第八章 吸光光度法

第八章吸光光度法

基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立的分析方法稱為吸光光度法。包括比色法、可見(jiàn)及紫外分光光度法等。本章主要討論可見(jiàn)光區(qū)的吸光光度法。利用可見(jiàn)光進(jìn)行吸光光度法分析時(shí)，通常將被測(cè)組分通過(guò)化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色化合物，然后進(jìn)行吸光度的測(cè)量。例如：測(cè)量鋼樣中Mn的含量，在酸性溶液中將Mn

氧化為MnO4-，然后進(jìn)行吸光度的測(cè)量。與化學(xué)分析法比較它具有如下特點(diǎn)：

（一）靈敏度高吸光光度法常用于測(cè)定試樣中1－0.001%的微量組分。對(duì)固體試樣一般可測(cè)至10-4%。（二）分析微量組分的準(zhǔn)確度高例如：含鐵量為0.001%的試樣，如果用滴定法測(cè)定，稱量1g試樣，僅含鐵0.01mg，無(wú)法用滴定分析法測(cè)定。如果用顯色劑1，10-鄰二氮雜菲與亞鐵離子生成橙紅色的1，10-鄰二氮雜菲亞鐵配合物，就可用吸光光度法來(lái)測(cè)定。Fe2++3(1,10-phen)→[Fe(1,10-phen)3]2+

（三）操作簡(jiǎn)便，測(cè)定快速（四）應(yīng)用廣泛幾乎所有的無(wú)機(jī)離子和許多有機(jī)化合物都可直接或間接地用分光光度法測(cè)定?？捎脕?lái)研究化學(xué)反應(yīng)的機(jī)理、溶液中配合物的組成、測(cè)定一些酸堿的離解常數(shù)等。§8-1

吸光光度法基本原理一、物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收

當(dāng)光束照射到物質(zhì)上時(shí)，光與物質(zhì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生了反射、散射、吸收或透射（p241,圖9-1）。若被照射的是均勻的溶液，則光在溶液中的散射損失可以忽略。

當(dāng)一束由紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等各種顏色的光復(fù)合而成的白光通過(guò)某一有色溶液時(shí)，一些波長(zhǎng)的光被溶液吸收，另一些波長(zhǎng)的光則透過(guò)。當(dāng)透射光波長(zhǎng)在400-700nm范圍時(shí)，人眼可覺(jué)察到顏色的存在，這部分光被稱為可見(jiàn)光。透射光和吸收光呈互補(bǔ)色，即物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色是與其吸收光呈互補(bǔ)色的透射光的顏色。例如：CuSO4溶液由于吸收了580-600nm的黃色光，呈現(xiàn)的是與黃色呈互補(bǔ)色的藍(lán)色。不同波長(zhǎng)的光具有不同的顏色，見(jiàn)P294，表9-1。物質(zhì)吸收了光子的能量由基態(tài)躍遷到較高能態(tài)（激發(fā)態(tài)），這個(gè)過(guò)程叫做物質(zhì)對(duì)光的吸收。M（基態(tài)）+hυ→M*(激發(fā)態(tài))當(dāng)照射光光子的能量hυ與物質(zhì)的基態(tài)與激發(fā)態(tài)能量之差相等時(shí)，即ΔE=hυ，才能發(fā)生吸收。不同的物質(zhì)由于結(jié)構(gòu)不同而具有不同的能級(jí)差，所以吸收不同波長(zhǎng)的光。物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光吸收能力的分布情況，稱為吸收曲線，也稱為吸收光譜。吸收曲線以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)。每種物質(zhì)的吸收曲線，一般都有一個(gè)最大吸收峰，最大吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)叫做最大吸收波長(zhǎng)λmax。由P242，圖9-3可以看出：不同濃度的1，10-鄰二氮雜菲亞鐵溶液對(duì)不同波長(zhǎng)的光吸收情況不同，其最大吸收波長(zhǎng)位于510nm，即吸收的是綠光，呈現(xiàn)的是相應(yīng)的互補(bǔ)色橙紅色。當(dāng)溶液濃度增大時(shí)，吸光度增大，但最大吸收波長(zhǎng)λmax不變。在吸光光度法分析中，一般都在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。二、光吸收的基本定律１、朗伯-比耳定律

1729年波格（Bouguer）建立了吸光度與吸收介質(zhì)厚度之間的關(guān)系。1760年朗伯（Lambert）用更準(zhǔn)確的數(shù)學(xué)方法表達(dá)了這一關(guān)系。1852年比耳（Beer）確定了吸光度與溶液濃度及液層厚度之間的關(guān)系，建立了光吸收的基本定律，稱為朗伯-比耳定律。當(dāng)一束平行單色光通過(guò)液層厚度為b、吸光物質(zhì)的濃度為c的單一均勻的，非散射的有色溶液時(shí),溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度成正比。A=lgI0/I=abcA：吸光度，A=lgI0/I；T：透光度，T＝I/I0

；I0:入射光強(qiáng)度；I:透射光強(qiáng)度；a稱為吸光系數(shù)；b：液層厚度（光程長(zhǎng)度），b的單位為cm；c為吸光物質(zhì)的濃度，若c的單位為g/L，則a的單位為L(zhǎng)·g-1·cm-1。當(dāng)c的單位為mol/L，則此時(shí)吸光系數(shù)稱為摩爾吸光系數(shù)，用κ表示，單位為L(zhǎng)·mol-1·cm-1，它表示1mol/L吸光物質(zhì)，溶液的厚度為1cm時(shí)溶液對(duì)光的吸收能力。A=κbc

κ=Ma

在分光光度分析的實(shí)際工作中，不能直接取1mol/L這樣高的濃度測(cè)定摩爾吸光系數(shù)κ值，而是在適宜的低濃度下測(cè)量吸光度A，然后通過(guò)計(jì)算求出κ值。

例：鐵（II）濃度為5.0×10-4g/L，與1，10-鄰二氮雜菲反應(yīng)生成橙紅色的配合物，該配合物在波長(zhǎng)508nm，比色皿厚度為2cm時(shí)，測(cè)得A=0.19，計(jì)算該配合物的a及κ。解：a=A/bc=0.19/(2×5.0×10-4)=190L·g-1·cm-1κ=A/bc=0.19/(2×5.0×10-4/55.85)=1.1×104L·moL-1cm-1或κ=Ma＝55.85×190=1.1×104L·moL-1cm-1通常認(rèn)為κ>104的顯色反應(yīng)是靈敏的，κ<103則是不靈敏的。吸光度具有加合性，即體系總的吸光度等于各組份吸光度之和（設(shè)各吸光物質(zhì)之間沒(méi)有互相作用）。A總=A1+A2+……..An

=κ1bc1+κ2bc2+…….κnbcn在吸光度的測(cè)量中，有時(shí)也用透光率或透光度表示物質(zhì)對(duì)光的吸收程度。透光率以T表示:T=I/I0

,則吸光度與透光率之間的關(guān)系為A=lgI0/I=lg1/T。2、偏離朗伯-比耳定律的原因根據(jù)朗伯-比耳定律，當(dāng)吸收池厚度保持不變，以吸光度對(duì)濃度作圖時(shí)，應(yīng)得到一條通過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)的直線，該直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線或工作曲線。在相同條件下測(cè)得試液的吸光度，從工作曲線上就可以查得試液的濃度。但在實(shí)際工作中，常常遇到偏離線性關(guān)系的現(xiàn)象，特別是在溶液濃度較高時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線向上或向下彎曲產(chǎn)生負(fù)偏離或正偏離（p244,圖9-4）。偏離朗伯-比耳定律的因素可分為物理因素和化學(xué)因素兩大類。（一）物理因素（1）單色光不純朗伯-比耳定律的基本假設(shè)是入射光為單色光，但目前光度分析儀器中，用單色器分光，用狹逢控制光譜帶的寬度，因而投射到吸收溶液的入射光，常常是一個(gè)有限寬度的光譜帶，而不是真正的單色光。由于物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收程度不同，因而引起了對(duì)朗伯-比耳定律的偏離。見(jiàn)P245，圖9-5。詳細(xì)推導(dǎo)見(jiàn)P244-245。(2)非平行光或入射光被散射若入射光不垂直通過(guò)吸收池，就使通過(guò)溶液的實(shí)際光程大于吸收池厚度。此外，入射光發(fā)生散射，實(shí)測(cè)吸光度增大，導(dǎo)致偏離朗伯-比耳定律。

（二）化學(xué)因素

(1)粒子間相互作用朗伯-比耳定律的基本假設(shè)，除要求入射光是單色光外，還假設(shè)吸收粒子之間無(wú)相互作用，即彼此是獨(dú)立的，因此稀溶液能很好地符合定律。隨濃度增大，粒子之間的相互作用增大，因此高濃度時(shí)吸光度與濃度間的關(guān)系就偏離線性關(guān)系。(2)平衡效應(yīng)、酸效應(yīng)、溶劑效應(yīng)溶液中有色化合物的平衡移動(dòng)會(huì)使最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生變化，使工作曲線產(chǎn)生彎曲。溶液的酸度、溶劑會(huì)對(duì)有色化合物的形成、分解等產(chǎn)生影響，而使吸收光譜的形狀和最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致偏離。§8-2

目視比色法及光度計(jì)的基本部件一、目視比色法用眼睛比較溶液顏色的深淺以測(cè)定物質(zhì)含量的方法稱為目視比色法。常用的目視比色法是標(biāo)準(zhǔn)系列法。這種方法就是使用一套由同種材料制成的、大小形狀相同的平底玻璃管（稱為比色管），于管中分別加入一系列不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)液，在實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，再加入等量的顯色劑，稀釋至一定刻度，然后從管口垂直向下觀察，比較待測(cè)液與標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色深淺。若待測(cè)液與某一標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色深度一致，則說(shuō)明兩者濃度相等，若待測(cè)液介于兩標(biāo)準(zhǔn)溶液之間，則取兩標(biāo)準(zhǔn)液平均值為待測(cè)液濃度。

目視法的主要缺點(diǎn)是準(zhǔn)確度不高，受主觀觀察影響較大。對(duì)于顏色不穩(wěn)定的有色溶液，標(biāo)準(zhǔn)系列不能久存，需在測(cè)定時(shí)配制，比較麻煩。但其設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，對(duì)于準(zhǔn)確度要求不高的常規(guī)分析很方便實(shí)用。二、光電比色法、分光光度法光度法與目視比色法相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)：(a)用儀器代替人眼測(cè)量，消除主觀誤差，提高準(zhǔn)確度。(b)當(dāng)溶液中有其他有色物質(zhì)干擾時(shí)，目視比色法無(wú)法進(jìn)行而光度法可選擇適當(dāng)?shù)膯紊骱蛥⒈热芤合蓴_。(c)分析大批試樣方便。光度計(jì)的基本組成：光源→單色器→吸收池→檢測(cè)器光源：可見(jiàn)區(qū)測(cè)量一般用鎢絲燈，可發(fā)出波長(zhǎng)為320nm-2500nm的連續(xù)光譜作為光源。在近紫外區(qū)測(cè)量時(shí)采用氫燈或氘燈產(chǎn)生180-375nm的連續(xù)光譜作為光源。單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置。單色器分為棱鏡或光柵（分光光度法）以及濾光片（光電比色法）等色散元件。棱鏡及光柵色散能力較強(qiáng)，可以獲得純度較高的單色光，且可方便地改變測(cè)定波長(zhǎng)，所以分光光度法的靈敏性、選擇性和準(zhǔn)確度都較光電比色法高。吸收池：亦稱比色皿，用于盛吸收試液，能透過(guò)所需光譜范圍的光線，可見(jiàn)區(qū)測(cè)定可使用玻璃比色皿。紫外區(qū)測(cè)定須選用石英比色皿。檢測(cè)器：測(cè)量吸光度時(shí)，并非直接測(cè)量透過(guò)吸收池的光強(qiáng)度，而是將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)為電流進(jìn)行測(cè)量。這種光電轉(zhuǎn)換器件稱為檢測(cè)器。有光電池和光電管兩種。檢測(cè)器要對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光有快速、靈敏的響應(yīng)，且所產(chǎn)生的光電流與照射到檢測(cè)器上的光強(qiáng)度成正比。§8-3

顯色反應(yīng)和顯色條件選擇一、顯色反應(yīng)和顯色劑

在光度分析中，將試樣中被測(cè)組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的化學(xué)反應(yīng)叫顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)可分為兩大類，即配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，而配位反應(yīng)是最主要的顯色反應(yīng)。與被測(cè)組分生成有色物質(zhì)的試劑稱為顯色劑。同一被測(cè)組分?？膳c若干種顯色劑反應(yīng)，生成多種有機(jī)化合物。選擇顯色反應(yīng)的一般標(biāo)準(zhǔn)：

（一）靈敏度高靈敏度高的顯色反應(yīng)有利于微量組分的測(cè)定。摩爾吸光系數(shù)κ的大小是顯色反應(yīng)靈敏度高低的重要標(biāo)志。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)κ值為104-105時(shí)，可認(rèn)為該反應(yīng)靈敏度較高。例：P250，從Cu2+與四種顯色劑反應(yīng)的κ值判斷，除氨外，其它幾個(gè)顯色反應(yīng)的靈敏度都較高。

（二）選擇性好一種顯色劑最好只與一種被測(cè)組分起顯色反應(yīng)，但這種試劑實(shí)際上非常少，可以通過(guò)掩蔽干擾離子或選擇顯色劑與被測(cè)組分和干擾離子生成的有色化合物的吸收峰相隔較遠(yuǎn)而獲得好的選擇性。（三）顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收這樣可使試劑空白一般較小。

（四）有色化合物的組成要恒定，化學(xué)性質(zhì)要穩(wěn)定這樣可以保證在測(cè)定過(guò)程中吸光度基本不變。二、顯色條件的選擇顯色反應(yīng)能否滿足光度法的要求，除了主要與顯色劑的性質(zhì)有關(guān)系外，控制好顯色反應(yīng)的條件也是十分重要的。顯色條件包括顯色劑用量、酸度、顯色溫度、顯色時(shí)間及干擾的消除。（一）顯色劑的用量M(被測(cè)組分)+R（顯色劑）=MR（有色化合物）

為了使顯色反應(yīng)盡可能進(jìn)行完全，加入適當(dāng)過(guò)量的顯色劑是必要的。但也不能過(guò)量太多，否則會(huì)引起副反應(yīng)，對(duì)測(cè)定反而不利。在實(shí)際工作中，顯色劑的適宜用量是通過(guò)實(shí)驗(yàn)求得的。固定被測(cè)組分的濃度和其它條件，分別加入不同量的顯色劑，測(cè)量吸光度，做吸光度–顯色劑用量曲線。一般有三種情況，見(jiàn)P251，圖9-12，其中（a）最為常見(jiàn)。

在a-b范圍內(nèi)曲線平直，吸光度出現(xiàn)穩(wěn)定值，因此可在a-b間選擇合適的顯色劑用量。（二）溶液的酸度

溶液酸度對(duì)顯色反應(yīng)的影響可從金屬離子、顯色劑及有色配合物三方面考慮。 大部分高價(jià)金屬離子都易水解，顯然，金屬離子的水解，對(duì)于顯色反應(yīng)的進(jìn)行是不利的，故溶液的酸度不能太低。

顯色劑多是有機(jī)弱酸，溶液的酸度影響著顯色劑的離解，并影響顯色反應(yīng)的完全程度。此外，許多顯色劑本身就是酸堿指示劑，溶液的酸度對(duì)顯色劑本身的顏色會(huì)產(chǎn)生改變。

溶液的酸度對(duì)有色配合物的組成及穩(wěn)定性也有影響。因此，某一顯色反應(yīng)最適宜的酸度可通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。固定待測(cè)組分及顯色劑濃度，改變?nèi)芤簆H，測(cè)定其吸光度，做吸光度-pH關(guān)系曲線，曲線平坦部分對(duì)應(yīng)的pH為適宜的酸度范圍。（三）顯色溫度

合適的顯色溫度也必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定，做A-T曲線。（四）顯色時(shí)間

有些顯色反應(yīng)較慢，需放置使其顯色完全。有些顯色配合物不夠穩(wěn)定，放置后會(huì)產(chǎn)生部分分解，導(dǎo)致吸光度降低，因此適宜的顯色時(shí)間必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。從加入顯色劑計(jì)算時(shí)間，每隔幾分鐘測(cè)定一次吸光度，繪制A-t曲線，來(lái)確定適宜的時(shí)間。（五）干擾的消除主要有三種：利用掩蔽反應(yīng)、控制酸度、分離干擾離子。三、顯色劑顯色劑主要分為無(wú)機(jī)顯色劑和有機(jī)顯色劑兩大類，其中有機(jī)顯色劑由于大多與金屬離子生成極其穩(wěn)定的鰲合物，顯色反應(yīng)的選擇性和靈敏性都較無(wú)機(jī)顯色反應(yīng)高，因而廣泛地應(yīng)用于吸光光度分析中。這部分內(nèi)容可參考P253－255。四、三元配合物由于三元配合物具有獨(dú)特的分析特性，因而在分析化學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用?！?-4

吸光度測(cè)量條件的選擇上節(jié)主要介紹了顯色反應(yīng)和顯色條件的選擇和控制對(duì)吸光光度法的影響，為使光度法有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，還必須控制適當(dāng)?shù)奈舛葴y(cè)量條件。選擇合適的測(cè)量條件，可從下面幾個(gè)方面考慮：一、入射光波長(zhǎng)入射光波長(zhǎng)一般選擇溶液具有最大吸收時(shí)的波長(zhǎng)，以便獲得較高的靈敏度。如果在最大波長(zhǎng)處有干擾物質(zhì)的強(qiáng)烈吸收，則可選擇次強(qiáng)吸收峰，見(jiàn)p256,圖9-13。二、參比溶液為了使測(cè)得