第3章 代謝控制發(fā)酵的基本思想

第三章代謝控制發(fā)酵

的基本思想代謝控制發(fā)酵課程授課教師：張俠E-mail：zhangxia79@第一節(jié)代謝控制發(fā)酵的基本思想代謝控制發(fā)酵能否獲得成功，目的產(chǎn)物的產(chǎn)量高低與否，取決于微生物細(xì)胞自我調(diào)節(jié)控制機(jī)制是否能夠被解除和解除的程度。最有效的方法就是選育從遺傳角度解除了正常代謝控制機(jī)制的微生物突變株。代謝控制發(fā)酵的基本思想切斷支路代謝解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié)增加前體物的合成去除終產(chǎn)物條件突變株的應(yīng)用選育不生成副產(chǎn)物的菌株一、切斷支路代謝1、營養(yǎng)缺陷型突變株（A-）的應(yīng)用所謂營養(yǎng)缺陷型就是指原菌株由于發(fā)生了基因突變，致使合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，從而喪失了合成某種物質(zhì)的能力，必須在培養(yǎng)中外源補(bǔ)加該營養(yǎng)物質(zhì)才能生長(zhǎng)的突變型菌株。由于其在合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，致使終產(chǎn)物不能積累，因此，也就遺傳性地解除了終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)，使得中間產(chǎn)物或另一分支途徑的末端產(chǎn)物得以積累。①無分支途徑圖谷氨酸棒桿菌鳥氨酸生物合成途徑①乙酰谷氨酸合成酶②乙酰谷氨酸激酶③N-乙酰谷氨酸半醛脫氫酶④乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶⑤乙酰鳥氨酸酶

Arg對(duì)①→⑤有反饋調(diào)節(jié)作用。選育瓜氨酸缺陷突變株（Cit-），亞適量添加瓜氨酸，就會(huì)積累大量的鳥氨酸。②分支途徑

E、G協(xié)同反饋抑制第1個(gè)酶的活性和阻遏酶的生成。當(dāng)菌株失去C→D的能力即成為D或E缺陷型突變株時(shí)，解除了E、G對(duì)第1個(gè)酶的協(xié)同反饋調(diào)節(jié)。當(dāng)培養(yǎng)基中限量添加E，那么只剩下G對(duì)C→F轉(zhuǎn)變的控制，F(xiàn)、G不會(huì)過量生成，而使C得以積累。例：利用枯草芽孢桿菌營養(yǎng)缺陷型生產(chǎn)肌苷5－磷酸核糖焦磷酸PRPP谷氨酰胺PRPP轉(zhuǎn)移酶5－磷酸核糖胺腺嘌呤核苷琥珀酸SAMP黃嘌呤核苷酸XMP腺嘌呤核苷酸AMP鳥嘌呤核苷酸GMP5’-IMP肌苷酸肌苷IR肌苷發(fā)酵就是通過代謝流的阻塞來消除終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)，以達(dá)到中間產(chǎn)物的積累。選用腺嘌呤缺陷型Ade-時(shí)，切斷了IMP到AMP這條支路代謝，通過在培養(yǎng)基中限量控制腺嘌呤的量，可以解除腺嘌呤系化合物對(duì)PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的反饋調(diào)節(jié)，可以IR得以積累。如果在Ade-基礎(chǔ)上再誘變成黃嘌呤缺陷型Xan-或鳥嘌呤缺陷型Gua-，可以切斷IMP到GMP這條支路代謝，從而增加IR的積累。③積累另一分支途徑的終產(chǎn)物在分支合成途徑中，由于存在著多個(gè)終產(chǎn)物單獨(dú)存在時(shí)不能對(duì)其合成途徑的關(guān)鍵酶實(shí)現(xiàn)全部反饋抑制或阻遏這一現(xiàn)象，因此，可以利用這種機(jī)制選育營養(yǎng)缺陷型菌株，造成一個(gè)或兩個(gè)終產(chǎn)物合成缺陷而使另外的終產(chǎn)物得以積累。通常I、E協(xié)同反饋調(diào)節(jié)途徑第一個(gè)酶，但菌株喪失C→F的能力，是I、G的雙缺陷突變體。若在培養(yǎng)基中亞適量添加I、G，就解除I、E對(duì)第一個(gè)酶的協(xié)同反饋調(diào)節(jié)，使終產(chǎn)物E大量積累，所以只要選育F或G、I雙缺陷型突變株就可以積累E。關(guān)鍵酶天冬氨酸激酶受賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制蘇氨酸缺陷型高絲氨酸缺陷型例：利用高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型(Hom-)或蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型(Thr-)菌株達(dá)到賴氨酸的積累2、滲漏突變株（AL）的應(yīng)用滲漏突變株就是指遺傳性障礙不完全的缺陷型。這種突變是使它的某一種酶的活性下降而不是完全喪失，因此，滲漏缺陷型能夠少量地合成某一種代謝最終產(chǎn)物，能在基本培養(yǎng)基上進(jìn)行少量的生長(zhǎng)。由于滲漏缺陷型不能合成過量的最終產(chǎn)物，即解除了反饋調(diào)節(jié)，所以不會(huì)造成反饋抑制而影響中間代謝產(chǎn)物的積累。二、解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié)1、選育抗類似物突變株（Ar）結(jié)構(gòu)類似物：在微生物生理學(xué)中是指某些與指定代謝中間產(chǎn)物、合成途徑的終產(chǎn)物等空間結(jié)構(gòu)相似而代謝性能不同的化合物。判別結(jié)構(gòu)類似物的要點(diǎn)：一是空間結(jié)構(gòu)類似；二是對(duì)微生物有致死性或毒性。結(jié)構(gòu)類似物的作用機(jī)理結(jié)構(gòu)類似物由于與代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似，所以同樣能與阻遏物以及變構(gòu)酶相結(jié)合?？墒撬鼈兺荒艽嬲５陌被岫铣傻鞍踪|(zhì)，也就是說它們?cè)诩?xì)胞中的濃度不會(huì)降低，因此阻遏物與變構(gòu)酶的結(jié)合是不可逆的。這就使得有關(guān)的酶不可逆地停止了合成，或是酶的催化作用不可逆地被抑制?？诡愃莆锿蛔冎辏涸诤欢舛冉Y(jié)構(gòu)類似物的培養(yǎng)基中仍能生長(zhǎng)的突變株。選育抗性突變株，因?yàn)榇x調(diào)節(jié)可被遺傳性地解除，在發(fā)酵時(shí)可不再受培養(yǎng)成分的影響，生產(chǎn)較為穩(wěn)定，不易發(fā)生回復(fù)突變，因此在發(fā)酵生產(chǎn)上被廣泛采用。例：精氨酸的生物合成途徑及反饋調(diào)節(jié)精氨酸的合成受其本身的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒?，為了積累像精氨酸這樣非支路代謝途徑的終產(chǎn)物，主要采用抗精氨酸類似物突變株。D-精氨酸抗性精氨酸氧肟酸鹽抗性2、酶特性的利用在育種過程中，當(dāng)找不到有效類似物時(shí)，如果目的產(chǎn)物的生物合成途徑中某個(gè)酶具有底物專一性寬的特性，則可利用該酶對(duì)其它底物的活性，育得代謝調(diào)節(jié)突變株。例：選育精氨酸生產(chǎn)菌在添加了乙酰賴氨酸和過量精氨酸的培養(yǎng)基中，接種賴氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(Lys-)，從出現(xiàn)的生長(zhǎng)菌落中(Lys+)，能夠獲得精氨酸生物合成酶系的去阻遏突變株。3、營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株的應(yīng)用當(dāng)一個(gè)菌株由于突變而失去某一遺傳性狀后，經(jīng)過回復(fù)突變可以再回復(fù)其原有的遺傳性狀，即該酶的活性中心結(jié)構(gòu)可以復(fù)原，而調(diào)節(jié)部位的結(jié)構(gòu)常常并沒有恢復(fù)，這樣可以解除或減弱反饋調(diào)節(jié)。當(dāng)難于找到合適類似物或多重抗性交叉難以增加抗性標(biāo)記，或反饋調(diào)節(jié)很復(fù)雜時(shí)，可采用由營養(yǎng)缺陷型選育回復(fù)突變株的方法來選育高產(chǎn)菌株。例，先將金霉素生產(chǎn)菌綠鏈霉菌（Streptomycesviridifaciens）誘變成蛋氨酸缺陷型，再回復(fù)突變成原養(yǎng)型，結(jié)果其中有5%的回復(fù)突變株的金霉素產(chǎn)量提高了1.2-3.2倍。原因是在金霉素的合成過程中，由蛋氨酸供應(yīng)甲基，蛋氨酸在細(xì)胞中的濃度高可以促進(jìn)金霉素的合成。而回復(fù)突變使得蛋氨酸的合成不受反饋抑制，結(jié)果使金霉素的含量隨蛋氨酸含量的提高而提高。三、增加前體物的合成1、切斷共同前體的分支途徑

在分支合成途徑中，切斷目的產(chǎn)物外的其它共用酶的終產(chǎn)物分支合成途徑，增加目的產(chǎn)物的前體，使目的產(chǎn)物的產(chǎn)量提高。例：賴氨酸發(fā)酵育種上，在解除了賴氨酸反饋調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上，增加丙氨酸營養(yǎng)缺陷等標(biāo)記可以進(jìn)一步提高賴氨酸產(chǎn)量。2、解除前體物合成的調(diào)節(jié)目的產(chǎn)物的生物合成從別的終產(chǎn)物開始時(shí)，除設(shè)法解除目的產(chǎn)物自身合成的反饋調(diào)節(jié)外，也應(yīng)設(shè)法解除對(duì)其前體物合成的調(diào)節(jié)。例：異亮氨酸育種蘇氨酸是異亮氨酸的前體物。解除蘇氨酸的反饋調(diào)節(jié)，可以獲得異亮氨酸的高產(chǎn)菌株。3、增強(qiáng)前體代謝流

在生物合成途徑中分支點(diǎn)的代謝流增強(qiáng)，使分支點(diǎn)處的中間產(chǎn)物增多，導(dǎo)致目的產(chǎn)物的積累增加。三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物是谷氨酸生物合成的前體增加乙酰CoA的合成量，就能增大C4二羧酸的消耗，從而增加谷氨酸前體物的生成，提高了谷氨酸的積累。4、利用基因工程技術(shù)，將生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因克隆到多拷貝載體上，使其大量擴(kuò)增，從而也就增加了目的產(chǎn)物的前體物的合成，這是最直接的提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量的方法。四、去除終產(chǎn)物改變細(xì)胞膜滲透性，把反饋控制因子的終產(chǎn)物迅速不斷地排出于細(xì)胞外，不使終產(chǎn)物積累到引起反饋調(diào)節(jié)的濃度，就可以預(yù)防反饋控制。方法：限量添加生物素；添加脂肪酸類似物；添加青霉素等抗生素；選育喪失脂肪酸合成酶的油酸缺陷型；喪失α-磷酸甘油脫氫酶的甘油缺陷型等在發(fā)酵培養(yǎng)基中積累谷氨酸。其方法有：限量供給生物素。五、條件突變株的應(yīng)用條件突變：因環(huán)境條件的不同能顯示野生型特性又能顯示突變型特性的突變。這主要是在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因上發(fā)生突變。如溫度敏感性突變、抑制性突變、鏈霉素依賴性突變和低溫敏感性突變等。溫度敏感性突變：在低溫下生長(zhǎng)，而在高溫下卻不能生長(zhǎng)繁殖的突變株。溫度敏感、在高溫下不能生長(zhǎng)，是由于該酶受熱失活的緣故。如果該酶是氨基酸或核苷酸生物合成途徑上的某種酶，那么該突變株在高溫下就是一種營養(yǎng)缺陷型。

六、選育不生成副產(chǎn)物的菌株1、有共用前體物的其它分支途徑或目的產(chǎn)物是其它產(chǎn)物生物合成途徑的前體物時(shí)，就附加營養(yǎng)缺陷型，切斷其它分支途徑或目的產(chǎn)物向其它產(chǎn)物合成的代謝流。AK-Lys-Met-Thr-天冬氨酸發(fā)酵2、存在有目的產(chǎn)物分解途徑時(shí)，應(yīng)選育喪失目的產(chǎn)物分解酶的突變株。例：選育Thr高產(chǎn)菌PC：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶AK：天冬氨酸激酶HD：高絲氨酸脫氫酶TD：蘇氨酸脫氨酶3、當(dāng)有副產(chǎn)物，特別是有不利于目的產(chǎn)物精制的副產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)設(shè)法切斷副產(chǎn)物的代謝流。例，在異亮氨酸發(fā)酵中，副生不利于異亮氨酸精制操作的正纈氨酸和高異亮氨酸。這些副生氨基酸由α-酮丁酸、α-酮-β-甲基戊酸經(jīng)亮氨酸生物合成途徑生成，為亮氨酸所調(diào)節(jié)。所以，對(duì)于異亮氨酸生產(chǎn)菌株來說，如能增加亮氨酸缺陷這一遺傳標(biāo)記，就可以不副生正纈氨酸和高異亮氨酸，達(dá)到改良生產(chǎn)菌株的目的。代謝控制發(fā)酵的基本思想切斷支路代謝解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié)增加前體物的合成去除終產(chǎn)物條件突變株的應(yīng)用選育不生成副產(chǎn)物的菌株第三節(jié)菌種改造的策略菌種改造的目的是：要把出發(fā)菌種改造成能在特定條件下進(jìn)行異常代謝，以實(shí)現(xiàn)從原料到目的產(chǎn)物的高效轉(zhuǎn)化的高產(chǎn)菌種。要達(dá)到上述目的，可采用“進(jìn)、通、節(jié)、堵、出”五字策略。1、進(jìn)：促進(jìn)細(xì)胞對(duì)碳源等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。2、通：解除途徑中某些酶的反饋調(diào)節(jié)，或者誘導(dǎo)（激活）這些酶，從而使來自各個(gè)分支的碳架物質(zhì)能暢通地流向目的產(chǎn)物。3、節(jié)：阻塞與目的產(chǎn)物的形成無關(guān)或關(guān)系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對(duì)集中地流向目的產(chǎn)物。4、堵：消除或消弱目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的途徑。5、出：促進(jìn)目的產(chǎn)物向胞外空間分泌。第四節(jié)環(huán)境條件控制代謝控制發(fā)酵能否獲得成功，目的產(chǎn)物產(chǎn)量的高低，取決于其代謝控制機(jī)制是否能夠解除和解除的程度。同時(shí)，發(fā)酵的環(huán)境條件，如溫度、溶解氧、pH值、NH3的供應(yīng)，營養(yǎng)濃度控制等也非常重要。例：在肌苷發(fā)酵過程中，枯草芽孢桿菌在供氧不足的條件下會(huì)發(fā)生發(fā)酵轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)而積累3-羥基丁酸、2,3-丁二醇和乳酸。CO2對(duì)肌苷的產(chǎn)生具有抑制作用。通氣攪拌以保證供氧，而且還要考慮適當(dāng)換氣以降低CO2濃度。在保藏