現(xiàn)代光分析-6 標(biāo)記方法

第四章

熒光法在生物分析中的應(yīng)用FluorescenceProbesinBioanalysis書

名

分子探針與檢測試劑作

者

張華山王紅趙媛媛出版社

科學(xué)出版社書

號

03-009763-7叢

書

分析化學(xué)新方法新技術(shù)叢書責(zé)任編輯操時(shí)杰開本A5出版時(shí)間2002年8月字?jǐn)?shù)475千字裝

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盤否頁數(shù)479蛋白質(zhì)、核酸、多糖的熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記物和熒光探針有機(jī)熒光染料熒光納米粒子綠色熒光蛋白為什么要標(biāo)記？Fluorescein丹磺酰氯例一FITC熒光素也存在一些缺點(diǎn)如熒光素共軛體不穩(wěn)定,熒光測試儀的強(qiáng)激光,使之發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的光漂白,導(dǎo)致熒光信號的迅速下降。熒光素在水溶液中以離子形式存在,吸收及熒光性質(zhì)易受pH值影響。與標(biāo)記物共軛連接后,易發(fā)生猝滅。Rhodamine6G(555nm)RhodamineB(565nm)羅丹明染料分子呈剛性平面,有較高的熒光量子產(chǎn)率,故熒光較強(qiáng),已成為商品化染料但位移較小,吸收區(qū)域的低能量部分與發(fā)射區(qū)的高能量部分重疊,導(dǎo)致染料的激發(fā)輻射損失。例二例三丹磺酰氯(二甲氨基萘磺酰氯)是一種強(qiáng)熒光劑，可用于測定肽鏈的氨基末端，它能專一地與鏈N-端α-氨基反應(yīng)生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很強(qiáng)的熒光，可直接用電泳法或?qū)游龇ㄨb定出N-端是何種氨基酸。溶于丙酮，苯，二惡烷等有機(jī)溶劑，不溶于水。DNS-Cl350nm/520nm對溶劑的極性敏感。一、蛋白質(zhì)的活性功能團(tuán)1、氨基（賴氨酸-氨基，N-末端-氨基）NH2(CH2)4CH(NH2)COOH賴氨酸所有的蛋白質(zhì)和多肽都含有氨基，而且它們較易發(fā)生反應(yīng)，所以通過氨基進(jìn)行化學(xué)修飾是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)標(biāo)記的最常用的方法。2、巰基（胱氨酸、半胱氨酸）半胱氨酸的巰基的親核性比氨基強(qiáng)，pH中性時(shí)反應(yīng)活性很高。3、羧基、酚羥基羧基、酚羥基在水溶液中反應(yīng)活性一般較低。標(biāo)記過程利用蛋白質(zhì)的活性功能團(tuán)對蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記標(biāo)記后不影響蛋白質(zhì)的功能，標(biāo)記后對熒光分子的熒光性質(zhì)影響不大。NH2+FluNH2Flu1.Amine-ReactiveProbes

fluorescein-5-isothiocyanate(FITC'IsomerI')MolecularFormula:C21H11NO5S

MolecularWeight:389.38

二、標(biāo)記蛋白質(zhì)的有機(jī)熒光染料異硫氰基熒光素理想pH8~9fluorescein-6-isothiocyanate(FITC'IsomerII')MolecularFormula:C21H11NO5S

MolecularWeight:389.38

異硫氰基熒光素OregonGreen?488carboxylicacidMolecularFormula:C21H10F2O7

MolecularWeight:412.30

CASNumber/Name:N/A

RhodamineRed?-X,succinimidylesterMolecularFormula:C37H44N4O10S2

MolecularWeight:768.90

N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）理想pH9~9.54-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonylchloride(dabsylchloride)MolecularFormula:C14H14ClN3O2S

MolecularWeight:323.80

磺酰氯高活性基團(tuán)，在水中不穩(wěn)定，與許多基團(tuán)（氨基，巰基，酚羥基，咪唑）反應(yīng)，選著性差．TexasRed?sulfonylchlorideMolecularFormula:C31H29ClN2O6S2

MolecularWeight:625.15

Spectra—TexasRed-BSAconjugateAbsorptionandfluorescenceemissionspectraoftheTexasRedconjugateofbovineserumalbumin(A-23017)inpH7.0buffer.

Figure1.39Normalizedfluorescenceemissionspectraofgoatanti–mouseIgGantibodyconjugatesoffluorescein(FL),tetramethylrhodamine(TMR)andtheTexasRed(TR)dyes,shownbydashedlines(---),comparedtogoatanti–mouseIgGconjugatesofBODIPYFL,BODIPYTMRandBODIPYTRdyes,respectively,shownbysolidlines(—).

Figure1.23ComparisonofthefluorescencespectraoftheAlexaFluor680andCy5.5dyes.Spectrahavebeennormalizedtothesameintensityforcomparisonpurposes.

Cy3andCy5arereactivewater-solublefluorescentdyesofthecyaninedyefamily.（花青染料）1989

Cy3isexcitedmaximallyat550nmandemitsmaximallyat570

nm,inthegreenpartofthespectrum;quantumyieldinPBSbufferis0.04FW=766.Cy5isexcitedmaximallyat649nmandemitsmaximallyat670

nm,inthefarredpartofthespectrum;quantumyieldis0.28.FW=792.Theyarealsousedtolabelproteinsandnucleicacidforvariousstudies.標(biāo)記方法碳二亞胺法：

碳二亞胺（R1N=C=NR2）能使羧基和氨基間脫水形成酰胺鍵。1—乙基—3（3—二甲氨丙基）碳二亞胺（EDC）是一種常用的水溶性碳二亞胺?；旌纤狒ǎ?/p>

偶聯(lián)物一方的羧基與氯甲酸異丁酯反應(yīng)，形成混合酸酐。這是一種非?；顫姷闹虚g體，它能與氨基化合物反應(yīng)形成酰胺鍵。

戊二醛法：戊二醛是一個(gè)雙功能試劑，它的二個(gè)醛基能分別與標(biāo)記化合物及被標(biāo)記物的氨基形成Schiff鍵。

過碘酸法；

此法的必要條件是偶聯(lián)物一方含糖，另一方含氨基。糖的羥基被氧化成醛基，然后與氨基作用形成Schiff鍵。

N—羥基琥珀亞胺活化法：不少抗原含有

羧基，可通過N—羥基琥珀酰亞胺活化，在與氨基化合物偶聯(lián)。

琥珀酸酐法：

偶聯(lián)物一方的羥基與琥珀酸酐反應(yīng)，得到一個(gè)琥珀酸半酯，通過這個(gè)帶羧基的中間體，與氨基形成酰胺鍵。

O—（羧甲基）羥胺法：

抗原的酮基（或引進(jìn)的酮基）與O—（羧甲基）羥胺反應(yīng)，產(chǎn)生O—羧甲肟衍生物，這個(gè)中間產(chǎn)物的羧基與另一化合物的氨基結(jié)合。

重氮化法；芳香胺的重氮鹽能以蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上的酚羥基的鄰位反應(yīng)，形成偶氮化合物。

2.Thiol-ReactiveProbesInproteins,thiolgroups(alsocalledmercaptansorsulfhydryls)arepresentincysteineresidues.Thiolscanalsobegeneratedbyselectivelyreducingcystinedisulfideswithreagentssuchasdithiothreitol.

StructuralcomparisonofthereducingagentsDTTandTCEP.UnlikeDTT(dithiothreitol,D1532),TCEP(tris-(2-carboxyethyl)phosphine,hydrochloride;T2556)doesnotcontainafreethiol,andthereforemaynotrequireremovalbeforereactionwithathiol-reactiveprobe.

Reactionofathiolwithanalkylhalide.

Reactionofathiolwithamaleimide(順丁烯二酰亞胺).

標(biāo)記納米粒子三、核酸的熒光分析標(biāo)記寡核苷酸分子燈標(biāo)（MolecularBeacon）1996年,SanjayTyagi等設(shè)計(jì)了一種可以特異識別核酸序列的新型熒光探針,這種熒光探針通過與核酸靶分子進(jìn)行雜交后發(fā)生構(gòu)象的變化而發(fā)出熒光,他們將其命名為分子信標(biāo)(MolecularBeacon)。分子信標(biāo)因其具有背景信號低,靈敏度高、特異性識別性強(qiáng)、操作簡單以及不必與未反應(yīng)的探針分離即可實(shí)時(shí)檢測等優(yōu)點(diǎn),在短短的幾年內(nèi)得到了迅速的發(fā)展,并已廣泛地應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測聚合酶鏈反應(yīng)、基因突變的快速分析、DNA、RNA的檢測、DNA/RNA雜交的動(dòng)力學(xué)研究以及DNA/蛋白質(zhì)相互作用研究等,其應(yīng)用領(lǐng)域仍在不斷拓展。分子燈標(biāo)（MolecularBeacon）是一種由寡聚核酸形成的發(fā)夾型分子。它包括一個(gè)環(huán)(loop)干(莖stem)結(jié)構(gòu),其中環(huán)由與靶分子互補(bǔ)的核酸堿基序列組成,一般有15～20個(gè)堿基;干為兩列互補(bǔ)的堿基序列,一般是5～7個(gè)堿基對。分子信標(biāo)之所以能通過構(gòu)象改變而發(fā)熒光是基于它內(nèi)在的環(huán)莖結(jié)構(gòu)和熒光標(biāo)記特征:在分子信標(biāo)中,熒光基團(tuán)共價(jià)地連接在其干部分的一個(gè)末端,猝滅基團(tuán)也靠共價(jià)鍵連接在干部分的另一末端。分子信標(biāo)未與靶分子結(jié)合時(shí),由于干部分兩列互補(bǔ)堿基對之間的氫鍵連接,使得熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)距離很近,熒光基團(tuán)將能量轉(zhuǎn)移給猝滅基團(tuán)而發(fā)生熒光猝滅;當(dāng)分子信標(biāo)與序列互補(bǔ)的靶分子結(jié)合時(shí),環(huán)與靶序列雜交而形成了比干部分更長更穩(wěn)定的堿基對氫鍵連接,分子信標(biāo)發(fā)生構(gòu)型的變化,干部分被打開,從而使熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán),熒光基團(tuán)產(chǎn)生的熒光得到恢復(fù)。分子信標(biāo)這一熒光信號傳導(dǎo)機(jī)制是基于熒光能量轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)上的。當(dāng)兩個(gè)基團(tuán)的距離在1～10nm,且能量給體(熒光基團(tuán))的發(fā)射光譜與能量受體(猝滅基團(tuán))的吸收光譜有較大程度的重疊時(shí),則可發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。4，4′-二甲基胺基苯基)偶氮苯甲酸(DABCYL)可作為分子信標(biāo)通用的猝滅基團(tuán),它對多種發(fā)射光譜不同的熒光基團(tuán)都有很好的猝滅作用。非標(biāo)記的嵌插性核酸探針溴化乙錠(ethidiumbromide,EB)是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA。溴化乙錠用標(biāo)準(zhǔn)302nm紫外光透射儀激發(fā)并放射出橙紅色信號，可用Polaroid底片或帶CCD成像頭的凝膠成像處理系統(tǒng)拍攝。溴化乙錠含有一個(gè)可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)。它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。在高離子強(qiáng)度的飽和溶液中，大約每2.5個(gè)堿基插入一個(gè)溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其平面基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作用。這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合DNA的染料高出20-30倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠（0.5ug/ml）時(shí)，可以檢測到少至10ng的DNA條帶。

溴化乙錠可以嵌入堿基分子中，導(dǎo)致錯(cuò)配。溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑，具有高致癌性！SYBRGreenI和溴化乙啶（EB）Ames測試結(jié)果顯示EB容易引起有機(jī)體突變。(Singeretal.,Mutat.Res.199,439:37-47.)溴化乙錠的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)對含EB的溶液進(jìn)行凈化處理再行棄置，以避免污染環(huán)境和危害人體健康。四、熒光納米粒子二氧化硅熒光納米粒子二氧化硅本身不具有熒光，可以通過包埋或摻雜的方法制備具有熒光的以二氧化硅為基質(zhì)的納米粒子。優(yōu)點(diǎn)：1、二氧化硅具有水溶性；2、當(dāng)溶劑發(fā)生變化時(shí)，粒徑不變（不溶脹）；3、二氧化硅透明，發(fā)射、激發(fā)光透過不受影響；4、二氧化硅納米粒子中染料的熒光性質(zhì)保持不變；5、二氧化硅具有生物兼容性，且易修飾、標(biāo)記；6、二氧化硅基質(zhì)對染料起到了阻止與外界氧分子的直接接觸，防止了染料的光漂白，因此具有很好的光穩(wěn)定性Acrylamide＊Mlecularprobe＊ReferenceDye＊DextranLiquidPolymer(PVCorDecylethacrylate)＊Lonophore＆indicator＊PEGSol-Gel＊Enzyme＊ReferenceDye＊PEGIonH+BoundTargetslonophoreFluorescentIndicatorEnzymeSensitizingDyeTargetingAborPeptideIonicAdditivehhhPEBBLE示意圖PEBBLE常用基質(zhì)量子點(diǎn)量子點(diǎn)熒光半導(dǎo)體材料中，微小晶體通常被稱作量子點(diǎn)（quantumdot)。這種量子點(diǎn)可以把電子鎖定在一個(gè)非常微小的三維空間內(nèi)，當(dāng)有一束光照射上去的時(shí)候電子會受到激發(fā)跳躍到更高的能級。當(dāng)這些電子回到原來較低的能級的時(shí)候，會發(fā)射出波長一定的光束?，F(xiàn)在量子點(diǎn)被大量地應(yīng)用在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，幫助研究人員確定生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或活動(dòng)。當(dāng)量子點(diǎn)被光脈沖照射的時(shí)候會產(chǎn)生各種各樣的顏色，不太高級的光學(xué)顯微鏡就可以觀察到這種彩色光。如果把量子點(diǎn)附著在需要研究的對象上，研究人員就可以了解物質(zhì)的活動(dòng)。不但如此，量子點(diǎn)還可以用來追蹤藥物在體內(nèi)的活動(dòng)、或是研究患者體內(nèi)細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)。量子點(diǎn)可以產(chǎn)生多種顏色的光，光的顏色取決于量子點(diǎn)的尺寸。研究人員已經(jīng)制造出可以產(chǎn)生超過12種顏色熒光的量子點(diǎn)，而且理論上講可以產(chǎn)生出更多的顏色。這樣，當(dāng)某個(gè)波長的激光對多種量子點(diǎn)進(jìn)行照射激發(fā)的時(shí)候，可以同時(shí)觀察到多個(gè)顏色，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)測量。生物研究中所使用的量子點(diǎn)需要覆蓋上一層物質(zhì)以便可以追蹤特定的生物分子，可以應(yīng)用在醫(yī)學(xué)成像技術(shù)中。國外的科學(xué)家已經(jīng)應(yīng)用量子點(diǎn)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞憑借活體成像系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)的研究

量子點(diǎn)(QuantumDots，QDs)，也稱半導(dǎo)體納米微晶體(SemiconductorNanocrystal，NCs)，是一種零維的納米材料。主要由II-VI族元素和III-V族元素組成，其直徑通常在幾到十幾納米之間。量子點(diǎn)概述目前研究較多的是CdTe、CdSe、CdS、ZnS等量子點(diǎn)。

量子點(diǎn)具有許多體相材料和分子級別的材料所沒有的性質(zhì)，即量子效應(yīng)，表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：宏觀量子隧道效應(yīng)量子效應(yīng)表面效應(yīng)小尺寸效應(yīng)量子尺寸效應(yīng)介電限域效應(yīng)量子點(diǎn)的量子效應(yīng)量子點(diǎn)的光學(xué)性