）增加，柱效低，峰寬④完全分離，柱效高，選擇性（）好色譜分離中的四種典型情況R=2（l2-l1）/（W1+W2）2023/2/515R越大，相鄰組分分離越好。當R=1.5時，分離程度可達99.7%，因此R=1.5通常用作是否分開的判據。R=1.5R=0.75R=1.0響應信號保留時間t,min2023/2/5162、色譜分離方程

R的定義并未反映影響分離度的各種因素。也就是說，R未與影響其大小的因素：柱效n、選擇因子和保留因子k聯(lián)系起來。

稱為分配系數比（K2/K1）或容量因子比（k2/k1）abca項稱為柱效項，柱效高則a項大。b稱為柱選擇項，c為柱容量項，這兩項相關，受色譜柱性質及流動相性質影響。2023/2/517五、層析柱的制備與層析操作柱層析的設備：層析柱、部分收集器、恒流泵，檢測器流動相檢測器2023/2/5181、填料的選擇：要分離物質的性質2、層析柱的選擇：直徑與柱長的比例：1:10-1:40層析柱的床體積是由要處理樣品的量來決定的。3、填料的用量：一般為待分離樣品的30-50倍。4、裝柱：裝填均勻，松緊一致，沒有氣泡。5、上樣和洗脫：上樣液體積小于床體積的1/2，體積越小越有助于分離效果。洗脫液的流速要恰當控制6、填料的再生：不同基質的再生方法不同。2023/2/519第二節(jié)、薄層層析薄層層析（thinlayerchroomatographyTLC）：是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。根據固定相的種類分類：吸附薄層層析分配薄層層析離子交換薄層層析優(yōu)點：展層時間短15min-60min

設備簡單，操作方便，既適于分析也適于制備影響因素少，結果重現性好顯色方法多樣，靈敏度高。2023/2/520操作及注意事項：1