腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

關(guān)于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)1第一頁，共八十頁，2022年，8月28日2內(nèi)容綱要腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的重要性和應(yīng)用體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的特征腫瘤細(xì)胞系的建立癌細(xì)胞系的建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立癌細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的鑒定第二頁，共八十頁，2022年，8月28日3一、腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的重要性和應(yīng)用腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥檢測、腫瘤細(xì)胞和癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。第三頁，共八十頁，2022年，8月28日41、腫瘤病因和發(fā)病機(jī)制的研究體外試驗證明了物理因素（如射線）、化學(xué)因素（化學(xué)致癌劑）及生物因素（致癌病毒、EB病毒、SV40和多發(fā)瘤病毒等），均能使正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，致使正常細(xì)胞永生化或惡性化，為癌的誘發(fā)因素和環(huán)境提供了實驗依據(jù)。環(huán)境因素或藥物的致畸、致突變研究也可為該環(huán)境條件或藥物的致癌性提供實驗依據(jù)，因此細(xì)胞培養(yǎng)是癌的發(fā)生和發(fā)展研究的理想實驗研究手段。第四頁，共八十頁，2022年，8月28日52、抗癌藥物篩選方面的研究不同的癌細(xì)胞對不同的化療藥物具有不同的敏感性。采用癌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，既可研究某種藥物對不同癌細(xì)胞的敏感性，為藥物抗癌敏感譜提供依據(jù)；同時又可采用某種癌細(xì)胞開展對不同藥物，不同劑量的敏感性研究，以篩選出對該腫瘤最敏感的化療藥物和使用劑量，供人體治療時參考。第五頁，共八十頁，2022年，8月28日63、癌基因和抑癌基因方面的研究實驗證明癌的發(fā)生和發(fā)展與癌基因（原癌基因）和抑癌基因兩種基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。體外細(xì)胞培養(yǎng)既利于測定癌基因及癌基因表達(dá)產(chǎn)物，又可以測定抑癌基因的表達(dá)水平。癌細(xì)胞的體外培養(yǎng)是定量研究癌基因和抑癌基因表達(dá)調(diào)控的理想工具。第六頁，共八十頁，2022年，8月28日74、癌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和逆轉(zhuǎn)方面的研究血癌往往是由低分化的幼稚細(xì)胞的單克隆惡性增生所引起，若將血癌的體細(xì)胞通過體外誘導(dǎo)分化，促使向終未細(xì)胞分化成為功能性血液細(xì)胞，這就可使血癌患者獲得完全緩解或達(dá)到治愈的目的。這些試驗只有采用細(xì)胞培養(yǎng)法才能在短期內(nèi)觀察到細(xì)胞的變化，動物試驗很難判定藥物的直接作用，因此細(xì)胞培養(yǎng)及癌的細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞工程是進(jìn)行抗癌研究、癌細(xì)胞的惡性逆轉(zhuǎn)研究理想的實驗誘導(dǎo)模型。第七頁，共八十頁，2022年，8月28日85、癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)研究抗癌的間接效應(yīng)，往往是藥物作用于機(jī)體免疫系統(tǒng)促使免疫細(xì)胞發(fā)生對腫瘤細(xì)胞的特異性和非特異性的免疫應(yīng)答，如釋放免疫調(diào)節(jié)因子（如IFN、IL-2等）或細(xì)胞毒因子（LT、TNFα/β），以及激活殺傷腫瘤的淋巴細(xì)胞發(fā)揮殺腫瘤效應(yīng)。這種效應(yīng)均可通過體外殺腫瘤細(xì)胞試驗來證實，取同體淋巴細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，并加入IL-2/IFN-γ等，能明顯增強(qiáng)NK、TCL、LAK和TIL殺腫瘤活性。經(jīng)擴(kuò)增達(dá)一定數(shù)量后再回輸給病人，其療效明顯。第八頁，共八十頁，2022年，8月28日9二、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的特征

腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長增殖、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。第九頁，共八十頁，2022年，8月28日10培養(yǎng)中癌細(xì)胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核漿比例大。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則。1、形態(tài)第十頁，共八十頁，2022年，8月28日112、生長增殖（不受控增殖性）失去接觸抑制，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。失去錨著依賴性，可在瓊脂、甲基纖維素等支撐物上生長。低血清要求，不依賴生長因子，因其可自分泌產(chǎn)生促增殖因子。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個細(xì)胞培養(yǎng)時，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜?xì)胞強(qiáng)。第十一頁，共八十頁，2022年，8月28日123、永生性永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無限傳代而不凋亡。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系（株）都表現(xiàn)有這種性狀。永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調(diào)控。從一些具有永生性而無惡性的細(xì)胞系，如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等細(xì)胞可以證明。第十二頁，共八十頁，2022年，8月28日134、致瘤性細(xì)胞接種同種動物或裸鼠后的致瘤性是客觀反映細(xì)胞惡性程度的指標(biāo)。具體做法是：

1）收集培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗一遍；2）計數(shù)后將0.2ml含2×106～2×107個細(xì)胞的細(xì)胞懸液注射到動物皮下。約一個月左右（最短在3天后），可見注射局部有腫瘤出現(xiàn)，甚至有轉(zhuǎn)移瘤形成。經(jīng)病理組織學(xué)檢查可以確定腫瘤是否由接種的細(xì)胞產(chǎn)生。也可接種到腹腔或通過鼠尾靜脈注射。第十三頁，共八十頁，2022年，8月28日145、浸潤性浸潤性是腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)張性增殖行為，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。第十四頁，共八十頁，2022年，8月28日156、異質(zhì)性通過腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及克隆分析發(fā)現(xiàn)，同一腫瘤是由具有不同生物學(xué)特征的細(xì)胞亞群構(gòu)成的。這些細(xì)胞亞群的浸潤性、生長率、轉(zhuǎn)移能力、核型、對激素的反應(yīng)、對抗癌藥物的敏感性均不同，這種特性被稱為腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性（heterogeneity）。第十五頁，共八十頁，2022年，8月28日16同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別，有的細(xì)胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱腫瘤干細(xì)胞。只有腫瘤干細(xì)胞才是支持腫瘤生長的成分。第十六頁，共八十頁，2022年，8月28日177、細(xì)胞遺傳

大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。第十七頁，共八十頁，2022年，8月28日18體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的三個顯著基本特征：永生性不受控增殖性致瘤性第十八頁，共八十頁，2022年，8月28日19三、腫瘤細(xì)胞系的建立惡性腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)建立細(xì)胞系，包括從人或動物惡性腫瘤取材建立癌細(xì)胞系和正常細(xì)胞在體外經(jīng)理化、生物因素誘發(fā)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系可以是惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞和一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞兩種。第十九頁，共八十頁，2022年，8月28日20惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和癌細(xì)胞系一樣具有永生性和惡性表型，對此兩種來源的細(xì)胞系鑒定也是相似的，為研究惡性腫瘤提供了有用模型。一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞系只具有無限生長能力，不具有惡性細(xì)胞的表型，此種細(xì)胞系可相似于正常細(xì)胞的模型而被應(yīng)用。第二十頁，共八十頁，2022年，8月28日21癌細(xì)胞培養(yǎng)的最主要的問題是從體內(nèi)到體外環(huán)境的改變。培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，有些腫瘤在體內(nèi)生長，但在體外卻難以生長。癌細(xì)胞系的建立

第二十一頁，共八十頁，2022年，8月28日22①依賴性：腫瘤細(xì)胞雖有較強(qiáng)克隆生長力，但仍有一定的群體性或與其它細(xì)胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互依存，二是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細(xì)胞后也會同時消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細(xì)胞增殖生長的活性。腫瘤細(xì)胞在體外不易生長的可能原因：

癌細(xì)胞系的建立

第二十二頁，共八十頁，2022年，8月28日23②腫瘤細(xì)胞的自分泌也會因分散培養(yǎng)而被稀釋，達(dá)不到腫瘤生長的需求，降低腫瘤細(xì)胞的生長增殖力。③并非所有腫瘤細(xì)胞都有強(qiáng)的生長活力和長的生命周期，只有干細(xì)胞才有強(qiáng)的增殖生長能力，但這些細(xì)胞數(shù)量很少。④離體培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。癌細(xì)胞系的建立

第二十三頁，共八十頁，2022年，8月28日24（一）癌細(xì)胞原代培養(yǎng)癌細(xì)胞建系的方法和程序相似于正常細(xì)胞，包括標(biāo)本收集和處理、原代培養(yǎng)、傳代、換液、凍存、復(fù)蘇等過程。培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。癌細(xì)胞系的建立

第二十四頁，共八十頁，2022年，8月28日251、取材

人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是很好的培養(yǎng)材料。癌細(xì)胞系的建立

第二十五頁，共八十頁，2022年，8月28日26取材后盡快將癌組織進(jìn)行培養(yǎng)，一般4小時內(nèi)細(xì)胞存活最好。標(biāo)本在4℃存放，不宜超過24小時。癌細(xì)胞系的建立

第二十六頁，共八十頁，2022年，8月28日27人癌細(xì)胞建系必須要有完整的記錄，包括組織來源、病人姓名、住院號、年齡、性別、臨床診斷、病理診斷（應(yīng)明確分類分期）、術(shù)前放化療情況，為細(xì)胞建系的重要材料。為了鑒定建立的細(xì)胞系來源和生物學(xué)特性，最好留有病人正常組織和血標(biāo)本。癌細(xì)胞系的建立

第二十七頁，共八十頁，2022年，8月28日282、分離

單純的機(jī)械方法分離如吹打和過濾對癌細(xì)胞損傷小。有些腫瘤如人卵巢癌、某些神經(jīng)膠質(zhì)瘤可采用。癌組織多為較堅實的實體，腫瘤細(xì)胞包埋在大量的纖維基質(zhì)中，難以進(jìn)行機(jī)械分離。因此酶消化法是分散癌細(xì)胞的好方法。癌細(xì)胞系的建立

第二十八頁，共八十頁，2022年，8月28日29胰蛋白酶是分離細(xì)胞最常應(yīng)用的酶，但它對結(jié)締組織的消化能力有限，適合含結(jié)締組織較少的腫瘤，并且對細(xì)胞膜有損害作用，影響細(xì)胞存活。膠原蛋白酶僅對細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對上皮細(xì)胞影響不大，適于分離纖維性組織、上皮及癌組織。癌細(xì)胞系的建立

常用酶：第二十九頁，共八十頁，2022年，8月28日30膠原酶的消化方法：0.5mg／ml膠原酶處理，可在顯微鏡下觀察，纖維細(xì)胞逐漸被除去為止。用Hanks液或培養(yǎng)基洗滌，除去附著細(xì)胞的酶，再進(jìn)行接種和培養(yǎng)。癌細(xì)胞系的建立

第三十頁，共八十頁，2022年，8月28日31注意：當(dāng)腫瘤組織標(biāo)本很小，不能用酶消化獲取癌細(xì)胞時，可以用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)。癌組織中不可避免有已耗竭和壞死的細(xì)胞，在酶消化前，應(yīng)盡可能清除，以免接種后很快溶解破壞，釋放出影響癌細(xì)胞生長的有害物。癌細(xì)胞系的建立

第三十一頁，共八十頁，2022年，8月28日323、接種細(xì)胞

消化后制備的癌細(xì)胞，培養(yǎng)時應(yīng)有足夠的細(xì)胞密度，通常接種細(xì)胞濃度為5×105／ml，37℃培養(yǎng)。癌細(xì)胞系的建立

第三十二頁，共八十頁，2022年，8月28日334、成纖維細(xì)胞過度生長的去除

常采用機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法和密度梯度離心法等。用選擇培養(yǎng)基、飼養(yǎng)層等方法可以克服其過度生長。癌細(xì)胞系的建立

第三十三頁，共八十頁，2022年，8月28日34

將玻璃吸管前端在火焰上燒彎曲，用作除去成纖維細(xì)胞的工具?？稍陲@微鏡下直接刮除生長的成纖維細(xì)胞，也可事先在顯微鏡下對有成纖維細(xì)胞生長的單層培養(yǎng)瓶上做出標(biāo)記，然后按標(biāo)記刮除。刮除后，用培養(yǎng)液洗1~2次后，加入新培養(yǎng)液培養(yǎng)。如需要可多次刮除。（1）機(jī)械刮除法癌細(xì)胞系的建立

第三十四頁，共八十頁，2022年，8月28日35根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細(xì)胞相互分離。（2）反復(fù)貼壁法癌細(xì)胞系的建立

第三十五頁，共八十頁，2022年，8月28日36待細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后用胰酶消化，Hanks沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液；取編號為A、B、C三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A瓶中，置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B瓶中；向A瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C瓶中；再向B瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶兩類細(xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時可反復(fù)處理多次。癌細(xì)胞系的建立

第三十六頁，共八十頁，2022年，8月28日37（3）消化排除法先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下觀察和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后，便立即停止消化；把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。癌細(xì)胞系的建立

第三十七頁，共八十頁，2022年，8月28日38（4）膠原酶消化法

本法是利用成纖維細(xì)胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進(jìn)行選擇?？捎?.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化；用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù)。癌細(xì)胞系的建立

第三十八頁，共八十頁，2022年，8月28日39（5）其它方法聚丙烯酰胺抑制成纖維細(xì)胞生長密度梯度離心等癌細(xì)胞系的建立

第三十九頁，共八十頁，2022年，8月28日405、選擇性培養(yǎng)基

選擇性培養(yǎng)基是針對特殊細(xì)胞生長的營養(yǎng)要求設(shè)計的。在癌細(xì)胞建系中，選擇性培養(yǎng)基的應(yīng)用是提高癌細(xì)胞體外存活、抑制成纖維細(xì)胞生長的關(guān)鍵技術(shù)改進(jìn)。癌細(xì)胞系的建立

第四十頁，共八十頁，2022年，8月28日41HITES選擇培養(yǎng)基是一種改良RPMI-1640培養(yǎng)基，含有氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、雌激素、硒等成分。HITES培養(yǎng)基適合用于人小細(xì)胞肺癌建系。癌細(xì)胞系的建立

第四十一頁，共八十頁，2022年，8月28日42為了抑制成纖維細(xì)胞生長，在培養(yǎng)基中加入成纖維細(xì)胞的抗體或成纖維細(xì)胞代謝抑制成分，也可提高癌細(xì)胞系建系率。血清對上皮細(xì)胞有抑制作用有利于成纖維細(xì)胞生長。因此用低或無血清培養(yǎng)基為好。癌細(xì)胞系的建立

第四十二頁，共八十頁，2022年，8月28日436、飼養(yǎng)層

在培養(yǎng)器皿底部接種能形成接觸性抑制的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，可以有利于癌細(xì)胞生長和抑制癌組織中正常成纖維細(xì)胞過度生長。如人胎小腸細(xì)胞（FHs74Int）、小鼠3T3細(xì)胞或STO鼠胚成纖維細(xì)胞。癌細(xì)胞系的建立

第四十三頁，共八十頁，2022年，8月28日44（二）癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的換液和傳代癌細(xì)胞系的建立

1、換液通常細(xì)胞產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)上清呈黃色時，需要及時換液，癌細(xì)胞在對數(shù)期增殖迅速，每天均需換液，倍增時間較長的細(xì)胞可以隔日換一次。第四十四頁，共八十頁，2022年，8月28日452、傳代原代培養(yǎng)的癌細(xì)胞應(yīng)掌握合適的第二代傳代時間。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞生長特點不同，表現(xiàn)為重疊生長。當(dāng)在顯微鏡下觀察到上皮樣細(xì)胞匯合達(dá)50%左右，可見細(xì)胞層上堆積有圓形的細(xì)胞，指示細(xì)胞增殖活躍時就可以傳代。癌細(xì)胞系的建立

第四十五頁，共八十頁，2022年，8月28日46常規(guī)傳代：原代培養(yǎng)物第一次傳代后，需要常規(guī)傳代維持細(xì)胞在體外正常生長。每種細(xì)胞系傳代時間有所不同。通常在細(xì)胞接種后5天左右傳代一次。一瓶癌細(xì)胞傳到1~5瓶。如果計數(shù)細(xì)胞濃度，每瓶可接種2~4×105細(xì)胞。為建成永久性細(xì)胞系需長期傳代達(dá)50次以上。癌細(xì)胞系的建立

第四十六頁，共八十頁，2022年，8月28日473、凍存和復(fù)蘇

建系過程需要不斷凍存細(xì)胞以防止細(xì)胞系中斷。從第一代傳代后，就應(yīng)盡早地凍存培養(yǎng)物。且凍存不同傳代次數(shù)的細(xì)胞。凍存細(xì)胞和復(fù)蘇方法與正常細(xì)胞相同，可參照正常細(xì)胞。癌細(xì)胞系的建立

第四十七頁，共八十頁，2022年，8月28日48（三）癌細(xì)胞系建立注意事項取材應(yīng)選擇活力較好的部位，盡快培養(yǎng)且要防止污染。及時去除生長的成纖維細(xì)胞。掌握好傳代時間，細(xì)胞沒有長到足夠量時不要急于傳代。早期應(yīng)先以高濃度接種，再逐漸降低。對于增殖能力低的細(xì)胞，應(yīng)放入飼養(yǎng)層中培養(yǎng)，并加入一些促生長物質(zhì)。精心傳代、換液、避免污染，需經(jīng)半年以上的細(xì)胞培養(yǎng)，方能夠達(dá)到建立細(xì)胞系的目的。癌細(xì)胞系的建立

第四十八頁，共八十頁，2022年，8月28日49轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是指細(xì)胞發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的遺傳改變而引起恒定的表型改變。可由細(xì)胞本身基因不穩(wěn)定（嚙齒類）在傳代中自發(fā)發(fā)生，也可用放射、致突變劑、病毒以及外源基因等因素處理，引起細(xì)胞產(chǎn)生遺傳改變。第四十九頁，共八十頁，2022年，8月28日50轉(zhuǎn)化的表型變化主要有3類：

有限分裂的細(xì)胞變?yōu)闊o限增殖的細(xì)胞，獲得不死性，成為永久性細(xì)胞系。細(xì)胞不正常自主性生長，喪失接觸抑制、過飽和密度、無停泊依賴等生長特點。致瘤性，細(xì)胞可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)浸潤生長，形成腫瘤。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第五十頁，共八十頁，2022年，8月28日51致瘤性是判斷惡性轉(zhuǎn)化或一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞系最主要的指標(biāo)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第五十一頁，共八十頁，2022年，8月28日52（一）誘變轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法1、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇可從原代培養(yǎng)的正常細(xì)胞、傳代的正常細(xì)胞選擇。成纖維細(xì)胞易于轉(zhuǎn)化，上皮細(xì)胞較難。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第五十二頁，共八十頁，2022年，8月28日53化學(xué)致突變劑：常用的甲基硝基亞硝基胍（N-methy-N-nitro-Nnitrosoguanidine，MNNG）；物理方法：射線照射；病毒轉(zhuǎn)化：用EB病毒感染淋巴細(xì)胞引起轉(zhuǎn)化，SV40病毒轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞成為惡性細(xì)胞；用外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，包括癌基因如ras、mye，病毒基因如SV40LT抗原基因和端粒酶基因等。2、轉(zhuǎn)化因素轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第五十三頁，共八十頁，2022年，8月28日54（二）外源基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞程序：

選擇合適的外源基因，如SV40LT抗原基因轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞有效。構(gòu)建外源基因表達(dá)載體（質(zhì)粒），含有合適的標(biāo)記基因作為陽性傳染細(xì)胞的選擇（質(zhì)粒上有新霉素耐受基因，可用G418選擇）。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第五十四頁，共八十頁，2022年，8月28日55選擇合適的轉(zhuǎn)基因方法：化學(xué)方法最常用磷酸鈣、脂質(zhì)體、基因槍、電轉(zhuǎn)移等。選擇合適的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，易培養(yǎng)和傳代，無自發(fā)轉(zhuǎn)化能力。用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲陽性集落。證明外源基因有無表達(dá)。證明轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表型是否改變和有無致瘤性。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第五十五頁，共八十頁，2022年，8月28日561、SV40LT抗原基因轉(zhuǎn)化人的成纖維細(xì)胞

雖然鼠來源的成纖維細(xì)胞可以經(jīng)培養(yǎng)后成為長期培養(yǎng)的細(xì)胞系，但人的成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)很難成為永久細(xì)胞系。用SV40LT抗原基因轉(zhuǎn)化人的成纖維細(xì)胞是最成功的方法。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第五十六頁，共八十頁，2022年，8月28日572、轉(zhuǎn)染端粒酶基因端粒酶在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，抵消細(xì)胞分裂所致端粒縮短，是細(xì)胞獲得不死性的重要分子機(jī)制。轉(zhuǎn)染外源端粒酶基因于有限期傳代的正常細(xì)胞系，包括人上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，均可誘導(dǎo)產(chǎn)生永久性細(xì)胞系，并證明了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中端粒酶表達(dá)和端粒縮短受到了控制。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第五十七頁，共八十頁，2022年，8月28日58SV40誘導(dǎo)的不死性細(xì)胞，伴有細(xì)胞不正常分化和核型不穩(wěn)定，表現(xiàn)出對動物一定程度的致瘤性。而端粒酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞很少有核型的改變和上皮細(xì)胞分化的特點，保持更多正常細(xì)胞的表型。說明SV40LT多引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而端粒酶基因主要誘導(dǎo)細(xì)胞獲得不死性。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第五十八頁，共八十頁，2022年，8月28日593、轉(zhuǎn)基因小鼠

利用轉(zhuǎn)基因小鼠可以建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，基本方法是設(shè)計有某種基因突變、缺失、嵌入的病毒基因DNA，植入小鼠的卵母細(xì)胞。發(fā)育的轉(zhuǎn)基因小鼠將攜帶有表達(dá)某種基因的組織，從小鼠組織取材，可以獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。因此，利用轉(zhuǎn)基因小鼠是建立細(xì)胞系快速有效的方法。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第五十九頁，共八十頁，2022年，8月28日60（三）EB病毒感染B細(xì)胞EB病毒感染人外周血B淋巴細(xì)胞后，B細(xì)胞便能夠被轉(zhuǎn)化，并在體外傳代生長，建立細(xì)胞系，長期儲存在液氮，解決研究中大量細(xì)胞的來源。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第六十頁，共八十頁，2022年，8月28日61（四）轉(zhuǎn)化細(xì)胞系建立注意事項建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，通常用已建成的正常細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所以不存在上述癌細(xì)胞建系原代培養(yǎng)所存在的問題。能否建成轉(zhuǎn)化細(xì)胞，除要選擇合適的細(xì)胞系外（遺傳形狀過于穩(wěn)定的細(xì)胞不易轉(zhuǎn)化）對轉(zhuǎn)化方法的選擇也很關(guān)鍵。從轉(zhuǎn)基因小鼠組織取材建立細(xì)胞系在國外已有一些報告，該方法的應(yīng)用，不僅提高了建系率，而且使那些常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法不能建立的細(xì)胞系，通過轉(zhuǎn)基因動物可以建立攜帶某種靶基因的細(xì)胞系，為細(xì)胞培養(yǎng)和建立細(xì)胞系開拓了新的局面。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第六十一頁，共八十頁，2022年，8月28日62四、癌細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的鑒定癌細(xì)胞系的鑒定主要包括細(xì)胞組織來源和惡性特征。轉(zhuǎn)化細(xì)胞如果是正常細(xì)胞系轉(zhuǎn)化而來，不需再進(jìn)行組織來源鑒定，僅明確是否已獲得了不死性，經(jīng)確定是惡性轉(zhuǎn)化或一般轉(zhuǎn)化。第六十二頁，共八十頁，2022年，8月28日631、光鏡直接檢查2、細(xì)胞染色檢查3、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的檢查（一）細(xì)胞形態(tài)學(xué)第六十三頁，共八十頁，2022年，8月28日641、光鏡直接檢查呈多邊形上皮樣細(xì)胞；癌細(xì)胞失去接觸性抑制，呈現(xiàn)重疊生長?？梢娂?xì)胞重疊層上有折光度強(qiáng)的圓形細(xì)胞。這些特點可與正常上皮細(xì)胞區(qū)分，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可出現(xiàn)與癌細(xì)胞重疊生長相似的特點。第六十四頁，共八十頁，2022年，8月28日652、細(xì)胞染色檢查見正常細(xì)胞鑒定，除Giemsa染色外，可用瑞氏結(jié)晶紫等染色癌細(xì)胞呈多邊形，排列不規(guī)則，細(xì)胞重疊。細(xì)胞核大，核漿比例增大，深染突出、不規(guī)則，可見異常分裂象。有的上皮樣轉(zhuǎn)化細(xì)胞有相同特點。第六十五頁，共八十頁，2022年，8月28日663、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的檢查細(xì)胞核大，不規(guī)則。胞漿內(nèi)如觀察到橋粒、張力原纖維等為上皮細(xì)胞的特點，觀察到分泌顆粒是腺細(xì)胞特點，如有神經(jīng)分泌顆粒是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特點。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢查對于鑒定細(xì)胞系的組織來源和細(xì)胞惡性特點有重要意義。第六十六頁，共八十頁，2022年，8月28日67（二）染色體異常癌細(xì)胞是異倍體，存在染色體缺失、重排和移位等異常。染色體顯帶技術(shù)可用于檢查和鑒別正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞染色體差異。此技術(shù)是用特殊技術(shù)將染色單體上著色出深淺帶（band），顯示染色體的結(jié)構(gòu)。第六十七頁，共八十頁，2022年，8月28日68（三）體外生長異常癌細(xì)胞（或轉(zhuǎn)化細(xì)胞）體內(nèi)外無控制增殖是惡性細(xì)胞的特征。癌細(xì)胞喪失正常細(xì)胞接觸性抑制、停泊依賴等生長特點，表現(xiàn)為增殖加速，生長呈過飽和密度，在軟瓊脂上形成集落等不正常生長特點。通過以下實驗，對于鑒定惡性生長有重要意義。第六十八頁，共八十頁，2022年，8月28日691、生長曲線和倍增時間培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)歷一代（從上一代傳代到下一次傳代的時間），包括潛伏期、對數(shù)期、平坦期三個階段。通過計數(shù)7天細(xì)胞，可以記錄出生長階段，繪制出生長曲線，計算出細(xì)胞倍增時間。可鑒定癌細(xì)胞和正常細(xì)胞群體生長增殖速度的差異。第六十九頁，共八十頁，2022年，8月28日70癌細(xì)胞潛伏期短，對數(shù)期生長明顯，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與轉(zhuǎn)化前細(xì)胞相比較，可見轉(zhuǎn)化細(xì)胞對數(shù)期生長速度明顯增加。依據(jù)生長曲線，可計算出細(xì)胞倍增時間。倍增時間短，反映了細(xì)胞惡性生長。第七十頁，共八十頁，2022年，8月28日712、克隆效應(yīng)（cloningefficiency）克隆效應(yīng)也可稱為集落形成率（rateovcolohyformation），是檢測群體細(xì)胞中增殖細(xì)胞的比率，可反應(yīng)細(xì)胞系的增殖能力，因此是鑒別腫瘤細(xì)胞（或轉(zhuǎn)化細(xì)胞）與正常