2023年細(xì)胞工程實驗指導(dǎo)重慶郵電大學(xué)主

細(xì)胞工程實驗指導(dǎo)

目錄TＯＣ＼o"1-3"\ｈ\ｚ\uＨYPERLINＫ實驗室安全守則?ＰAGEREF_Ｔoc\h３ＨYPＥRＬＩNK\l"_Ｔoc"實驗操作須知 PＡGEＲＥＦ_Toc\h5ＨYPＥRＬIＮK\l＂_Ｔoc"實驗一培養(yǎng)基母液的制備 PAＧERＥF_Toｃ\h8ＨＹＰＥＲLＩNK＼l"_Ｔoc"實驗二培養(yǎng)基的配制與滅菌?PAGEＲEF_Toc＼h12HYＰEＲLINK＼l＂＿Toc"實驗三培養(yǎng)材料滅菌和接種 PAGERＥＦ_Toc\h16HＹPERLINK\ｌ"_Ｔoc＂實驗四愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖 ＰＡGERＥF＿Tｏc\h1９ＨＹＰERLINＫ＼l"_Toc"實驗五愈傷組織的分化 PAＧEＲＥＦ_Toc\h２1HYPERLINＫ實驗六植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與同步化 PＡＧERＥＦ_Toｃ\h22ＨYPERLINK\l＂＿Toｃ＂實驗七細(xì)胞微室培養(yǎng) PAGERＥＦ_Ｔｏc\ｈ２3實驗八原生質(zhì)體培養(yǎng) PAGERＥF_Toｃ\ｈ２4HYPＥＲＬINK實驗九煙草原生質(zhì)體融合?PAGERＥF_Tｏc\h26HYＰERLIＮK＼l"_Toｃ"實驗十煙草葉片組織培養(yǎng) PAGEREF_Toｃ\h２8ＨYPEＲＬINK＼ｌ"＿Tｏc"實驗十一月季組織培養(yǎng)?PＡGEREF_Tｏc\ｈ29HＹPEＲLIＮK\l＂_Toc"實驗十二菊花組織培養(yǎng)與快速繁殖?ＰAGEREF＿Toc\ｈ3０HＹPＥＲLINＫ\l"_Toc"實驗十三馬鈴薯莖尖脫毒 ＰＡＧEＲEＦ_Toc\h32HYPＥRＬINK\ｌ"＿Ｔoc＂實驗十四馬鈴薯試管微薯的誘導(dǎo)?PAGERＥF_Toc＼h33ＨYPEＲLＩＮＫ實驗十五小麥幼胚培養(yǎng)?PAGＥＲEF＿Tｏｃ\h３4HYＰEＲLＩNK\l＂_Tｏc"實驗十六小麥成熟胚培養(yǎng)?ＰAGEREF_Toc\h3６HYＰEＲLＩＮＫ\ｌ＂_Tｏc"實驗十七小麥花藥培養(yǎng)?PＡＧEREF_Toｃ＼h3８HYPERLIＮK＼l"_Toｃ＂實驗十八生物反映器中芹菜體胚發(fā)生的大規(guī)模培養(yǎng)?ＰAGEＲＥF_Ｔoc\h39HYＰERLＩＮK\l＂_Ｔoc"實驗十九植物細(xì)胞的生長計量技術(shù) ＼h41HYPＥRＬINＫ實驗二十煙草遺傳轉(zhuǎn)化實驗 PＡGERＥＦ_Tｏc＼h4５HYPERLINK＼l＂_Toc"實驗二十一細(xì)胞原代培養(yǎng)?PAＧEＲEF_Toc\ｈ46HYPＥRLINK\l＂_Toc＂實驗二十二細(xì)胞傳代培養(yǎng) PAＧEREＦ_Ｔoc＼h48HYPERＬIＮK＼l"_Ｔｏc"實驗二十三細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇 PＡGEREF_Toc＼ｈ49ＨＹPERＬINＫ實驗二十五細(xì)胞周期的測定?PＡGEＲEＦ_Tｏc\h52?實驗室安全守則一般規(guī)定１、上課第一天請先熟悉環(huán)境,察看緊急沖洗站、洗眼站、滅火器、急救箱及安全梯等的位置,牢記“安全”是進(jìn)行任何實驗最重要的準(zhǔn)則。2、在實驗室內(nèi)請穿著實驗服，避免穿涼鞋、拖鞋。留有長發(fā)者，戴帽套將頭發(fā)捲入套內(nèi),或以橡皮筋束于后，以防止引火危險或污染實驗。3、在實驗室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙、飲食、化妝、嚼口香糖、嬉戲奔跑,食物飲料勿存放于實驗室的冰箱中,實驗桌上勿堆放書包、書籍、衣服及雜物等。4、所有實驗儀器、耗材、藥品等均屬實驗室所有,不得帶出實驗室。每組分派的儀器、耗材請擬定清點與保管，課程結(jié)束后如數(shù)清點繳回。公用儀器請善加愛惜使用，實驗前后,請把工作區(qū)域清理擦拭，并隨時保持環(huán)境衛(wèi)生。5、實驗前詳閱實驗內(nèi)容,了解實驗細(xì)節(jié)的原理及操作規(guī)程，注意上課所告知的注意事項。實驗進(jìn)行中有任何狀況或疑問,隨時發(fā)問,切勿私自變更實驗程序。打翻任何藥品試劑及器皿時,請隨即清理。實驗后，確牢記下自己的結(jié)果，嚴(yán)禁抄襲,擬定關(guān)閉不用的電源、水、酒精燈及煤氣等。６、睡眠局限性、精神不濟或注意力無法集中,請立即停止實驗。實驗時間若延長,請注意時間的管制及自身的安全,不可自行逗留實驗室過夜。７、實驗完畢，請清理實驗室、倒垃圾、滅菌、關(guān)閉燈光及電源，離開實驗室前記得洗手。8、任何意外事件應(yīng)立即報告師長,并應(yīng)熟知相關(guān)的應(yīng)急措施。藥品1、使用任何藥品,請先看清楚標(biāo)示、注意事項，翻閱物質(zhì)安全資料表,查明是否對人體導(dǎo)致傷害,使用完畢請放回原位。２、新配制的試劑請清楚注明內(nèi)溶物、濃度、注意事事項及配制日期，為避免污染，勿將未用完的藥劑倒回容器內(nèi)。３、揮發(fā)性、腐蝕性、有毒溶劑(如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、鹽酸、硫酸、ｂ-mercaｐｔoethanol、酚等）要在通風(fēng)櫥中戴手套量取配制,取用完后隨即蓋好蓋子，若不小心打翻試劑,立即解決。4、有毒、致癌藥劑例如ａｃrｙlamide（神經(jīng)毒)、eｔhidiumbrｏmide(突變劑）、ＳDS、秋水仙素請戴手套及口罩取用，并勿到處污染,脫下手套后,應(yīng)養(yǎng)成洗手的好習(xí)慣。5、接觸到病原材料或細(xì)菌,應(yīng)迅速消毒。所有被污染的物品，在丟棄或反復(fù)使用前均需先滅菌,固體培養(yǎng)基不得倒入水槽或下水道中。6、使用刻度吸管取物時,切勿用嘴吸取，請用自動吸管或安全吸球。儀器1、使用儀器前先了解其性能、配置及對的操作方法，零件及附件嚴(yán)禁拆卸,勿私自調(diào)整，并注意插座電壓（110V或22０V）之類別。2、使用離心機時,離心管要兩兩對稱、重量平衡，鎖緊離心機轉(zhuǎn)陀。冷凍離心機于開機狀態(tài)時,務(wù)必蓋緊蓋子，以保持離心槽之低溫并避免結(jié)霜。3、實驗時不要用潮濕有汗的手去操作電器，不要用手緊握也許荷電的電器,不應(yīng)以兩手同時觸及電器,電器設(shè)備外殼均應(yīng)接地。萬一不慎發(fā)生觸電事故，應(yīng)立即切斷電源開關(guān),對觸電者采用急救措施。4、使用微波爐加熱時，不可有鋁箔等金屬物品,瓶蓋必須松開，以免爆炸。加熱后戴防熱手套取出瓶子。５、使用UV燈時,不要以眼睛直視ＵV,應(yīng)隔著擋板觀測，完畢立即關(guān)燈。6、超凈工作臺內(nèi)的酒精有機溶劑及易燃物(如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等）要遠(yuǎn)離火苗，不可留置火焰燃燒，萬一著火,應(yīng)力持鎮(zhèn)定，沉著解決。酒精或乙醚等著火時,應(yīng)使用泡沫滅火劑或濕毛巾覆蓋,勿使用水沖洗。7、使用震蕩器震蕩培養(yǎng)時,注意三角瓶務(wù)必對稱放置，并用橡皮筋等夾緊,勿使其搖擺摔出臺面,否則需拆開并清除玻璃碎片與培養(yǎng)液。急救措施1、急性呼吸系統(tǒng)中毒:應(yīng)使中毒者迅速離開現(xiàn)場，移到通風(fēng)良好的地方，呼吸新鮮空氣。如有休克、虛脫或心肺機能不全，必須先作抗休克解決，如人工呼吸、給予氧氣、喝興奮劑(如濃茶,咖啡）等。2、經(jīng)由口服而中毒：需立即用3-5%小蘇打溶液或１:５0０0高錳酸鉀溶液洗胃，洗胃時要大量地喝，邊喝邊使之嘔吐，最簡樸的催吐辦法是用手指或筷子壓舌根，或給中毒者喝少量（1５-25毫升)１%硫酸銅或硫酸鋅溶液（催吐劑)。使之迅速將毒物吐出。洗胃要反復(fù)進(jìn)行多次,直至吐出物中基本無毒物為止。再服解毒劑，一般解毒劑有雞蛋清、牛奶、淀粉糊、桔子汁等。此外有些特殊解毒劑專對某種中毒而用。如磷中毒時用硫酸銅，鋇中毒時用硫酸鈉，氰化物中毒時用硫代硫酸鈉等。3、皮膚、眼、鼻、咽喉受毒物侵害時,應(yīng)立即用大量自來水沖洗,然后送醫(yī)院請各?？漆t(yī)生解決。４、一度燒傷：只損傷表皮，皮膚呈紅斑，微痛，微腫，無水泡。如被化學(xué)藥品燒傷,應(yīng)立即用大量水沖洗，除去殘留在創(chuàng)面上的化學(xué)物質(zhì)，并用冷水浸沐傷處,可減輕疼痛，最后需要消毒,保護(hù)創(chuàng)面不受感染。

5、二度燒傷:損傷表皮及真皮層，皮膚起水泡，疼痛,水腫明顯。創(chuàng)面如污染嚴(yán)重,先用清水或生理鹽水沖洗,再以1:1000新潔爾滅消毒，不要挑破水泡,用消毒紗布輕輕包扎好，請醫(yī)生治療。

6、三度燒傷:損傷皮膚全層，涉及皮下組織,肌肉，骨骼,創(chuàng)面呈灰白色或焦黃色,無水泡,不痛，感覺消失。在送醫(yī)院前,重要防止感染和休克，可用消毒紗布輕輕包扎好，給傷者保暖和供氧,必要時注射嗎啡止痛。７、炸傷:

其急救措施基本同燒傷解決。但炸傷后傷口往往大量出血,應(yīng)立即將傷口上部扎緊,防止流血過多。如發(fā)生昏迷、休克等,應(yīng)進(jìn)行人工呼吸,給氧，并送醫(yī)院治療。8、電擊傷：急救時一方面使觸電者脫離電源，為此可拉下電閘或用木棍將觸電者從電源上撥開。當(dāng)心別把觸電者摔傷。斷開電源后，檢查傷員呼吸和心跳情況,若呼吸停止，立即進(jìn)行人工呼吸。對心跳亦停止者要同時進(jìn)行心臟擠壓。電擊傷比較輕微者，不久能恢復(fù)健康，重者必需請醫(yī)生治療。應(yīng)當(dāng)注意,觸電者在進(jìn)行急救時，一般不要注射強心針和喝興奮劑。?實驗操作須知１、實驗室設(shè)計與規(guī)定實驗室設(shè)計是由工作的目的和規(guī)模決定的，要合理布局，通常按自然工作程序先后安排成一條連續(xù)的生產(chǎn)線,避免有的環(huán)節(jié)倒排增長日后工作的承擔(dān)或引起混亂。房屋可規(guī)劃為洗滌室、滅菌室、配制室、無菌操作室、培養(yǎng)室、鑒定室、馴化移栽室等。1.1準(zhǔn)備室需備有的設(shè)備有:鼓風(fēng)干燥箱、落水架、工作臺、水池、水桶、水盆、試管刷等,重要用于玻璃器皿、用品和培養(yǎng)材料清洗；還需要有高壓水龍頭用于沖洗。１.２滅菌室需備有高壓蒸汽滅菌裝置、細(xì)菌過濾器、用于培養(yǎng)基及培養(yǎng)器械的滅菌。1.3配制室需備有冰箱、化學(xué)實驗臺、藥品柜、器械柜、物品存放架以及各種玻璃器皿和用品，涉及各種不同容積的容量瓶、燒杯、量筒、移液管、三角瓶、磨口瓶、廣口瓶、各種類型培養(yǎng)瓶、玻璃棒、移液管架、試管刷、電爐、微波爐等。1．4無菌操作室(接種室)無菌操作室在工作方便的前提下,宜小不宜大,宜精細(xì)密閉，忌粗陋放散,是植物組織培養(yǎng)研究或生產(chǎn)工作中最關(guān)鍵的部分,關(guān)系到培養(yǎng)物的污染率,接種工作效率等重要指標(biāo)。規(guī)定如下:（1)地面、天花板及四壁盡也許光潔、避免積染灰塵，易于采用各種清潔措施。（2)干爽、安靜、清潔明亮，在適當(dāng)?shù)奈恢玫跹b紫外燈１-2盞，用以經(jīng)常照射滅菌，使室內(nèi)保持良好的無菌、低密度有菌狀態(tài)。(3)最佳安頓一小型空調(diào)機，使室內(nèi)溫度保持在26℃左右,這樣就可以在工作時或不工作時都把工作室的門窗緊閉,保持與外界相對隔絕的狀態(tài),盡量減少與外界的空氣對流,減少塵埃與微生物侵入。（4)經(jīng)常采用消毒措施，達(dá)成較高的無菌水平,以利完全操作提高工作的質(zhì)量與效率。(5)無菌室外應(yīng)留有緩沖間，進(jìn)入無菌室前在此更衣?lián)Q鞋洗手及解決外界采回準(zhǔn)備消毒培養(yǎng)的材料等。無菌操作室應(yīng)備有超凈工作臺或接種箱、固定式載物臺、移動式載物臺、廣口瓶、酒精燈、紗布、器械支架、手術(shù)剪、解剖刀、解剖針、鑷子等。１.5培養(yǎng)室應(yīng)盡量安排在樓層較高處，以利于采光，減少塵埃和雜菌污染的機會。此外應(yīng)考慮清潔、干燥,培養(yǎng)室保溫隔熱。培養(yǎng)室中距離窗戶較遠(yuǎn)處的培養(yǎng)架應(yīng)適當(dāng)安裝人工輔助照明的日光燈。應(yīng)設(shè)計能有效通風(fēng)的窗戶、定期或需要時加強通風(fēng)散熱,如在室內(nèi)地板稍高處設(shè)立進(jìn)風(fēng)氣窗，在氣窗的對側(cè)近天花板設(shè)立排風(fēng)窗，也可安裝小功率的排風(fēng)扇。室內(nèi)應(yīng)備有制冷設(shè)備、加熱設(shè)備、控光設(shè)備、固定式培養(yǎng)架、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)架、搖床等。1．6鑒定室需備有高倍顯微鏡、倒置顯微鏡、相差顯微鏡、解剖鏡、恒溫箱、切片機、烤片臺、恒溫水浴、滴瓶、染色缸、載玻片、蓋玻片等。1．７馴化移植室應(yīng)備有溫室、彌霧裝置、蔭棚、移植床、缽、盆、塑料布、草炭、蛭石、粗沙等，用于試管小植株的鍛煉和移植。2、操作前的準(zhǔn)備工作接種室在接種前4-5d必須通風(fēng)換氣。在接種前一天對接種室進(jìn)行全面消毒,一般用40%福爾馬林進(jìn)行全面噴霧,并密閉２4ｈ,然后打開換氣窗10-15min.。接種前1h打開超凈工作臺和棚面的紫外燈照射3０mｉｎ。殺菌結(jié)束后，先關(guān)掉棚面的紫外燈,再打開風(fēng)機，最后關(guān)掉超凈工作臺上的紫外燈。在接種后體息時，要先打開臺面的紫外燈,再關(guān)風(fēng)機,最后打開棚面紫外燈。不能將風(fēng)機與臺面上的紫外燈同時關(guān)閉或先關(guān)閉風(fēng)機再開紫外燈。不可穿工作服離開接種室,接種期間兩邊的門牢記要關(guān)閉。3、準(zhǔn)備進(jìn)臺進(jìn)入接種室前，應(yīng)先將手表、手鐲、戒子、耳環(huán)等放在室外，將手和手腕用肥皂洗凈后才干進(jìn)入接種室,并用75%酒精紗布擦拭雙手、雙腕(此紗布置于超凈工作臺外燒杯內(nèi),并適時注入酒精）之后換上消毒的工作服、帽子、口罩(蓋上鼻子和嘴、著裝時注意頭發(fā)不得置于帽子外，袖口用皮筋扎緊),進(jìn)入臺內(nèi)。操作前用臺內(nèi)的酒精棉團(tuán)擦拭手、手腕，再擦培養(yǎng)基和超凈工作臺，一般按如下順序擦拭培養(yǎng)瓶：瓶的棉塞、瓶身、瓶底,徹底擦拭后放入超凈工作臺。4、接種操作4.1、剪、鑷消毒每次取出時剪口并攏,不可接觸磨口瓶和其它器皿,并保持尖端向下;剪、鑷分別在酒精燈外焰徹底灼燒,燒時將剪口鑷口張開,燒至剪、鑷上部,火焰熄滅后，插回磨口瓶。4.2、用上述消毒過的器械,將切割好的外植體插植到培養(yǎng)基表面上，具體操作是：(1)左手拿三角瓶，解開包頭紙,將三角瓶幾乎水平拿著，靠近酒精燈焰,將瓶口外部在燈焰上燎數(shù)秒鐘,使瓶口的水氣散發(fā)掉。（2）右手小指和無名指配合手掌將棉塞在燈焰附近慢慢拔出，以免空氣速向瓶內(nèi)沖擊,引起瓶口灰塵等沖入,導(dǎo)致污染。（3)棉塞始終夾在右手兩手指之間，這時再將瓶口在燈焰上旋轉(zhuǎn)，使充足灼燒滅菌。(4)用右手大、食、中指拿鑷子夾一塊外植體送入瓶內(nèi)輕輕的插入培養(yǎng)基中,鑷子灼燒后放回磨口瓶，再把棉塞在燈焰上灼燎數(shù)秒，灼燎時應(yīng)旋轉(zhuǎn)，避免燒壞,塞好棉塞，包上報紙,便完畢了第一瓶的操作,接著再做第二瓶，如此直到外植體所有接完。操作中必須遵守的事項：(1）棉塞不能亂放。手拿的部分限于棉塞膨大的上半部分,塞入瓶口的那一段始終懸空，并不要碰到其它任何物體；若是螺旋蓋或薄膜，則應(yīng)解下放置在滅過菌的臺面上,放置處應(yīng)隨時用酒精棉團(tuán)涂抹滅菌。(2)操作人員的頭、胳膊等不得進(jìn)入臺內(nèi)。（3)操作人員不得隨意談話、說笑,以免導(dǎo)致污染。(4）臺外人員走動要輕、動作要小。（５）接種完畢后注意標(biāo)明接種材料名稱、日期、解決。5、培養(yǎng)器材的清洗在細(xì)胞工程實驗中,離體細(xì)胞對任何毒性物質(zhì)都十分敏感。毒性物質(zhì)涉及解體的微生物和細(xì)胞殘余物以及非營養(yǎng)的化學(xué)物質(zhì)。某些化學(xué)物質(zhì)僅0.01μg／Ｌ就會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,因此對培養(yǎng)器皿的清洗是組織培養(yǎng)中一項極為重要的環(huán)節(jié)。5.1、玻璃器皿浸泡初次使用和培養(yǎng)后的玻璃器皿都需用水浸泡。新用的玻璃器皿，常帶有許多干涸在上面的灰塵，同時又由于生產(chǎn)的因素，常呈堿性并帶有一些對細(xì)胞有毒性的物質(zhì),如鉛和砷等。在使用前要經(jīng)稀鹽酸（５%)浸泡,中和其中的堿性物質(zhì)便于清洗。用過的玻璃器皿往往帶有大量蛋白質(zhì)附著,干涸后不易刷洗掉,故用后要立即用清水浸泡。刷洗浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗滌劑洗去玻璃器皿上的雜質(zhì)。刷洗次數(shù)太多,會損害器皿的表面光潔度,洗滌劑有使pＨ上升的趨勢，所以宜選用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)的洗滌劑。禁用去污粉,因其具有沙粒,會嚴(yán)重破壞玻璃器皿的光潔。酸洗刷洗不掉的極微量雜質(zhì)通過洗液的強氧化作用可被除掉。洗液對玻璃器皿無腐蝕作用，去污十分有效,是清洗過程中最關(guān)鍵的一環(huán)。洗液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和水按一定比例配制而成,浸泡時,器皿要充滿洗液。常用的洗液配方見附表一。沖洗刷洗和洗液浸泡后都必須用水充足沖洗，不留任何殘跡，然后用蒸餾水漂洗2~3次，涼干備用。5.２塑料器皿塑料器皿耐腐蝕能力強，但質(zhì)地較軟，且不耐熱，因此它和玻璃器皿清洗不同。通常的方法是：先用清水充足浸泡和沖洗;再用2％ＮａOＨ溶液浸泡過夜,自來水沖洗,然后用5％稀鹽酸浸泡３0分鐘，再用自來水沖洗,最后用蒸餾水漂洗３次,晾干備用。5.3濾器玻璃濾器與玻璃器皿清洗相同。無論是浸泡還是酸浸，都可用抽濾法。１）

使用后,立即將清水注入濾器,抽氣過濾,反復(fù)抽濾5次。2）

干凈鉻硫酸洗液或熱濃硫酸注入濾器,抽氣過濾至酸液濾過完畢。３）

用清水再次抽濾10次。4）

蒸餾水抽氣過濾３次。蔡氏濾器使用后棄去石棉濾膜，金屬部分刷洗干凈，最后用蒸餾水漂洗2~3次，晾干備用。新購置的膠塞帶有大量滑石粉,先用自來水沖洗干凈，常規(guī)解決，每次用后的膠塞用水浸泡,然后用2％NaＯＨ煮沸1５min左右,自來水沖洗,再用1%稀鹽酸浸泡３0miｎ，最后用自來水沖洗和蒸餾水漂洗,晾干后備用。

?實驗一培養(yǎng)基母液的制備

一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)和掌握培養(yǎng)基母液的配制方法。在配制培養(yǎng)基前,為了使用方便和用量準(zhǔn)確,經(jīng)常將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質(zhì)、激素類分別配制成比培養(yǎng)基配方需要量大若干倍的母液。當(dāng)配制培養(yǎng)基時,只需要按預(yù)先計算好的量吸取母液即可。二、實驗器材電光分析天平（感量為0.00０1g）、扭力天平（感量為0.01g)、臺秤(感量0．5ｇ)、燒杯（５00ml、１0０ml、50mｌ)、容量瓶（１０0０mｌ、100ml、50ml、25ｍl)、細(xì)口瓶（10０0ml、10０ml、5０ml、２５ml)、藥勺、玻璃棒、電爐。三、實驗藥品NH4ＮO3、

ＫＮO３

、CaCl2·2H2O

、

MｇＳO４·７Ｈ2Ｏ、KH2PO4

、

KＩ

、H3BO3

、ＭnＳO4·4Ｈ2O、ZｎＳＯ４·7H2O、Na２MｏO4·2H2O

、ＣuSＯ4·5H2O

、CoCｌ2·6Ｈ2O

、FeSO4·７H2O、Na2-EＤTＡ·２H2Ｏ

、肌醇、煙酸

、

鹽酸吡哆醇(維生素B6)

、鹽酸硫胺素(維生素B1)

、甘氨酸

。

四、實驗環(huán)節(jié)1、大量元素母液的配制各成分按照表1培養(yǎng)基濃度含量擴大10倍，用感量為0.０1g的扭力天平稱取，用蒸餾水分別溶解，按順序逐步混合。后用蒸餾水定容到100０ｍｌ的容量瓶中，即為1０倍的大量元素母液。到入細(xì)口瓶，貼好標(biāo)簽保存于冰箱中。配制培養(yǎng)基時,每配１L培養(yǎng)基取此液100mｌ。表1MS培養(yǎng)基大量元素母液制備序號藥品名稱培養(yǎng)基濃度(ｍg／L）擴大10稱量（mg)

1NH４NO3１65０165００

蒸餾水定容至1000ｍl2KＮO3１９00190003CaCl２·2H2O

4404400４MｇＳO4·7H2O37037005ＫH2PＯ41701700注意:(１)配制大量元素母液時，某些無機成分如Ｃａ2+、ＳO42一、Ｍg２十和H2PO4一等在一起也許發(fā)生化學(xué)反映,產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生,母液配制時要用純度高的重蒸餾水溶解,藥品采用等級較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量重蒸餾水使其充足溶解后才干混合,混合時應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將Ca２+、SO42一、Ｍg2十和H2PO4一等離子錯開混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。(2)CａCl2·2H2O要在最后單獨加入,在溶解CａCl2·2H２O時,蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的CＯ2，以防沉淀。此外,CaCl2·2H2O放入沸水中易沸騰,操作時要防止其溢出。２、微量元素母液的配制MS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機鹽由7種化合物(除Fe?)組成。微量元素用量較少，特別是

CuSO4·５Ｈ2Ｏ、

CｏCｌ2·6Ｈ2O

,因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2,表３配方，用感量為０.000１g的電光分析天平稱量,其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時,每配制1L培養(yǎng)基,取微量Ⅰ10ｍl，微量Ⅱ1ｍl

表２MＳ培養(yǎng)基微量Ⅰ的配制序號化合物名稱培養(yǎng)基濃度（mg/L）擴大１0０倍稱量（mg)1MnSO4·４H2O2２．3２2302ZnSＯ4·7Ｈ２O8.68603H3BＯ３6.２62０4KＩ０.8３８35Na2ＭoＯ4·2H２O02525

表3MS培養(yǎng)基微量Ⅱ的配制序號化合物名稱培養(yǎng)基濃度(ｍｇ／L)擴大10０0倍稱量（mg)１ＣuＳO４·5H2Ｏ

0．0２5252CoCl2·6H2O

0.０2525

注意：使用電子分析天平時注意不要把藥品撒到稱盤上，用完以后，用吸耳球?qū)⑻炱絻?nèi)的臟物清理干凈。3、鐵鹽母液的配制鐵鹽不是都需要單獨配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨配成母液。這種螯合物使用起來方便,又比較穩(wěn)定,不易發(fā)生沉淀。配制方法同上,直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時，配制1L取此液10ml。

表４ＭS鐵鹽母液的配制序號化合物名稱培養(yǎng)基濃度（mg/L）擴大１0０倍稱量（mg）１Na2-EDＴA

37．3373０２FｅSO4·7Ｈ2O

２7.82780

注意:在配制鐵鹽時，假如加熱攪拌時間過短,會導(dǎo)致FｅS04和Nａ2EＤTＡ鰲合不徹底,此時若將其冷藏，F(xiàn)eS04會結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生,配制鐵鹽母液時,ＦｅＳ０４和Na2EＤＴA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色（約加熱20-３０mｉn）,調(diào)pH值至５．5，室溫放置冷卻后，再冷藏。4、有機母液的配制MＳ培養(yǎng)基的有機成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機成分原則上應(yīng)分別單獨配制。配制直接用蒸餾水溶解,注意稱量時用電子分析天平。注意:由于維生素母液營養(yǎng)豐富，因此貯藏時極易染菌。被菌類污染的維生素母液，有效濃度減少，并且易給后期培養(yǎng)導(dǎo)致傷害,不宜再用。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是:配制母液時用無菌重蒸餾水溶解維生素，并貯存在棕色無菌瓶中，或縮短貯藏時間。表5MS培養(yǎng)基有機物質(zhì)母液的制備序號化合物名稱培養(yǎng)基濃度(mg／L)擴大倍數(shù)稱量(mg)配制體積(L）１甘氨酸2500１0００.1２肌醇10020０２０2３0.１3鹽酸硫胺素(VＢ1)0.４1000400.1４鹽酸吡哆素(VB6）０.51000５00.15煙酸0.510０050０．1

５、激素母液配制植物組織培養(yǎng)中使用的激素種類及含量需要根據(jù)不同的研究目的而定。一般激素母液的配制的終濃度以0.５mg／ml為好,需要注意的是:(1)配制生長素類，例如ＩAA、NAA、2.4-D、IBA，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇充足溶解,或者用1mｏl/L的ＮaOＨ溶解,然后用蒸餾水定容到一定的濃度。(2）細(xì)胞分裂素,例如KT,應(yīng)先用少量9５％乙醇或無水乙醇加3~４滴1mol／L的鹽酸溶解,再用蒸餾水定容。(３)配制生物素，用稀氨水溶解,然后定容。注意:所有的母液都應(yīng)保存在0~4℃冰箱中,若母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用。五、思考題：1、

配制母液時為什么要按順序加入各藥品？溶解ＣaCl2·２H2O時,為什么要將蒸餾水加熱?２、

根據(jù)所給母液濃度、蔗糖、瓊脂用量、pＨ值,按給出的培養(yǎng)基配方計算各種母液吸取量，填入下表。培養(yǎng)基配方:MS+KT1.0+BＡ2.0+ＮAA0.2+蔗糖3%+瓊脂0.７%，pH5.８。

表6按上述配方計算各種母液吸取量并填入下表

藥品名稱母液濃度1L培養(yǎng)基母液吸取量０.3L培養(yǎng)基母液吸取量大量元素１0倍液

微量元素Ⅰ100倍液

微量元素Ⅱ1０0０倍液

鐵鹽100倍液

VB10.４mg/mｌ

ＶB60．5mｇ/mｌ

煙酸0.5ｍg/ml

Gly1mg/ml

肌醇20mg/ml

BA０.5mg/mｌ

KT0.5mg/ml

NAA０.5mｇ/ｍｌ

蔗糖

瓊脂

PH值5.8

實驗二培養(yǎng)基的配制與滅菌一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)培養(yǎng)基配制與滅菌的操作方法。對植物外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)時，要依靠培養(yǎng)基提供生長所需的營養(yǎng)成分。不同材料對培養(yǎng)基的規(guī)定不同，適當(dāng)?shù)脑O(shè)計和選用培養(yǎng)基,對植物組織培養(yǎng)取得成功至關(guān)重要的。此外,對組織培養(yǎng)物的脫分化和再分化等狀態(tài)的調(diào)控,次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)等都是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分來實現(xiàn)的。培養(yǎng)基的重要成分涉及無機營養(yǎng)物質(zhì)、碳源、有機物質(zhì)、植物生長物質(zhì)等。二、實驗器材天平、燒杯（1０00ｍl)、醫(yī)用瓷缸(1000ｍl)、三角瓶、量筒（１０0ml)、移液管、玻璃棒、pH試紙、吸耳球、線繩、封口膜、石棉網(wǎng)。三、實驗藥品蔗糖、瓊脂、1moｌ/ＬＮaＯH、ＨCl、各種培養(yǎng)基母液。四、實驗環(huán)節(jié)（一）

培養(yǎng)基配制（以１ＬMS培養(yǎng)基為例）1、計量根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計算需要吸取母液的量，計算公式:吸取量ｍl=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L)×1000ｍl/母液濃度(mｇ/Ｌ）。2、移液取醫(yī)用瓷缸一只,按照計算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用。注意：①在使用提前配制的母液時,應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，假如發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重新進(jìn)行配制。②用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗２次。③量取母液時，最佳將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳?，量?種，劃掉１種,以免犯錯;④移液管不能混用。3、稱取稱取8g瓊脂,３0ｇ蔗糖備用4、融化用搪瓷量杯量取600～７00ml的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂,邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下,加入蔗糖。注意：在加熱瓊脂、制備培養(yǎng)基的過程中，操作者千萬不能離開,否則沸騰的瓊脂外溢,就需要重新稱量、制備。此外，假如沒有搪瓷量杯,可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水,否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢,導(dǎo)致燙傷。5、混合將融化的瓊脂和母液充足混合,用蒸餾水定容到10０0ml，來回混合幾次。６、調(diào)pＨ用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1ｍoｌ／L的ＮaOH或HＣl溶液,逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌,并隨時用精密的pＨ試紙(5.４~7.０)測培養(yǎng)基的pH,一直到培養(yǎng)基的ｐH達(dá)成規(guī)定為止（在調(diào)制時要比目的pH值偏高0.2~0．5個單位，由于培養(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的降解，ｐH值會下降0.2～0．5個單位左右)。注意：調(diào)至?xí)r要用玻璃棒不斷的攪拌,使其充足混合。７、分裝溶化的培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)趁熱分裝。分裝時，先將培養(yǎng)基倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養(yǎng)基倒入錐形瓶(50ml或１00ml)中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1L培養(yǎng)基,可分裝25~30瓶。8、包扎用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子,用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養(yǎng)基的代號。注意:培養(yǎng)基中的部提成分在高溫滅菌時易發(fā)生化學(xué)變化，致使培養(yǎng)基pH值減少，從而使瓊脂凝固力下降,發(fā)生培養(yǎng)基滅菌前凝固,滅菌后不凝固現(xiàn)象。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是：調(diào)整培養(yǎng)基pH值，一般不低于5.6,若需酸性較強培養(yǎng)基，可適當(dāng)增長瓊脂用量。(二)培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基中具有大量的有機物質(zhì),特別含糖量較高,是各種微生物滋生、繁殖的好場合。而接種材料需要在無菌條件下培養(yǎng)很長時間,假如培養(yǎng)基被污染，則達(dá)不到培養(yǎng)的預(yù)期結(jié)果。因此,培養(yǎng)基的滅菌,是植物組織培養(yǎng)中十分重要的環(huán)節(jié)。常用的滅菌方法是高壓滅菌和過濾除菌。1、高壓蒸汽滅菌法把分裝好的培養(yǎng)基及所需滅菌的各種器具、蒸餾水等,放入高壓蒸汽滅菌鍋的消毒桶中，外層鍋內(nèi)加水，水位高度不超過支架高度。蓋好鍋蓋，上好螺絲,注意上螺絲要對角線上。加熱后，鍋上壓力表指針開始移動,當(dāng)指針移至０.5kg/ｃｍ2時,扭開放氣閥排除冷空氣,使壓力表指針回復(fù)零位。當(dāng)指針移至1．1~1.2kg/cm2時,即121℃時，維持一定的時間。由于容器的體積不同,瓶壁的厚度不同,所以滅菌的時間也要適當(dāng)考慮,具體可以參考表１。滅菌后要趁熱取出三角瓶，不可久不放汽,讓壓力鍋自行冷卻,這樣易將棉塞等悶得太濕,引起后來長霉污染。培養(yǎng)基自然冷卻凝固。放置1d后再使用。

表１培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必須的最少時間容器的體積（ｍl）在１21℃下最少滅菌時間（miｎ)20~50１575~1５0２02５0~５0０251０0030１50035202３40注意：（1）鍋內(nèi)冷空氣必須排盡,否則壓力表指針雖達(dá)成一定壓力,但由于鍋內(nèi)冷空氣的存在事實上達(dá)不到應(yīng)有的溫度，因而影響滅菌效果。當(dāng)達(dá)成一定壓力后，注旨在保持壓力過程中，嚴(yán)格遵守滅菌時間,時間過長會使一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞,影響培養(yǎng)基成分,時間短則達(dá)不到滅菌效果。對蒸餾水,各種器具滅菌時,滅菌時間要適當(dāng)延長，壓力也要提高,一般在126℃維持一個小時。此外三角瓶中的液體不超過總體積的70%，否則當(dāng)溫度超過100℃時，培養(yǎng)基會噴溢,導(dǎo)致培養(yǎng)瓶壁和封口膜的污染。(2)消毒后的培養(yǎng)基不能立即用于接種,而應(yīng)放置24-72h。放置后假如培養(yǎng)基中沒有出現(xiàn)菌落，則說明培養(yǎng)基是無菌的，才可以用于接種。此外做好的培養(yǎng)基一般應(yīng)在1－2周內(nèi)用完,短時間可存放于室溫條件，如不能盡快用完，應(yīng)放在4℃條件下。

表２飽和蒸汽壓力與其相應(yīng)的溫度飽和蒸汽壓力ｋg/cm2磅/平方英寸溫度℃飽和蒸汽壓力kg／cm2磅/平方英寸溫度℃0.０01００1．055151２1.00.14１2103．61.1251６１22.０0.2814１06.91.2６618124.１0.44261０9.８１．4０６20１26．00.５6３8112．61.54322127.80.70310115.21.68124１２9.60.8４４121１7.6

30134．50．９８4１４119.９

5０１47.６

2、過濾除菌培養(yǎng)基中某些成分是熱不穩(wěn)定的，在高溫濕熱滅菌中也許會降解。這類物質(zhì)需要進(jìn)行過濾滅菌。例如一些生長因子,如赤霉素（GＡ)、玉米素、脫落酸、尿素和某些維生素是不耐熱的,不能用高壓滅菌解決，通常采用過濾滅菌方法。先將除去了不耐熱物質(zhì)的培養(yǎng)基其它成分經(jīng)高壓滅菌后置于超凈工作臺上冷卻至4０℃，再將過濾滅菌后的該化合物按計劃用量依次加入,搖勻,凝固后即可使用。假如是液體培養(yǎng)基，沒有凝固這個問題,則可在冷卻到室溫后再加入。?

除菌濾膜其孔徑尺寸一般要小于或等于0.4μm。過濾滅菌的原理,是溶液通過濾膜時,細(xì)菌的細(xì)胞和孢子等因大于濾膜孔徑而被阻。濾膜的吸附作用力也不容忽視，往往小于濾膜孔徑的細(xì)菌等亦不能透過。在需要過濾滅菌的液體量大時,常使用抽濾裝置。液量少時可用注射過濾器,它由注射器、濾器(可更換)、持著部分和針管等幾部分組成。注射器不必先經(jīng)高壓滅菌，而后面幾部分要預(yù)先用鋁箔或牛皮紙等包扎好，最佳放在有螺旋蓋的玻璃罐中,經(jīng)高壓滅菌,濾器滅菌不應(yīng)超過121℃。由于這個“注射過濾滅菌器”小巧、方便、實用，在液量多時多用幾套這種裝置(亦可適當(dāng)反復(fù)使用)也能順利完畢液體滅菌操作。在使用前按無菌操作規(guī)定將注射過濾滅菌器的幾個部分裝配在一起，把吸有需要過濾滅菌溶液的注射器插入細(xì)菌過濾器與之相配合的插接口,推壓注射器活塞桿,將溶液壓過濾膜，從針管部分滴出的溶液就是無菌溶液了，但是濾膜不能阻擋病毒粒子通過。在一般情況下，人工配制的溶液不會具有使植物致病的病毒。更嚴(yán)格的實驗研究中，這一點仍不容忽視。毫無疑問,過濾過的溶液要按無菌操作規(guī)定盡快加入培養(yǎng)基中，以免重新遭到污染。假如需通過濾滅菌的溶液帶有沉淀物，那么在過濾滅菌之前可用3號燒結(jié)玻璃濾器預(yù)先予以去除，這樣可以減少細(xì)菌濾膜微孔被堵塞的情況。

實驗三培養(yǎng)材料滅菌和接種一、實驗?zāi)康呐c意義培養(yǎng)材料的滅菌與接種是組織培養(yǎng)過程中一個重要的環(huán)節(jié)。通過本實驗,領(lǐng)略無菌培養(yǎng)對實驗材料消毒,接種的規(guī)定，初步掌握培養(yǎng)材料滅菌，接種的操作技術(shù)。二、實驗器材超凈工作臺、鑷子、解剖刀、酒精燈、脫脂棉、燒杯、廣口瓶、培養(yǎng)皿。三、實驗藥品及材料０.1%升汞、酒精、次氯酸鈉、無菌水、胡蘿卜塊根,綠豆種子、培養(yǎng)基母液。四、實驗環(huán)節(jié)（1)準(zhǔn)備好培養(yǎng)基,無菌水，培養(yǎng)皿及接種工具。（２）將培養(yǎng)基、無菌水、接種工具置于接種臺上，打開超凈臺紫外燈開關(guān),同時打開接種室內(nèi)的紫外燈,用紫外燈照射至少25分鐘，然后關(guān)室內(nèi)的紫外燈,開送風(fēng)開關(guān),關(guān)閉臺內(nèi)的紫外燈,通風(fēng)十分鐘后，再開日光燈進(jìn)行無菌操作。（3)接種前用肥皂洗手，特別是將手指洗凈，然后用沾有75％酒精的棉球把手消毒一次。(4）將綠豆種子在流水下沖洗干凈。（５）將種子放于200ml的廣口瓶中，用７５%的酒精溶液浸泡30s,無菌水沖洗,然后用0．1%升汞溶液（加入吐溫2滴）浸泡３、５、10ｍiｎ，期間不斷搖動溶液，用無菌水洗滌5遍待用。（6)解除三角瓶上捆扎的線繩，有必要的話可以用沾有75％的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下,把三角瓶按培養(yǎng)基解決整齊排列在接種臺左側(cè),然后用７5%酒精擦洗接種臺表面。（7）接種用的鑷子使用前插入９5%的乙醇溶液中，使用鑷子時在酒精燈上燒半晌，冷卻后待用。也可以插入培養(yǎng)基邊沿促使其冷卻。(8)在酒精燈火焰旁揭去封口膜,將瓶口傾斜接近水平方向,用火焰灼燒瓶口,灼燒時應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動瓶口(靠手腕的動作,使試管口沾染的少量菌得以燒死)，左手持瓶,使其靠近火焰，右手將燒過的鑷子觸動培養(yǎng)基部分,使其冷卻,夾取綠豆種子，將其放在培養(yǎng)基上,用鑷子輕輕按一下，使其部分浸入培養(yǎng)基。每瓶可放４-6個外植體。（9）轉(zhuǎn)動瓶口灼燒，將封口膜從酒精燈火焰上過一下,蓋上封口膜,扎好繩子，標(biāo)上接種日期、材料名稱、姓名等。(１0）將接種材料移到培養(yǎng)室培養(yǎng)。注意:（１)從室外取得材料,要用自來水沖洗數(shù)分鐘,對表面不光滑或長有絨毛等結(jié)構(gòu)不容易洗凈的材料,沖洗時間要長，必要時要用毛刷刷洗。(2）外植體消毒劑的選擇要綜合考慮消毒效果、不同材料對滅菌劑的耐受力、滅菌劑的去除等因素,最佳選用兩種消毒劑交替浸泡,初次實驗滅菌時間要設(shè)立一定的時間梯度來擬定最佳的滅菌時間。常用的消毒劑的見表1。（3）工作臺接種時，應(yīng)盡量避免做明顯擾亂氣流的動作(比如說、笑、打噴嚏)，以免影響氣流,導(dǎo)致污染。此外操作過程中要不時用75%的酒精擦拭雙手。（４)接種前培養(yǎng)基出現(xiàn)大量污染現(xiàn)象,若菌類只存在于培養(yǎng)基表面，且重要是真菌時，也許是因培養(yǎng)瓶密封不嚴(yán)或放置培養(yǎng)基的環(huán)境不潔凈,菌類種群密度過大所致。若菌類存在于培養(yǎng)基內(nèi)部，則也許是由使用污染的貯藏母液引起。此外培養(yǎng)瓶不潔凈，滅菌不徹底也是導(dǎo)致接種前培養(yǎng)基污染的因素。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是:保持環(huán)境潔凈，杜絕使用污染的母液，嚴(yán)格高壓蒸汽滅菌程序,保證滅菌時間。（５)接種后培養(yǎng)基出現(xiàn)大面積污染、菌落分布不勻，此種情況重要是接種過程中發(fā)生的污染所致。也許是接種室不潔凈、菌類孢子過多、鑷子帶菌、操作人員手未徹底消毒、操作人員呼吸及超凈工作臺。出現(xiàn)故障等因素引起。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是:保持無菌接種室潔凈，并定期用甲醛等熏蒸滅菌;在接種前無菌室用紫外燈滅菌時間不低于２0-30min;用75%酒精噴霧殺菌降塵,超凈臺啟動1５-20mｉn后方可使用;鑷子等接種工具嚴(yán)格徹底滅菌,且接種時使用1次滅菌1次;操作過程中經(jīng)常用75%酒精等消毒劑擦洗手部等措施。（6）接種后外植體周邊發(fā)生菌類污染也許因外植體表面滅菌不徹底所致。解決方法是:外植體用飽和洗滌劑浸泡10-15ｍiｎ，自來水沖洗０.5-2ｈ后，再選擇適宜的滅菌劑消毒,一般用０.1-０.２%升汞滅菌最佳。對于一些凹凸不平或有茸毛的外植體采用滅菌劑中加“吐溫一80”等濕潤劑的辦法，增長其滲透性，以提高殺菌效果。

表1植物組織培養(yǎng)中常用的消毒劑消毒劑名稱使用濃度(%)消毒難易滅菌時間（ｍｉｎ)消毒效果乙醇70~75易0．1~3好氯化汞0.1～０.２較難2～15最佳漂白粉飽和溶液易5~30很好次氯酸鈣9～１0易5～30很好次氯酸鈉2易5~3０很好過氧化氫10~１2最易5~15好

五、思考題１、接種后污染調(diào)查觀測接種后2~5天的污染情況，填入下表:

觀測日期接種日期接種數(shù)污染數(shù)污染率重要污染菌種

注：污染率（%）＝（污染的外植體數(shù)/總接種外植體數(shù))×1０0%假如培養(yǎng)材料大部分發(fā)生污染，說明消毒劑浸泡的時間短;若接種材料雖然沒有污染,但材料已發(fā)黃，組織變軟，表白消毒時間過長，組織被破壞死亡;接種材料若沒有出現(xiàn)污染，生長正常，即可以認(rèn)為消毒時間適宜。２、外植體用消毒劑消毒后,為什么要用無菌水漂洗?有時候會在消毒溶液中加入1~2滴的表面活性物質(zhì)，例如吐溫８０或吐溫2０，為什么?３．在接種過程中，通過哪些措施來防止細(xì)菌對接種工具，接種材料的污染?4.對外植體表面消毒時為什么常用“兩次消毒法”？

實驗四愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)誘導(dǎo)植物外植體形成愈傷組織的方法。植物生長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)愈傷組織形成的重要因素,對有些植物材料而言,生長素和細(xì)胞分裂素對保持愈傷組織的快速生長是必要的，特別是兩者結(jié)合使用時，能更強烈的刺激愈傷組織的形成。二、實驗器材超凈工作臺、鑷子、解剖刀、酒精燈、棉球、燒杯、廣口瓶、培養(yǎng)皿三、實驗藥品及材料0.1%升汞、酒精、次氯酸鈉、無菌水、胡蘿卜塊根、培養(yǎng)基母液、2，4－Ｄ、水解酪蛋白(CH）。四、實驗環(huán)節(jié)１、培養(yǎng)基配置誘導(dǎo)胡蘿卜愈傷組織的培養(yǎng)基為：MS+2,4－Ｄ1．５ｍg/L+ＣH500mｇ／Ｌ+3%蔗糖＋0．7%瓊脂,pH5.8。愈傷組織增殖培養(yǎng)基:ＭＳ+２，4-D0.５ｍｇ/L+CH500mg/L+3%蔗糖+0．7%瓊脂,pH5．8。2、胡蘿卜營養(yǎng)根的消毒。a．將胡蘿卜塊根在自來水下沖洗干凈，用小刀切去外圍組織。將胡蘿卜切段,每段厚約0.5ｃm。ｂ.把胡蘿卜段用無菌水漂洗干凈。c.用75%的酒精溶液浸泡3０ｓ。ｄ.用0.1%氯化汞浸泡2、5.10.12min,在浸泡過程中用鑷子攪拌，以使消毒充足。e．浸泡過的胡蘿卜段用無菌水沖洗３-５次,洗去殘留的氯化汞后切片。３、解除三角瓶上捆扎的線繩，有必要的話可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培養(yǎng)基解決整齊排列在接種臺左側(cè),然后用７５％酒精擦洗接種臺表面。4、胡蘿卜營養(yǎng)根切片胡蘿卜營養(yǎng)根由外向內(nèi)依次分為皮層、形成層和中軸三部分。在切片消毒之前一方面除去皮層的最外層,以減少胡蘿卜營養(yǎng)根的帶菌量。形成層的分生能力最強，是產(chǎn)生愈傷組織的重要部分，因此在切片時應(yīng)使每一個切片上都有形成層。具體操作方法和環(huán)節(jié)如下:胡蘿卜的截面圖沿圖中豎線切開沿圖中豎線切成一方面沿橫線把胡蘿卜段切開兩邊部分棄去(如圖)切片,每片厚0.５-1ｍm圖—1胡蘿卜營養(yǎng)根切片的制作注意:消毒以后的所有操作過程,都應(yīng)在超凈工作臺上進(jìn)行,操作所用的鑷子、解剖刀和剪刀使用前插入95%乙醇溶液中,使用時在酒精燈火焰上熾燒半晌,冷卻后再切割。5、輕輕打開封口膜，將三角瓶口在火焰上方灼熱滅菌,同時把長鑷子也放在火焰上方灼燒，將燒過的鑷子觸動培養(yǎng)基部分，使其冷卻,以免燒死被接種的外植體，然后將培養(yǎng)皿打開一小縫,用鑷子取出切好的胡蘿卜切片放到培養(yǎng)基表面，用鑷子輕輕向下按一下,使切片部分進(jìn)入培養(yǎng)基。在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)動三角瓶一圈使瓶口灼熱滅菌。然后用封口膜封口,同時在牛皮紙上寫上培養(yǎng)材料、接種日期、姓名等。注意:植物生長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)愈傷組織形成的極為重要的因素，研究具體問題要設(shè)立一定的濃度梯度,以尋找最佳濃度。五.思考題1、觀測接種的外植體在接種１周后產(chǎn)生愈傷組織的顏色和質(zhì)地,計算愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率（％）＝（形成愈傷組織的材料數(shù)/總接種材料數(shù))×1００%２、分析影響愈傷組織誘導(dǎo)和分化的重要因素。

?實驗五愈傷組織的分化一、實驗?zāi)康呐c意義了解愈傷組織再分化原理,學(xué)習(xí)誘導(dǎo)愈傷組織分化的方法。愈傷組織在離體培養(yǎng)過程中，組織和細(xì)胞的潛在發(fā)育能力可以在某種限度上得到表達(dá)，隨著著反復(fù)的細(xì)胞分裂,又開始新的分化。將脫分化的細(xì)胞團(tuán)或組織重新分化而產(chǎn)生出新的具有特定結(jié)構(gòu)和功能的組織或器官的一種現(xiàn)象，稱為再分化。在一定的培養(yǎng)條件下，愈傷組織通過度化可以形成苗或根的分生組織甚至是胚狀體，繼而發(fā)育成完整的植株。二、實驗器材超凈工作臺、鑷子、酒精燈、棉球。三、實驗藥品及材料培養(yǎng)基母液、6-BA、NAＡ、IBA、蔗糖、瓊脂。四、實驗環(huán)節(jié)（1）誘導(dǎo)胡蘿卜愈傷組織(參見實驗四）。(2)配制生芽和生根培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基（生芽）:MＳ+6-BA１mg/Ｌ+ＮＡA０.1mg/L+蔗糖3％+瓊脂０.7%,pH5.8生根培養(yǎng)基:1/2大量元素+MS其它成分+IBA1mg／L+蔗糖3%+瓊脂0.7％,pH5.8(3)按照無菌操作,小心挑取愈傷組織3～5，放置到分化培養(yǎng)基中。注意標(biāo)明接種日期和外植體名稱。(4)放置培養(yǎng)室培養(yǎng),10天后記錄愈傷組織分化情況。五、思考題1．記錄愈傷組織分化率,生根率。分化率（％)＝(生芽愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織總塊數(shù)）×1０0%生根率（%)=（生根愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織總塊數(shù)）×１00％２.愈傷組織發(fā)生不定芽和不定根的能力與哪些因素有關(guān)?

實驗六植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與同步化一、

實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)和掌握植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的常規(guī)方法以及同步化的方法。植物離體細(xì)胞作為生物反映器具有生產(chǎn)周期短、提取簡樸、易規(guī)?；⒉皇芡饨绛h(huán)境干擾，并且產(chǎn)量高、化學(xué)穩(wěn)定性和化學(xué)特性好等特點，運用植物離體細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行有用次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)一直受到研究者們的重視，也有成功的先例。同時,研究發(fā)現(xiàn),離體培養(yǎng)條件下，細(xì)胞系的種類以及培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基的組成、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度對目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有很大的影響。二、實驗器材超凈工作臺、震蕩搖床、各種接種工具、手動吸管泵、尼龍網(wǎng)、移液管、吸耳球、漏斗、離心管、離心機。三、實驗藥品培養(yǎng)基母液、2，4－D、蔗糖、瓊脂。四、實驗環(huán)節(jié)1、

誘導(dǎo)愈傷組織形成（參見實驗四)。2、

制備液體培養(yǎng)基:MS＋2，4－D1mg/L＋蔗糖3%３、

在超凈工作臺上,從形成愈傷組織的培養(yǎng)瓶中,挑取質(zhì)地松弛、生長旺盛的愈傷組織、放入盛有30mｌ液體培養(yǎng)基的三角瓶中，用鑷子輕輕捏碎愈傷組織。每瓶接入約2g重的愈傷組織,置于震蕩搖床固定,在黑暗條件下或弱散射光下100r/mｉn震蕩培養(yǎng)。4、

將胡蘿卜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物搖勻后倒在或滴入孔徑較大的尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)漏斗中（孔徑47μｍ，81μm或更大）。5、

假如網(wǎng)眼被細(xì)胞團(tuán)堵塞，可用吸管反復(fù)吸、吹。６、

再用無菌培養(yǎng)基沖洗殘留在網(wǎng)上的細(xì)胞團(tuán)。7、

反復(fù)環(huán)節(jié)４～6。8、

將通過較大孔徑的細(xì)胞懸浮液，再通過較細(xì)孔徑的尼龍網(wǎng)過濾(如3１μm,26μｍ)，用吸管反復(fù)吸、吹。9、

通過度級過濾的“同步化”細(xì)胞離心(50g,５分鐘),收集后加入液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)或進(jìn)一步同步化。五、思考題1、

研究細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的意義何在?挑選愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)需注意什么問題?2、

建立細(xì)胞懸浮系的環(huán)節(jié)涉及哪些？一個良好的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系應(yīng)當(dāng)具有什么樣的特性？

?實驗七細(xì)胞微室培養(yǎng)一、實驗?zāi)康呐c意義了解和掌握細(xì)胞微室培養(yǎng)的方法。微室培養(yǎng)是為了進(jìn)行單細(xì)胞活體連續(xù)觀測而建立的一種微量細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。運用這種技術(shù)可以對單細(xì)胞的生長與分化、細(xì)胞分裂的全過程、胞質(zhì)環(huán)流的規(guī)律,以及線粒體的生長與分裂進(jìn)行活體連續(xù)觀測;也可以對原生質(zhì)體融合、壁的再生，以及融合后的分裂進(jìn)行活體連續(xù)觀測,因此它是進(jìn)行細(xì)胞工程研究的有用技術(shù)。二、實驗器材超凈工作臺、載玻片、蓋玻片、酒精燈、移液管、吸耳球、毛細(xì)管、常規(guī)接種工具。三、實驗藥品培養(yǎng)基母液、2，４-Ｄ、水解酪蛋白(CH）、蔗糖、瓊脂、HCl、NaOＨ、四環(huán)素眼膏。四、實驗環(huán)節(jié)1、愈傷組織的誘導(dǎo)（參照實驗四）。２、單細(xì)胞懸浮液的置備（參見實驗六)。3、

將洗凈的蓋玻片與載玻片在酒精燈火焰上滅菌。４、

冷卻后按蓋玻片的大小在載玻片上涂一圈四環(huán)素眼膏。5、

將制得的細(xì)胞懸浮液一小滴滴在載玻片上，在四環(huán)素眼膏上放一小段毛細(xì)管，蓋上蓋玻片。6、

輕壓到密封并使細(xì)胞懸浮液的小滴與蓋玻片接觸。7、

將載玻片放入培養(yǎng)室中，在溫度為26－28℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。８、

運用相差顯微鏡進(jìn)行觀測。五、思考題微室培養(yǎng)中應(yīng)注意哪些問題？(從對微室的規(guī)定、培養(yǎng)基的規(guī)定、所觀測的細(xì)胞的規(guī)定三方面考慮)。

?實驗八原生質(zhì)體培養(yǎng)一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)原生質(zhì)體制備和培養(yǎng)的方法。原生質(zhì)體分離純化后,在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上應(yīng)用合適的培養(yǎng)方法,可以再生細(xì)胞壁,并啟動細(xì)胞連續(xù)分裂,直至形成細(xì)胞團(tuán)、長成愈傷組織或胚狀體、分化和發(fā)育成苗，最終再生成完整植株。以黃化綠豆下胚軸彎溝分離原生質(zhì)體，該部位細(xì)胞具有較強的分裂能力，分化的限度不高,分離的原生質(zhì)體經(jīng)培養(yǎng)后很容易分裂。二、實驗器材超凈工作臺、震蕩搖床、各種接種工具、微孔濾膜過濾器三、實驗藥品ＭS培養(yǎng)基各種母液、NＡA、６-BA、2，4-D、2-N-嗎啉乙磺酸(MES）、纖維素酶(OｎozukaR-１0，Jａpaｎ)、崩潰酶（Ｄｒｉselase)、果膠酶（Ｐｅcｔinase、Ｓerｖa)、半纖維素酶(Hemicellulaｓe，Sigｍａ)、離析酶(MacerozymeR－１０）、CａCl2．２Ｈ2O、ＫH2PＯ4.Ｈ２O、ＫN0３、MgＳ04．7H2０KI、CUS０4.5H２O、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、瓊脂。四、實驗環(huán)節(jié)１、培養(yǎng)基及試劑的配制綠豆原生質(zhì)體培養(yǎng)基:MＳ+2,４-D0.２+NAA1+BA0．5+蔗糖2５0mｇ／L+葡萄糖１0000ｍg/L+(瓊脂１.2%)ＣPW溶液:KH2P0４27．2mg/Ｌ,ＫN0３１01mｇ/Ｌ,CaCl2．2H2014８0mg／L,MgS0４.7H20２4０ｍｇ/L,KI0．16ｍg／Ｌ,CｕS04.5H2００.０２5mg/L，ｐH５.6)。綠豆質(zhì)壁分離液ＣPW－1３M的配制：具有13%甘露醇的CPW溶液綠豆細(xì)胞壁酶解液:2%（W/V）纖維素酶(celluｌaseＯｎzukaR－1０)、1%（Ｗ/V)半纖維素酶（hｅmicellｕlaｓeＨ-２12５,0.026uｎit/mg)、0.5%(W／V）果膠酶（pectｉnase,0.15unit/mg)、0.5％離析酶（MacerｏzyｍeR-１0)的CPW-9M(具有９%甘露醇，5ｍmｏl/LMES的CPＷ溶液,ｐH５.2)液。洗滌液:含或不含２50μｍol/LCaCl2,含５mｍol/LMES的９%甘露醇溶液，ｐH6．0。2、無菌黃化下胚軸的獲得經(jīng)挑選的綠豆種子用70％乙醇表面消毒１min,0.１％升汞消毒８mｉn,無菌水沖洗3遍。播于培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)瓶中放入無菌濾紙，加入適量無菌水,以保持合適水分，27士1℃黑暗培養(yǎng)64ｈ。３、酶解選取下胚軸長3.5－4cm的黃化綠豆幼苗，從彎鉤下3ｍｍ處，向下切取0.5mｍ的切片10個。置于CPＷ-13M溶液中,靜置1h，使之質(zhì)壁分離,而后移入酶解液中，在往復(fù)式搖床(3５-４0r/miｎ,25士1℃)上暗中酶解５-6ｈ。材料和酶解液的體積大約1:10。4、純化用雙層尼龍濾網(wǎng)(孔徑6４um)過濾酶解液,濾液10０×g離心10mｉn，棄去上清液。用少量CPW－9Ｍ溶解沉淀,小心加入盛有CＰW－21S（具有２1%蔗糖的CＰＷ溶液,pH5-6)溶液的離心管中，1００×ｇ離心5min，溶液分為3層，仔細(xì)將漂浮在溶液中部的原生質(zhì)體取出，經(jīng)洗滌液洗滌2次，離心，獲得純凈的、具有生理活性的原生質(zhì)體。5、密度測定與調(diào)整將原生質(zhì)體溶解在培養(yǎng)液中,用血細(xì)胞計數(shù)板記數(shù)。６、培養(yǎng)用融化的培養(yǎng)基將原生質(zhì)體密度調(diào)整為5×105/mＬ，將其植板于培養(yǎng)皿中,使成一薄層,凝固后，切成4個扇形快,加入液體培養(yǎng)基，使扇形塊漂浮其中,置于27士1℃黑暗培養(yǎng),培養(yǎng)７、14、2１d，除去舊液，加入新培養(yǎng)基（蔗糖含量為2０mg/Ｌ，葡萄糖１0g/L,其他成分與MS相同。培養(yǎng)一周后能見到幾個細(xì)胞以上的細(xì)胞團(tuán)。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)形成愈傷組織。五、思考題原生質(zhì)體制備與培養(yǎng)過程中要注意哪些問題？常用的原生質(zhì)體培養(yǎng)方法有哪些？

實驗九煙草原生質(zhì)體融合一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)和掌握運用化學(xué)誘導(dǎo)劑誘發(fā)原生質(zhì)體融合的方法。種間有性雜交不親和大大限制了野生種有用基因向栽培作物的轉(zhuǎn)移。通過原生質(zhì)體或亞原生質(zhì)體間的融合進(jìn)行細(xì)胞雜交或細(xì)胞重建，是克服這種生殖隔離的一種重要途徑。現(xiàn)有的融合技術(shù)中,以聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)融合和電融合兩者占重要地位，其中PEＧ融合技術(shù)具有設(shè)備簡樸、操作方便等優(yōu)點，至今仍然廣泛采用。但現(xiàn)行ＰEG融合技術(shù)是在原生質(zhì)體群體的條件下進(jìn)行的,因而在融合產(chǎn)物中除了所欲獲得的雜種細(xì)胞外，還不可避免地具有未融合的原生質(zhì)體、一方親本原生質(zhì)體之間的融合體以及多個原生質(zhì)體的融合體，從而增長了融合后篩選的困難。此外，在有些情況下，可供融合的親本原生質(zhì)體數(shù)量很少，因此在方法選用上要充足考慮這些因素。二、實驗器材超凈工作臺、震蕩搖床、各種接種工具、微孔濾膜過濾器、Parafilm封口膜。三、實驗藥品MS培養(yǎng)基各種母液、KT、NAA、２,4-Ｄ、MES（2-Ｎ-嗎啉乙磺酸)、纖維素酶(OｎozukaＲ-１0,Ｊaｐaｎ)、崩潰酶(Ｄｒｉｓeｌasｅ)、果膠酶（Peｃtiｎase、Serva）、半纖維素酶(Ｈｅｍiｃeｌlulａsｅ,Sｉgma）、離析酶(MaｃerozymeR－10）、CaＣl2．２H2O、ＫH2PO４．H2O、KN03、MgS0４.７Ｈ20KI、ＣuS0４.5Ｈ2Ｏ、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、瓊脂、聚乙二醇、二甲基亞砜。四、實驗環(huán)節(jié)1、實驗材料實驗材料為普通煙草品種“自來紅”和波緣煙草。種子在７０％酒精中浸泡３0s,無菌水沖洗一次后,用０．1％升汞消毒8min,無菌水沖洗六遍，培養(yǎng)于MS基本培養(yǎng)基上。于25℃下誘發(fā)無菌苗。將叢生芽在相同培養(yǎng)基上每4-5周轉(zhuǎn)接一次。取普通煙草完全伸展葉片(約3×５cm)作為分離原生質(zhì)體的材料。對于波緣煙草，以葉片外植體在MS培養(yǎng)基(附加2，4－Dｌmｇ/L，NＡA２mｇ/L,KＴ0.5mg/L）誘導(dǎo)的愈傷組織為分離原生質(zhì)體的材料。2、原生質(zhì)體的分離撕去下表皮，在無菌培養(yǎng)皿中將普通煙草葉片切成約０.５×0.5cm小塊，和波緣煙草愈傷組織各約1g鮮重分別置于l0ml酶液（2%纖維素酶celｌulasｅＯｎzukａＲ-１0、１%半纖維素酶hemiｃelluｌａｓeＨ－21２5,、0.5%果膠酶ｐecｔinase、0.５%離析酶MaｃerozymeＲ-10的CPW-９M液）中。在2８℃下解決3-4h。葉片材料不時輕輕搖動，愈傷組織則在搖床上振搖(３0rpm)。酶解產(chǎn)物經(jīng)400目尼龍網(wǎng)過濾后，100g離心３miｎ收集原生質(zhì)體。然后用洗液(CPＷ鹽+９%甘露醇)洗３次(１０0ｇ,離心1mｉn)。小心加入盛有CPＷ－２１Ｓ(具有2１%蔗糖的ＣPＷ溶液，pＨ５-6)溶液的離心管中，100g離心５min，溶液分為3層，仔細(xì)將漂浮在溶液中部的原生質(zhì)體取出，經(jīng)洗滌液洗滌2次，離心，獲得純凈的、具有生理活性的原生質(zhì)體。用洗滌液將原生質(zhì)體密度調(diào)整到1~５×105個細(xì)胞/mｌ，待用。3、原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合采用PEG和高Ｃａ２+、高pH法。將雙親原生質(zhì)體等量混合后，室溫將2滴原生質(zhì)體懸液滴在置于直徑5ｃm培養(yǎng)皿中的2５×25mm蓋玻片上。靜置２0ｍin后從液滴邊沿加人1滴溶液A(含分子量6000的PEG4０%,葡萄糖0.3mｏ1／L,CaCｌ2６6mmo1/L,二甲基亞砜１0％)。再靜置20min后,將溶液盡也許吸出并加入盡也許多（但不使溶液流下蓋玻片)的KM培養(yǎng)基。10ｍｉn后換以適量新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)皿用Pａrａfiｌm封口后置于2５℃散射光條件下培養(yǎng)。10天后將原培養(yǎng)基吸掉一半,換以等量的滲透壓減半的新鮮培養(yǎng)基。４、芽分化待形成肉眼可見愈傷組織時將其逐個挑出建立源自單個細(xì)胞的克隆系。芽分化培養(yǎng)基為ＭＳ培養(yǎng)基附加BA2mｇ/L,ＩAA0．5mｇ/L,CH20０mｇ/L,甘露醇20ｇ/Ｌ，蔗糖3０ｇ/L，瓊脂8g/Ｌ,pH5．8。5、生根芽長至3-5ｃm時轉(zhuǎn)至ＭS基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。五、思考題查閱相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計一組實驗方案來鑒定所得的愈傷或植株是真正的融合體。?實驗十煙草葉片組織培養(yǎng)一、實驗?zāi)康呐c意義掌握運用葉片作為外植體進(jìn)行無性繁殖的方法。煙草是重要的經(jīng)濟作物和工業(yè)原料作物,其體內(nèi)所含的煙堿等生物堿是非常寶貴的醫(yī)藥及化工原料，最近證實可運用煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物獲得細(xì)胞分裂素類物質(zhì)。有關(guān)煙草的組織培養(yǎng)體系的建立報道很多，運用本實驗建立的煙草組培快繁體系，可認(rèn)為運用農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化來改良煙草品種和運用煙草細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行煙堿等次生物質(zhì)的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。二、實驗器材超凈工作臺、鑷子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿、解剖刀。三、實驗藥品MS培養(yǎng)基各種母液、2，４-Ｄ、KT、6－BA、NAＡ、ＩＡA、蔗糖、瓊脂、酒精、升汞。四、實驗環(huán)節(jié)1、培養(yǎng)基的配制①愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:ＭS+2,4-D1.0mｇ/L(單位下同)＋NAA2.０＋KT０.5。②愈傷組織分化培養(yǎng)基：MＳ＋KT２．0+IＡA０.5。③幼芽增殖培養(yǎng)基:MＳ＋6-BＡ1.0+ＮAA0．2。④生根培養(yǎng)基：MＳ+NAＡ0.２。上述培養(yǎng)基均附加3％蔗糖，0.8%瓊脂,pH5.8。２、接種取煙草幼嫩葉片用自來水充足洗凈后，經(jīng)7５%酒精消毒３0s,0.1%升汞溶液浸泡８mｉn，無菌水沖洗5-6次后，去掉主葉脈和大的側(cè)葉脈，將葉片切成1.0-1.５cｍ2的小方塊,接入①中培養(yǎng),接種時下表皮與培養(yǎng)基接觸。培養(yǎng)溫度25士2℃，光照１４h/d，光照強度2０23ｌx。每三角瓶接種3-５個外植體。３、愈傷誘導(dǎo)約2-3ｄ后，葉片外植體卷曲、增厚、膨脹,１5d后外植體脫分化形成疏松絮狀淺黃綠色的愈傷組織。４、愈傷組織的分化將愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基②上，15d后,從疏松愈傷組織上分化出許多淺黃綠色芽點。4０ｄ后，從愈傷組織上分化出越來越多幼芽。５、幼芽的增殖將幼芽切下,轉(zhuǎn)接至不加２,4-D的幼芽增殖培養(yǎng)基③上,可不斷增殖，發(fā)育成綠色健壯的小苗。６、誘導(dǎo)生根及移栽取約3-4ｃm長的無根小苗接種于生根培養(yǎng)基④中，約7－8d后，外植體從其基部產(chǎn)生白色幼根，當(dāng)試管苗長至5-６cm高時,打開瓶口,在散射光下放置２d后取出，洗去根部殘留培養(yǎng)基，種植于通過消毒的珍珠巖、泥炭土和菜園土等量混合的基質(zhì)中,成活率可達(dá)95%以上。五、思考題以煙草為材料,查閱相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計煙草遺傳轉(zhuǎn)化實驗（運用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法)。

實驗十一月季組織培養(yǎng)一、實驗?zāi)康呐c意義掌握運用莖段作為外植體進(jìn)行無性繁殖的方法月季屬薔薇科，在欣賞植物中占有重要地位。根據(jù)其栽培技術(shù)的規(guī)定,以往的傳統(tǒng)方法，多采用野薔薇種子播種,在2-3年生的實生苗上嫁接,此法不僅繁殖系數(shù)小，且成本較高,生長緩慢,而組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，使得月季育苗發(fā)展迅速。二、實驗器材超凈工作臺、鑷子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿、解剖刀。三、實驗藥品MＳ培養(yǎng)基各種母液，6-BA、NAＡ、IＡＡ、蔗糖、瓊脂、酒精、升汞。四、實驗環(huán)節(jié)1、培養(yǎng)基的配制增殖培養(yǎng)基：ＭS+６-BA１．5+NAA0．１+蔗糖3%+瓊脂0.7%生根培養(yǎng)基:１/2MS+IBA０．5＋蔗糖３%＋瓊脂0.6%２、外植體的獲得選用嫩莖為材料，取帶芽的莖段,一般以頂端以下第３-1０節(jié)上的芽為好,采回枝條剪去葉柄,再剝?nèi)ジ皆谇o上的皮刺，先用自來水沖洗枝條表面的塵土,然后把枝條段截成2-３cm小段，每段帶１-2個側(cè)芽，用70%酒精滅菌20s,再用０．1％氯化汞溶液浸泡10min，再用無菌水沖洗4－５次。3、接種將滅好菌的材料在無菌培養(yǎng)皿中切成０.5cｍ的小段，接種到滅好菌的培養(yǎng)基上。4、培養(yǎng)培養(yǎng)溫度２4℃－２6℃，光照時間８-10h,光照強度1２０２3x。5、分芽繼代將叢生芽分割繼代。6、生根培養(yǎng)選取苗長2cm以上的壯苗作為生根材料，接種到生根培養(yǎng)基上，一般在接種后一周開始觀測，約1０d后發(fā)現(xiàn)有少量苗生根，20d后即可移栽。7、移栽．將培養(yǎng)有試管苗的三角燒瓶打開，在溫室中煉苗2d,然后取出洗去根部瓊脂,移至盛有珍珠巖與細(xì)沙(1:1)的花缽中，天天澆營養(yǎng)液，移栽成活率可達(dá)80%以上。五、思考題查閱相關(guān)文獻(xiàn),設(shè)計篩選月季芽增殖體系建立的最佳激素組合。

?實驗十二菊花組織培養(yǎng)與快速繁殖一、實驗?zāi)康呐c意義掌握運用莖尖作為外植體進(jìn)行無性繁殖的方法。菊花是數(shù)年生宿根花卉，原產(chǎn)我國，是世界上栽培面積較大的花卉,其品種多達(dá)約2500０種，我國的菊花品種也有7000種以上，是人們非常喜歡的一種常見花卉。在栽培過程中,菊花的繁殖多采用扦插法，但該法會導(dǎo)致優(yōu)良品種的品質(zhì)退化,究其因素,在于繁殖及栽種過程中感染了病毒，且病情隨種植時間的延長而惡化，解決此問題的最佳途徑是莖尖培養(yǎng)。二、實驗器材超凈工作臺、鑷子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿、解剖刀、解剖針、解剖鏡。三、實驗藥品MＳ培養(yǎng)基各種母液,6-BA、NAA、蔗糖、瓊脂、酒精、升汞。四、實驗環(huán)節(jié)1、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同激素構(gòu)成的．其中，①誘導(dǎo)側(cè)芽生長培養(yǎng)基為：ＭS＋NAＡ0.1mg/L+6-ＢA５．0ｍｇ／L+蔗糖３%＋瓊脂0.7％。②增殖培養(yǎng)基為ＭＳ+ＮＡA0.1mg／L＋6-BＡ3.0mｇ/Ｌ+蔗糖3%+瓊脂0.７%。③生根培養(yǎng)基1/2ＭS+NＡＡ０.1mg/L+蔗糖３%＋瓊脂0.７%。2、外植體的獲得取菊花帶頂芽莖段，長約２ｃm,于流水中沖洗去掉表面泥土,在超凈工作臺內(nèi)將材料浸入７5%酒精３０-４5s,然后用0.1％HｇCl2消毒７-１0min，無菌水浸洗4~5次,材料放入無菌的鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)。3、誘導(dǎo)側(cè)芽生長在解剖鏡下,用接種針將菊花頂芽外面的幼葉小心依次剝掉，直至在解剖鏡下能看清表面光滑、呈圓錐形的莖尖為止，再用已滅菌的解剖刀割取莖尖組織,長約０．5-0.6mｍ,接種于培養(yǎng)基①上。4、培養(yǎng)置于暗處1-2ｄ,然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)架上,通過ｌ0d菊花莖尖顏色逐漸變綠,基部逐漸增大,莖尖也逐漸伸長,一般２5d后,長出叢生芽。５、繼代培養(yǎng)將叢生芽切割下，分開接種于培養(yǎng)基②之上,一般１５d后可長出叢生芽，取叢生芽轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基②上,則可在更短的時間內(nèi)（約10d)長出叢生芽,繼代培養(yǎng)的次數(shù)越多，從接種到長出叢生芽所需的時間越短，但不短于7d，若不及時轉(zhuǎn)接,芽苗會迅速長高。6、誘導(dǎo)生根取長約2-3ｃｍ的芽苗分開接種于培養(yǎng)基③上,進(jìn)行誘導(dǎo)生根培養(yǎng),ｌ0d左右就可出現(xiàn)大量小根，最后有1-6條根可長得較長,芽苗也迅速長高。7、試管苗的移栽在芽苗生根后,先將瓶塞打開，讓其由無菌環(huán)境轉(zhuǎn)至有菌且濕度較低的環(huán)境之中約3d,將苗取出，小心用流水洗去根表面的培養(yǎng)基殘留物,移栽到沙土中，適當(dāng)遮蔭，一星期后即可成活，成活率達(dá)95％以上,一個月后即可上盆。五、思考題查閱相關(guān)文獻(xiàn)，以馬鈴薯為材料設(shè)計馬鈴薯脫毒苗實驗方案,涉及脫毒苗的檢測。

實驗十三馬鈴薯莖尖脫毒一、實驗?zāi)康呐c意義。掌握運用莖尖進(jìn)行脫毒培養(yǎng)的方法。馬鈴薯是人們平常生活中的一種重要食物。由于長期無性繁殖,馬鈴薯病毒病較重,所以導(dǎo)致品種退化,產(chǎn)量和品質(zhì)的大幅度下降。通過熱解決,在無菌條件下剝?nèi)⌒∮?.3mｍ的莖尖生長點進(jìn)行組織培養(yǎng)成苗后,基本可以達(dá)成脫去病毒的作用，從而恢復(fù)產(chǎn)量及品種特性。二、實驗器材光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺、鑷子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿、解剖刀、解剖針、解剖鏡。三、實驗藥品MＳ各種母液、６-ＢA、NＡA、ＧA3、酒精、升汞、蔗糖。四、實驗環(huán)節(jié)1、

將表面光滑的馬鈴薯切塊,埋在濕潤的沙土中在室溫下催芽。２、

待芽長至２cm時，將發(fā)芽塊莖放入３7℃的光照培養(yǎng)箱，光照時間1２h/d，解決時間２8d左右。3、

剪取通過熱解決的發(fā)芽塊莖的莖尖1~2ｃm,自來水沖洗0.5ｈ,剝?nèi)ネ饷娴娜~片。在超凈工作臺上進(jìn)行嚴(yán)格的消毒。4、

用7５%的酒精浸15ｓ，無菌水沖洗２次,再用0．1%的升汞浸泡8~10min,無菌水沖洗3~5次，每次沖5mｉｎ,放在滅過菌的培養(yǎng)皿中待用。5、

在超凈臺上，把裝有已消毒莖尖的培養(yǎng)皿放在解剖鏡下，仔細(xì)剝離,直到出現(xiàn)圓滑生長點時,用滅過菌的解剖針切取0.1~0.5mm帶1~2個葉原基的莖尖,接種于培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基為：MS+GＡ30.1+ＮAＡ0．１+6-ＢA0.5+蔗糖3%＋瓊脂０.6%。6、

將接種好的莖尖移到培養(yǎng)室中,于25℃、3000lｘ培養(yǎng),大約5~７d莖尖轉(zhuǎn)綠,40~50d成苗。7、

病毒檢測。重要用ELISA或指示植物方法鑒定。8、

在無菌條件下，將試管苗切割成帶一腋芽的莖段,接種在試管苗培養(yǎng)基：ＭS＋６-BA１.0+蔗糖3%+瓊脂0．６%9、

當(dāng)試管苗長高到3～４ｃm,具有5~7個濃綠色的小葉時進(jìn)行移栽。在移栽前4～５d開蓋煉苗，然后取出苗,洗凈根部培養(yǎng)基,將其移入珍珠巖基質(zhì)。移栽時用鑷子將基質(zhì)壓割成1～２cm深的槽溝，覆上基質(zhì),用水澆濕，以便根部與土壤密接，易于成活。保持較高空氣濕度，土壤不要過濕,光照應(yīng)當(dāng)充足,氣溫不宜超過30℃。１０、當(dāng)植株高度達(dá)成1０～１5cm，具有5片左右完全展開濃綠的復(fù)葉時移入田間。五、思考常用的病毒植株的鑒定方法有哪些？

實驗十四馬鈴薯試管微薯的誘導(dǎo)一、實驗?zāi)康呐c意義。掌握運用馬鈴薯無菌苗進(jìn)行微薯誘導(dǎo)的方法。莖尖脫毒與無性快繁技術(shù)應(yīng)用于馬鈴薯種薯生產(chǎn),能有效的克服病毒病對馬鈴薯的危害,并已產(chǎn)生了很大增產(chǎn)效果。離體條件下直接誘導(dǎo)試管微薯，實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)脫毒原原種薯,可以加快脫毒馬鈴薯的繁殖,縮短種薯生產(chǎn)周期,從而大幅度提高馬鈴薯的產(chǎn)量。二、實驗器材超凈工作臺、鑷子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿、解剖刀、濾紙、牛皮紙、脫脂棉。三、實驗藥品MS各種母液、6-BA、水楊酸（SA)、酒精、升汞、蔗糖。四、實驗環(huán)節(jié)１、

把通過檢測不帶病毒的小苗,切成帶1~2個芽的莖段，轉(zhuǎn)接于３0mｌ快繁培養(yǎng)基上,每瓶接15~20株,待小苗長至1０ｃｍ左右時,可以進(jìn)行下次擴繁?？旆钡囊后w培養(yǎng)基為:ＭS+6-ＢA１.0+蔗糖3％。固體支撐物為脫脂棉。2、

在20２３~3００0ｌx光下24h光照，25±１℃培養(yǎng)４0d左右。3、

于試管苗10~１5葉片，株高1０～1５ｃm時,在無菌條件下加入3０ｍl的誘導(dǎo)微薯的培養(yǎng)基。誘導(dǎo)微薯的培養(yǎng)基為：MS+6-BＡ5mg／L＋SＡ０．5mｍol／L+1２%蔗糖。4、

在黑暗條件下,15±3℃下,誘導(dǎo)試管微薯。5、

20d后,培養(yǎng)溫度升高到25℃,天天光照２~３h,50d后采收微薯。五、思考SA和蔗糖在馬鈴薯試管微薯的誘導(dǎo)過程中起什么作用?影響微薯誘導(dǎo)的因素有哪些？

實驗十五小麥幼胚培養(yǎng)一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)和掌握幼胚培養(yǎng)的一般方法。在遠(yuǎn)緣雜交中，雜種胚往往是敗育的,這時候只有進(jìn)行幼胚培養(yǎng)才干獲得下一代的種苗，因此幼胚培養(yǎng)在遠(yuǎn)緣雜交中具有極大的運用價值。此外，幼胚在誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化受體、篩選突變體方面也具有重要的應(yīng)用價值。因此幼胚培養(yǎng)越來越受到科學(xué)家們的關(guān)注。幼胚在胚珠中是異養(yǎng)的,需要從母體和胚乳中吸取各類營養(yǎng)物質(zhì)與生物活性物質(zhì)，因此進(jìn)行幼胚培養(yǎng)時，必須通過培養(yǎng)基向它提供足夠的營養(yǎng),并提供適宜的培養(yǎng)條件。二、實驗器材超凈工作臺、鑷子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿、解剖刀。三、實驗藥品MS培養(yǎng)基各種母液、NAＡ、６-BＡ、２，4－Ｄ、KT、蔗糖、瓊脂。四、實驗環(huán)節(jié)１、培養(yǎng)基的配制誘導(dǎo)培養(yǎng)基：ＭＳ+2，4-D2．0ｍg/Ｌ+KT0．5mg／Ｌ+蔗糖3％+瓊脂0.6%。繼代培養(yǎng)基：MＳ+2，4－D1.0ｍg/Ｌ+KT0．5mg/L+蔗糖３0g/Ｌ＋瓊脂0.6％。分化培養(yǎng)基:MＳ＋I(xiàn)AA0．５mg/Ｌ+KT1．5mg/L+蔗糖３%＋瓊脂0．6％。生根培養(yǎng)基：１／2MS＋NAA０.２+IAA０.５+蔗糖3%+瓊脂0.6%。2、取材小麥出現(xiàn)第一朵小花起分別掛牌記錄開花時間,15ｄ后從田間取回穗子,置于4℃冰箱內(nèi)解決2４ｈ。3、接種剝出子粒，用75%的酒精消毒３0s,用0.1%升汞消毒8min，用無菌水洗三次,于無菌條件下將幼胚剝出接在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，盾片向上。4、培養(yǎng)接種后的培養(yǎng)瓶于2023～3０00lｘ光照，(25±1)℃條件下培養(yǎng)，25d記錄出愈率,胚性愈傷誘導(dǎo)率。5、繼代將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。6、分化將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上。記錄分化率:分化率＝產(chǎn)生綠色芽點愈傷數(shù)/接種愈傷數(shù)×１00%7、生根綠芽長到２～3cm時轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基。8、煉苗打開瓶口，在培養(yǎng)間煉苗2～3d,轉(zhuǎn)到自然條件下煉苗2～３ｄ。9、移栽洗去小苗表面的培養(yǎng)基,移栽到小盆里,成活后移栽到大田。五、思考題植物胚胎培養(yǎng)分為哪些類型?各有何特點和規(guī)定?胚胎培養(yǎng)有何重要意義?

實驗十六小麥成熟胚培養(yǎng)一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)掌握成熟胚培養(yǎng)方法。小麥的組織培養(yǎng)，特別是胚性細(xì)胞系的建立，作為小麥遺傳轉(zhuǎn)化操作的重要技術(shù)基礎(chǔ)，一直受到廣泛關(guān)注。前人已采