過(guò)氧化氫酶km值是多少

本文格式為Word版，下載可任意編輯——過(guò)氧化氫酶km值是多少篇一：過(guò)氧化氫酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

測(cè)驗(yàn)工程二、過(guò)氧化氫酶的活力和動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

姓名：

趙家熙指導(dǎo)教師：

譚志文測(cè)驗(yàn)室：

6503組員：①章恒炯②③勞績(jī)：

第三片面：測(cè)驗(yàn)記錄與分析一、酶活力測(cè)定（一）原始數(shù)據(jù)

1.樣品原始質(zhì)量：5.032g2.標(biāo)定數(shù)據(jù)：

（1）KMnO4質(zhì)量數(shù)及配制：158（2）Na2C2O4質(zhì)量數(shù)：134（3）標(biāo)定數(shù)據(jù)：0.02mol/L

（4）KMnO4實(shí)際濃度：0.019mol/L3.樣品滴定數(shù)據(jù)

消耗高錳酸鉀溶液（ml）：測(cè)驗(yàn)（1）0.65

測(cè)驗(yàn)（2）0.50對(duì)照（1）1.45對(duì)照（2）1.30

（二）結(jié)果計(jì)算

1．換算系數(shù)（1mLKMnO4溶液相當(dāng)于多少mgH2O2）

1.7

2.樣品酶活計(jì)算（每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示：mgH2O2/g?min）

(A?B)?VT?1.7FW?V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=

酶活(mgH2O2/g·min)=0.218

（A-B）=0.8VT=20.25FW=5.032V1=2.5mlt=10min

二、動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定（一）原始數(shù)據(jù)

（二）求出各管回響前的底物濃度[S]0和回響速度

V0

（三）以1/V0對(duì)1/[S]0作圖（用excel作圖）

1/s1/v

200111.1

149.280.6

121.979.3

8045.1

4021.2

（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min）

Km11??vv[S]v如（三）中圖

maxmax

y=0.5572x+1.5829x=0時(shí)y=1/Vmax

y=0時(shí)x=-1/Km

Km=0.35Vmax=0.63

第四片面：課后研討題

1.總結(jié)本測(cè)驗(yàn)操作過(guò)程的留神事項(xiàng)。

1酶的提取和存放一般在0-4℃下舉行。

2每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)的酶促回響時(shí)間要精確操縱在5min。

3各回響瓶的滴定終點(diǎn)微紅色為同一標(biāo)準(zhǔn)。

4使用前應(yīng)檢查滴定管是否滲漏，滴定過(guò)程中理應(yīng)保證逐滴參與。

2.影響過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定的因素有哪些?

1、溫度，溫度過(guò)高或者過(guò)低會(huì)降低過(guò)氧化氫酶的活性。

2、酸堿度，酸或堿濃度太高會(huì)使過(guò)氧化氫酶失活。

3.過(guò)氧化氫酶與哪些生化過(guò)程有關(guān)?

R(Fe2+)+H2O2=R(Fe3++OH－)R(Fe3+OH－)2+H2O2=R(Fe2+)2+2H2O+O2

4.在回響速度的測(cè)定中，參與硫酸有哪些作用？

終止回響,為下一步的滴定供給酸的環(huán)境。

5.米氏方程中的Km有何實(shí)際應(yīng)用？

米氏常數(shù)是酶促回響速度n為最大酶促回響速度值一半時(shí)的底物濃度。可用于判斷回響級(jí)數(shù)；

判斷是否為不同種酶；

判斷酶的最適底物；

確定酶活性測(cè)試時(shí)所需底物的濃度。

6.在什么條件下，酶的Km可以作為鑒定酶的一種手段，為什么？

當(dāng)ν=Vmax/2時(shí)，Km=[S]。Km值是酶促回響速度為最大速度一半時(shí)的底物濃度。

Km值對(duì)某一特定酶來(lái)說(shuō)是個(gè)常數(shù)。一半根據(jù)酶的Km值來(lái)判斷這些酶是否是完全一致的酶，或是催化同一回響的一類酶。

Km值越大，酶與底物親和力越小；

Km值越小，酶與底物親和力越大。

7.測(cè)定酶活力為什么要在進(jìn)程曲線的初速度時(shí)間范圍內(nèi)舉行？

進(jìn)程曲線是在酶回響的最適條件下采用每隔確定時(shí)間測(cè)產(chǎn)物生成量的方法，以酶回響時(shí)間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物生成量為縱坐標(biāo)繪制而成。從進(jìn)程曲線可知，在曲線起始一段時(shí)間內(nèi)為直線，其斜率代表初速度。隨回響時(shí)間延長(zhǎng)，曲線趨于平坦，斜率變小，說(shuō)明酶的回響速度下降?；仨懰俣入S回響時(shí)間的延長(zhǎng)而降低這一現(xiàn)象可能是由于底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的增高致使逆回響加強(qiáng)等理由所致。

8.過(guò)氧化氫酶的活力測(cè)定還有另外一種方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波長(zhǎng)下有猛烈吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，使

回響溶液吸光度(A240)隨回響時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活力。請(qǐng)你查閱資料一個(gè)應(yīng)用該方法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活力的測(cè)驗(yàn)。

測(cè)驗(yàn)概要

本測(cè)驗(yàn)用紫外吸收法測(cè)定了過(guò)氧化氫酶的活性。

主要試劑

0.2mol/LpH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）；

0.1mol/LH2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)定）。

主要設(shè)備

紫外分光光度計(jì)；

離心機(jī)；

研缽；

250ml容量瓶1個(gè)；

0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；

10ml試管3支；

恒溫水浴。

測(cè)驗(yàn)步驟

1.酶液提?。悍Q取嶄新小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，參與2～3ml4℃下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度?；旌掀絼?qū)⒘科恐?℃冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過(guò)氧化氫酶粗提液。5℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.測(cè)定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測(cè)定管，1支為空白管，按表依次參與試劑。

表紫外吸收法測(cè)定H2O2樣品液配置表

25℃預(yù)熱后,逐管參與0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立刻記時(shí)，并急速倒入石英比色杯中，240nm下測(cè)定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min，待3支管全部測(cè)定完后，按下式計(jì)算酶活性。

篇二：測(cè)定過(guò)氧化氫酶Km

測(cè)驗(yàn)一過(guò)氧化氫酶Km的測(cè)定

本測(cè)驗(yàn)測(cè)定紅細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶的米氏常數(shù)。過(guò)氧化氫酶(CAT)催化以下回響：

?????2H2O+O2↑2H2O2?過(guò)氧化氫酶

H2O2濃度可用KMnO4在硫酸存在下滴定測(cè)知。

2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4???2MnSO4＋K2SO4＋5O2↑＋8H2O

求出回響前后H2O2的濃度差即為回響速度。作圖求出過(guò)氧化氫酶的米氏常數(shù)。

1．0.05mol/L草酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液將草酸鈉（AR）于100～105℃烘12h。冷卻后，

切實(shí)稱取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，參與濃H2SO45ml，加蒸餾水至刻度，充分混勻，此液可貯存數(shù)周。

2．約0.02mlKMnO4儲(chǔ)存液稱取KMnO43.4g，溶于1000ml蒸餾水中，加熱攪拌，待全部溶解后，用外觀皿蓋住，在低于沸點(diǎn)溫度上加熱數(shù)小時(shí)，冷后放置過(guò)夜，玻璃絲過(guò)濾，棕色瓶?jī)?nèi)保存。

3．0.004mol/LKMnO4應(yīng)用液取0.05mol/L草酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液20ml，于錐形瓶中，加濃H2SO4ml，于70℃水浴中用KMnO4貯存液滴定至微紅色，根據(jù)滴定結(jié)果算出KMnO4貯存液的標(biāo)準(zhǔn)濃度，稀釋成0.004mol/L，每次稀釋都務(wù)必重新標(biāo)定儲(chǔ)存液。

4．約0.08mol/LH2O2液取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸餾水至刻度，臨用時(shí)用0.004mol/LKMnO4標(biāo)定之，稀釋至所需濃度。

5．0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）。

l．血液稀釋吸取嶄新（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸餾水稀釋至10ml，混勻。取此稀釋血液1.0ml，用磷酸鹽緩沖液(pH7.0，0.2mol/L)稀釋至10ml，得1：1000稀釋血液。

2．H2O2濃度的標(biāo)定：取清白錐形瓶?jī)芍?，各加濃度約為0.08mol/L的H2O22.0ml和25%H2SO42.0ml，分別用0.004mol/LKMnO4滴定至微紅色。從滴定用去KMnO4ml數(shù)，求出H2O2的mol濃度。

3．回響速度的測(cè)定：取枯燥清白50ml錐形瓶5只，編號(hào)，按下表操作。

參與物(ml)H2O2(約0.08mol/L)

蒸餾水

10.503.0

21.002.50

31.502.00

42.001.50

52.501.00

將各瓶置37℃水浴預(yù)熱5min，依次參與1：1000稀釋血液每瓶0.5ml，邊加

邊搖，持續(xù)保溫準(zhǔn)5min，按依次向各瓶加25%H2SO42.0ml，邊加邊搖，使酶促回響立刻終止。

結(jié)果用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶至微紅色,記錄KMnO4消耗量(ml)。

1．回響瓶中H2O2濃度(mol/L)?

H2O2mol濃度?參與H2O2ml數(shù)

4

?

H2O2mmol數(shù)

4

（式中：4為回響液量4ml）2．回響速度的計(jì)算：以回響消耗的H2O2mmol數(shù)表示。

回響速度=參與的H2O2mmol數(shù)－剩余的H2O2mmol數(shù)

即：H2O2mol濃度×參與的毫升數(shù)－KMnO40.004mol/L×消耗的KMnO4毫升數(shù)×5/2（式中：5/2為KMnO4與H2O2回響中mol換算系數(shù)）3．求Km值：

下面引用一次測(cè)驗(yàn)結(jié)果為例，求過(guò)氧化氫酶的Km值，供計(jì)算參考。

己知KMnO4為0.004mo1/L，標(biāo)定出H2O2濃度為0.08mol/L，列表計(jì)算如下：

計(jì)算程序

①加人H2O2數(shù)

②加人H2O2mmol=①×0.08③底物濃度［S］=②÷4④酶作用后，KMnO4滴定ml

10.500.040.011.35

21.000.080.023.700.0370.043

31.500.120.036.400.0640.056

42.000.160.049.800.0980.062

52.500.200.0513.200.1320.068

⑤剩余H2O2mmol=④×0.004×5/20.0135⑥回響速度V=②一⑤

0.0265

⑦[S]/V=③÷⑥0.3770.4650.5360.6450.735

按前述方法作圖求得Km＝0.032mol/L。

l．Km值的意義是什么？

2．測(cè)酶Km值的測(cè)驗(yàn)中，需要更加留神哪些操作？

篇三：酶工程測(cè)驗(yàn)(2022.3)

測(cè)驗(yàn)一過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定

一、目的

了解米氏常數(shù)的意義，測(cè)定過(guò)氧化氫酶的米氏常數(shù)。

二、測(cè)驗(yàn)原理

H2O2被過(guò)氧化氫酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性

環(huán)境中滴定，根據(jù)回響前后H2O2的濃度差可求出回響速度。

本測(cè)驗(yàn)以馬鈴薯供給過(guò)氧化氫酶，以1/ν~1/[S]作圖求Km

三、測(cè)驗(yàn)器材

1.錐形瓶100～150ml（×6）。

2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。

3.溫度計(jì)（0～100℃）。

4.微量滴定管5ml（×1）。

5.容量瓶1000ml（×1）。

四、測(cè)驗(yàn)試劑

1、0.02mol/L磷酸緩沖液（Ph7.0）

取磷酸二氫鉀0.68g，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液29.1ml，用水稀釋至100ml,即得。

2、酶液：稱取馬鈴薯5g，加上述緩沖液10ml，勻漿，過(guò)濾。

3、0.02mol/LKMnO4：稱取KMnO4（AR）3.2g，加蒸餾水1000ml，煮沸15min，2d后過(guò)濾，棕色瓶保存。

4、0.004mol/LKMnO4：切實(shí)稱取恒重草酸鈉0.2g，加250ml冷沸水及10ml

濃硫酸，攪拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微紅色，水浴，加熱至65℃，持續(xù)滴定至溶液微紅色并30s不褪，算出KMnO4的切實(shí)濃度稀釋成0.004mol/L即可。

5、0.05mol/LH2O2：取30%H2O223ml參與1000ml容量瓶中，加蒸餾水至刻

度（約0.2mol/L），用標(biāo)準(zhǔn)KMnO4（0.004mol/L）標(biāo)定其切實(shí)濃度，稀釋成0.05mol/L（標(biāo)定前稀釋4倍，取2.0ml，加25%H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微紅色）。

6、25%H2SO4

五、操作

取錐形瓶6只，按下表依次參與試劑：

表一過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定

先加好0.05mol/LH2O2及蒸餾水，加酶液后立刻混合，依次記錄各瓶的起始回響時(shí)間。各瓶時(shí)間達(dá)5min時(shí)立刻加2.0ml25%硫酸終止回響，充分混勻。用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微紅色，記錄消耗的KMnO4體積。

六、計(jì)算

分別求出各瓶的底物濃度[S]和回響速度v。

[S]=c1V1/10

式中[S]：底物物質(zhì)的量濃度（mol/L）；

c1：H2O2物質(zhì)的量濃度（mol/L）；

V1：H2O2體積（ml）；

10：回響的總體積（ml）；

υ：回響速度（mmol/min）；

c2：KMnO4物質(zhì)的量濃度（mol/L）；

V2：KMnO4體積（ml）；

以1/υ對(duì)1/[S]作圖求出Km。

測(cè)驗(yàn)二酶促回響中初速度時(shí)間范圍測(cè)定

一、測(cè)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.了解酶促回響中初速度時(shí)間范圍測(cè)定的根本原理；

2.掌管酶促回響中初速度時(shí)間范圍的測(cè)定方法。

二、測(cè)驗(yàn)原理

酸性磷酸酯酶（acidphosphatase,EC3.1.3.2）廣泛分布于動(dòng)植物體中，尤其是植物的種子、動(dòng)物肝臟和人體的前列腺中。它對(duì)生物體內(nèi)核苷酸、磷蛋白和磷脂的代謝起著重要作用。

酸性磷酸酯酶能專一性水解磷酸單酯鍵。以人工合成的對(duì)硝基苯磷酸酯（4-nitrophenylphosphate,NPP）作底物，水解產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚和磷酸。在堿性溶液中，對(duì)硝基酚的鹽離子于405nm處光吸收猛烈，而底物沒(méi)有這種特性。

利用產(chǎn)物的這種特性，可以定量的測(cè)定產(chǎn)物的生成量，從而求得酶的活力單位。即通過(guò)測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)405nm處光吸收值的變化來(lái)確定酸性磷酸酯酶的活性。

酸性磷酸酯酶的一個(gè)活力單位是指在酶回響的最適條件下，每分鐘生成1μmol產(chǎn)物所需的酶量。

要舉行酶活力測(cè)定，首先要確定酶回響時(shí)間。而酶的回響時(shí)間理應(yīng)在初速度時(shí)間范圍內(nèi)選擇?？梢酝ㄟ^(guò)進(jìn)程曲線的制作來(lái)求出酶的初速度時(shí)間范圍。進(jìn)程曲線的制作是指在酶回響的最適條件下，采用每隔確定時(shí)間測(cè)定產(chǎn)物生成量，以酶回響時(shí)間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物生成量為縱坐標(biāo)繪制而成。從進(jìn)程曲線可知，在曲線起始的一段時(shí)間內(nèi)為直線，其斜率代表初速度。隨著回響時(shí)間的延長(zhǎng)，曲線趨于平坦，斜率變小，回響速度下降。要真實(shí)反映出酶活力大小，就應(yīng)在初速度時(shí)間內(nèi)測(cè)定。

三、測(cè)驗(yàn)試劑與器材1.試劑

（1）酸性磷酸酯酶原液（從綠豆芽中提?。?）酸性磷酸酯酶液（通過(guò)原酶液稀釋得到）

取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0檸檬酸鹽緩沖液稀釋，使進(jìn)程曲線中第11號(hào)管吸光度A405在0.6～0.7之間。

（3）1.2mmol/L對(duì)硝基苯磷酸酯

精確稱取NPP0.4454g，加緩沖液定容至100mL。

（4）0.3mol/LNaOH溶液2．器材

恒溫水浴槽，可見分光光度計(jì)，試管，刻度吸管，離心機(jī)。

四、操作步驟

1.酸性磷酸酯