RTCA技術(shù)與乳酸脫氫酶釋放法對比

RTCA技術(shù)與乳酸脫氫酶釋放法對比RTCA技術(shù)簡介：

原理：實(shí)時(shí)無標(biāo)記動態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)（RTCA，RealTimeCellularAnalysis）是通過特殊工藝，將微電子細(xì)胞傳感器芯片整合到細(xì)胞檢測板的底部，用以構(gòu)建實(shí)時(shí)、動態(tài)、定量跟蹤細(xì)胞形態(tài)和增殖分化等改變的細(xì)胞阻抗檢測傳感系統(tǒng)。當(dāng)貼壁生長在微電極表面的細(xì)胞引起貼壁電極界面阻抗的改變時(shí)，這種改變與細(xì)胞的實(shí)時(shí)功能狀態(tài)改變呈相關(guān)性，通過實(shí)時(shí)動態(tài)的電極阻抗檢測可以獲得細(xì)胞生理功能相關(guān)的生物信息，包括細(xì)胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁等。RTCA技術(shù)檢測抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用（ADCC）實(shí)驗(yàn)步驟：

1、向E-Plate檢測板中加入培養(yǎng)基并測定背景阻抗值。

2、收集對數(shù)期的靶細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，向E-Plate檢測板中加入一定體積的細(xì)胞，室溫超凈臺內(nèi)放置30min。

3、將加入細(xì)胞的E-Plate檢測板放入檢測臺上（檢測臺預(yù)先放入培養(yǎng)箱中），進(jìn)行實(shí)時(shí)動態(tài)的細(xì)胞增殖檢測。

4、過夜檢測后，向各培養(yǎng)孔中加入NK細(xì)胞及配制好的梯度抗體并繼續(xù)進(jìn)行檢測，即可獲得實(shí)時(shí)的細(xì)胞效應(yīng)曲線。

應(yīng)用RTCA技術(shù)對抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷(ADCC)作用檢測示意圖：

特點(diǎn)：

1、實(shí)驗(yàn)操作簡單，步驟少，人為誤差小。

2、采用無標(biāo)記方法，對細(xì)胞無損傷，細(xì)胞在最接近生理狀態(tài)下進(jìn)行檢測，結(jié)果準(zhǔn)確度高。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果客觀，重復(fù)性好。

4、完整細(xì)胞效應(yīng)圖譜，提供大量、重要的動態(tài)反應(yīng)信息。

5、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的自動獲取。

6、可實(shí)現(xiàn)時(shí)間量效檢測。典型的利用RTCA技術(shù)獲得的抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷（ADCC）實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果：

實(shí)時(shí)動態(tài)檢測IGF-1R抗體介導(dǎo)下NK-92細(xì)胞對DU-145細(xì)胞的殺傷作用（ADCC）實(shí)時(shí)監(jiān)測不同效靶比NK-92細(xì)胞對A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用乳酸脫氫酶釋放法簡介：

原理：乳酸脫氫酶（LDH）存在于細(xì)胞內(nèi)，正常情況下，不能透過細(xì)胞膜。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，LDH可從細(xì)胞內(nèi)釋放至培養(yǎng)液中。釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶I（NAD+）變成還原型輔酶（NADH），后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化氮唑藍(lán)（INT）或硝基氯化四氮唑藍(lán)（NBT）形成有色的甲基化合物，在570nm波長處有一個(gè)吸收峰，利用讀取的光吸收值，可測得殺傷細(xì)胞毒活性。

乳酸脫氫酶釋放法基本實(shí)驗(yàn)步驟：

1、收集對數(shù)生長期的靶細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按一定濃度接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2、收集效應(yīng)細(xì)胞并計(jì)數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照一定的效靶比加入效應(yīng)細(xì)胞并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)。

3、2小時(shí)后，1000rpm離心5分鐘，取100ul上清液移入新孔內(nèi)，37℃孵育10分鐘。

4、每孔加入100ulLDH底物，室溫避光15分鐘。

5、加入1mol/L檸檬酸，30ul/孔。

6、酶標(biāo)儀測定OD570nm的吸光度值。乳酸脫氫酶釋放法實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

RTCA技術(shù)與乳酸脫氫酶釋放法優(yōu)勢對比

RTCA技術(shù)乳酸脫氫酶釋放法

標(biāo)記物

無，對細(xì)胞無傷害

有，對細(xì)胞有傷害

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

連續(xù)的實(shí)時(shí)動態(tài)曲線

終點(diǎn)檢測（單點(diǎn)數(shù)據(jù)）

實(shí)驗(yàn)步驟

簡單

繁瑣

實(shí)驗(yàn)重復(fù)性

高

低

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲取

自動

手動

細(xì)胞活性信息

粘附、活力、形態(tài)

活力

時(shí)間量效檢測

一