第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一、動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)無(wú)細(xì)胞壁倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢需氧量少，對(duì)攪拌敏感聚集體形成原代細(xì)胞培養(yǎng)50代即開始退化二、生長(zhǎng)特性貼附生長(zhǎng)型：如人胚肺細(xì)胞，Hela細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞：如血液白細(xì)胞，淋巴組織細(xì)胞等三、體外培養(yǎng)特點(diǎn)營(yíng)養(yǎng)條件苛刻適應(yīng)性差,敏感培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，易污染四、體外培養(yǎng)條件溫度，37度pH：7.2-7.4氣體：氧，二氧化碳，氮?dú)鉅I(yíng)養(yǎng)條件：需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長(zhǎng)因子，其中多種成分可以由血清提供五、

體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過(guò)程

原代培養(yǎng)期；

傳代培養(yǎng)期；

衰退期

六、設(shè)備、試劑及培養(yǎng)基的選擇和配制

1.設(shè)備包括培養(yǎng)箱(特別是二氧化碳培養(yǎng)箱)、無(wú)菌室或者超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡特別是倒置顯微鏡、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶(包括無(wú)鉀玻璃的或無(wú)毒塑料的、封閉式的或螺口式的等)

2.常用試劑有抗生素、貼壁因子、生長(zhǎng)因子，還需要激素、凝集素、脂多糖(LPS)、各種營(yíng)養(yǎng)劑胰酶、膠原酶、EDTA、各種生物緩沖劑等3.培養(yǎng)基的選擇和配制

培養(yǎng)基由三部分組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清和基質(zhì)。自行配制或用現(xiàn)成的化學(xué)合成培養(yǎng)基，常用的化學(xué)合成培養(yǎng)基有Eagle(包括BME、MEM、DME等)、F10、F12、199、RPMI1640、EBSS、HBSS、McCoy‘s5a、Fischer’s、BGjb、Swim‘sS77等；培養(yǎng)基中血清的濃度范圍為5％～20％，以10％濃度最為常用；為維持某些細(xì)胞在體外的生機(jī)或增殖力，還需要事先在培養(yǎng)基中添加纖黏素、昆布氨酸、白明膠之類的貼壁因子。

一般用無(wú)水粉劑配制培養(yǎng)基，過(guò)濾和收集；七、培養(yǎng)方法

懸滴；旋轉(zhuǎn)管；灌注小室；培養(yǎng)瓶；培養(yǎng)板原代細(xì)胞培養(yǎng)——以乳鼠腎細(xì)胞原代單層靜置培養(yǎng)為例：

1、操作者首先進(jìn)行手的清洗與消毒，再將實(shí)驗(yàn)用品放在合適的位置

2、配液：（1）細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液的配置：0．5％LH液；犢牛血清；1萬(wàn)單位/ml青、鏈霉素；7.4%NaHCO3

（2）平衡鹽液－Hank液的調(diào)節(jié)；（3）調(diào)胰蛋白酶的pH值；

3、處死動(dòng)物，取腎，剪腎：將洗過(guò)的腎塊轉(zhuǎn)移入無(wú)菌的青霉素瓶；將腎剪成1立方毫米大小的塊，組織塊的大小應(yīng)盡量均勻一致，再用Hank液洗滌2～3次，直到液體澄清為止；

4、消化及分散組織塊，可將分散的細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)滅菌的紗布（或不銹鋼網(wǎng)）進(jìn)行過(guò)濾，以除去部分較大的組織碎片。5、計(jì)數(shù)與釋稀：每ml含細(xì)胞30～50萬(wàn)為宜。6、分裝與培養(yǎng)7、觀察：置于37℃培養(yǎng)的細(xì)胞，需逐日進(jìn)行觀察，主要觀察：

（1）培養(yǎng)物是否污染，如培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且混濁，表示已經(jīng)被污染。（2）細(xì)胞生長(zhǎng)狀況與培養(yǎng)液顏色的變化，如培養(yǎng)液變?yōu)樽霞t色，一般細(xì)胞生長(zhǎng)不好?？赡苁瞧咳瓷w緊或營(yíng)養(yǎng)液pH過(guò)高。（3）培養(yǎng)液若變?yōu)榻奂t色，一般顯示細(xì)胞生長(zhǎng)良好。

※待細(xì)胞已基本長(zhǎng)成致密單層時(shí)，此時(shí)即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。八、組織培養(yǎng)的污染、檢測(cè)和排除

1.污染的主要途徑和媒介的發(fā)生

空氣、清洗消毒、操作、血清、組織

2.組織細(xì)胞污染的檢測(cè)

真菌污染細(xì)菌污染支原體污染

3.組織細(xì)胞污染的排除

抗生素除菌法、加溫除菌法、動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法九、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用1962年開始，用于生物醫(yī)學(xué)研究，生產(chǎn)酶制劑，生長(zhǎng)因子，疫苗，單抗等.如：※單克隆抗體技術(shù)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用;※胚胎移植和核移植技術(shù)在畜牧業(yè)中的應(yīng)用※動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)生產(chǎn)次生產(chǎn)物※動(dòng)物克隆技術(shù)的應(yīng)用潛力單克隆抗體

1975年英國(guó)科學(xué)家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞融合，成功建立了單克隆抗體技術(shù)，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。

每個(gè)B淋巴細(xì)胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對(duì)某種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細(xì)胞可以無(wú)限增殖，因此雜交瘤細(xì)胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)條件下分泌大量單克隆抗體。

單克隆抗體技術(shù)的最主要優(yōu)點(diǎn)是可以用不純的抗原分子大量制備純一的單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體示意圖第三節(jié)克隆技術(shù)及其應(yīng)用的簡(jiǎn)介

一、克隆技術(shù)的分類

根據(jù)克隆的層次分為基因克隆、細(xì)胞克隆、組織克隆、器官克隆及完整的生物體克隆。(1)基因克隆是指通過(guò)分子重組技術(shù)或是擴(kuò)增（如PCR擴(kuò)增）DNA片斷的相同序列的大量拷貝

，它是深入研究基因的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)化、表達(dá)、調(diào)控及進(jìn)行基因改造的基礎(chǔ)。(2)細(xì)胞克隆、組織克隆和器官克隆是克隆技術(shù)在細(xì)胞水平、組織水平和器官水平上的應(yīng)用，可用來(lái)生產(chǎn)大量相同的細(xì)胞、組織和器官。分為植物克隆和動(dòng)物克隆等

生物繁殖后代通常是以精、卵細(xì)胞結(jié)合的有性生殖方式進(jìn)行。通過(guò)營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞繁殖個(gè)體的方法稱為無(wú)性繁殖?？寺∈侵鸽x體條件下的無(wú)性繁殖。1981年Illmenses

率先報(bào)告用小鼠幼胚細(xì)胞核克隆出正常小鼠。隨后，1984年Willadsen用未成熟羊胚細(xì)胞核克隆出一頭羊。

英國(guó)PPI生物技術(shù)的羅斯林（Roslin）研究所的維爾穆特(Wilmut)博士1997年2月27日在世界著名權(quán)威雜志《Nature》宣布的用乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核克隆出一只綿羊“

多莉

(Dolly)”的消息?！岸嗬颉钡恼Q生，既說(shuō)明了體細(xì)胞核的遺傳全能性，也翻開了人類以體細(xì)胞核競(jìng)相克隆哺乳動(dòng)物的新篇章。此項(xiàng)技術(shù)因而榮登美國(guó)《Science》周刊評(píng)出的1997年十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)

的榜首。

二、克隆過(guò)程

①科學(xué)家選取了三只母羊，通過(guò)顯微操作先將一只母羊的卵細(xì)胞核質(zhì)分離，使卵失去原有的

遺傳物質(zhì)，僅余細(xì)胞質(zhì)；②然后將另一只6歲母羊的乳腺細(xì)胞的核與之融合，形成一個(gè)含有

新遺傳物質(zhì)的卵細(xì)胞；③使核質(zhì)融合的卵在體外