現(xiàn)代光分析-6 標(biāo)記方法

第四章

熒光法在生物分析中的應(yīng)用FluorescenceProbesinBioanalysis書

名

分子探針與檢測試劑作

者

張華山王紅趙媛媛出版社

科學(xué)出版社書

號

03-009763-7叢

書

分析化學(xué)新方法新技術(shù)叢書責(zé)任編輯操時杰開本A5出版時間2002年8月字數(shù)475千字裝

幀平裝印張0帶

盤否頁數(shù)479蛋白質(zhì)、核酸、多糖的熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記物和熒光探針有機熒光染料熒光納米粒子綠色熒光蛋白為什么要標(biāo)記？Fluorescein丹磺酰氯例一FITC熒光素也存在一些缺點如熒光素共軛體不穩(wěn)定,熒光測試儀的強激光,使之發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的光漂白,導(dǎo)致熒光信號的迅速下降。熒光素在水溶液中以離子形式存在,吸收及熒光性質(zhì)易受pH值影響。與標(biāo)記物共軛連接后,易發(fā)生猝滅。Rhodamine6G(555nm)RhodamineB(565nm)羅丹明染料分子呈剛性平面,有較高的熒光量子產(chǎn)率,故熒光較強,已成為商品化染料但位移較小,吸收區(qū)域的低能量部分與發(fā)射區(qū)的高能量部分重疊,導(dǎo)致染料的激發(fā)輻射損失。例二例三丹磺酰氯(二甲氨基萘磺酰氯)是一種強熒光劑，可用于測定肽鏈的氨基末端，它能專一地與鏈N-端α-氨基反應(yīng)生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很強的熒光，可直接用電泳法或?qū)游龇ㄨb定出N-端是何種氨基酸。溶于丙酮，苯，二惡烷等有機溶劑，不溶于水。DNS-Cl350nm/520nm對溶劑的極性敏感。一、蛋白質(zhì)的活性功能團1、氨基（賴氨酸-氨基，N-末端-氨基）NH2(CH2)4CH(NH2)COOH賴氨酸所有的蛋白質(zhì)和多肽都含有氨基，而且它們較易發(fā)生反應(yīng)，所以通過氨基進行化學(xué)修飾是實現(xiàn)蛋白質(zhì)標(biāo)記的最常用的方法。2、巰基（胱氨酸、半胱氨酸）半胱氨酸的巰基的親核性比氨基強，pH中性時反應(yīng)活性很高。3、羧基、酚羥基羧基、酚羥基在水溶液中反應(yīng)活性一般較低。標(biāo)記過程利用蛋白質(zhì)的活性功能團對蛋白質(zhì)進行標(biāo)記標(biāo)記后不影響蛋白質(zhì)的功能，標(biāo)記后對熒光分子的熒光性質(zhì)影響不大。NH2+FluNH2Flu1.Amine-ReactiveProbes

fluorescein-5-isothiocyanate(FITC'IsomerI')MolecularFormula:C21H11NO5S

MolecularWeight:389.38

二、標(biāo)記蛋白質(zhì)的有機熒光染料異硫氰基熒光素理想pH8~9fluorescein-6-isothiocyanate(FITC'IsomerII')MolecularFormula:C21H11NO5S

MolecularWeight:389.38

異硫氰基熒光素OregonGreen?488carboxylicacidMolecularFormula:C21H10F2O7

MolecularWeight:412.30

CASNumber/Name:N/A

RhodamineRed?-X,succinimidylesterMolecularFormula:C37H44N4O10S2

MolecularWeight:768.90

N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）理想pH9~9.54-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonylchloride(dabsylchloride)MolecularFormula:C14H14ClN3O2S

MolecularWeight:323.80

磺酰氯高活性基團，在水中不穩(wěn)定，與許多基團（氨基，巰基，酚羥基，咪唑）反應(yīng)，選著性差．TexasRed?sulfonylchlorideMolecularFormula:C31H29ClN2O6S2

MolecularWeight:625.15

Spectra—TexasRed-BSAconjugateAbsorptionandfluorescenceemissionspectraoftheTexasRedconjugateofbovineserumalbumin(A-23017)inpH7.0buffer.

Figure1.39Normalizedfluorescenceemissionspectraofgoatanti–mouseIgGantibodyconjugatesoffluorescein(FL),tetramethylrhodamine(TMR)andtheTexasRed(TR)dyes,shownbydashedlines(---),comparedtogoatanti–mouseIgGconjugatesofBODIPYFL,BODIPYTMRandBODIPYTRdyes,respectively,shownbysolidlines(—).

Figure1.23ComparisonofthefluorescencespectraoftheAlexaFluor680andCy5.5dyes.Spectrahavebeennormalizedtothesameintensityforcomparisonpurposes.

Cy3andCy5arereactivewater-solublefluorescentdyesofthecyaninedyefamily.（花青染料）1989

Cy3isexcitedmaximallyat550nmandemitsmaximallyat570

nm,inthegreenpartofthespectrum;quantumyieldinPBSbufferis0.04FW=766.Cy5isexcitedmaximallyat649nmandemitsmaximallyat670

nm,inthefarredpartofthespectrum;quantumyieldis0.28.FW=792.Theyarealsousedtolabelproteinsandnucleicacidforvariousstudies.標(biāo)記方法碳二亞胺法：

碳二亞胺（R1N=C=NR2）能使羧基和氨基間脫水形成酰胺鍵。1—乙基—3（3—二甲氨丙基）碳二亞胺（EDC）是一種常用的水溶性碳二亞胺?；旌纤狒ǎ?/p>

偶聯(lián)物一方的羧基與氯甲酸異丁酯反應(yīng)，形成混合酸酐。這是一種非?；顫姷闹虚g體，它能與氨基化合物反應(yīng)形成酰胺鍵。

戊二醛法：戊二醛是一個雙功能試劑，它的二個醛基能分別與標(biāo)記化合物及被標(biāo)記物的氨基形成Schiff鍵。

過碘酸法；

此法的必要條件是偶聯(lián)物一方含糖，另一方含氨基。糖的羥基被氧化成醛基，然后與氨基作用形成Schiff鍵。

N—羥基琥珀亞胺活化法：不少抗原含有

羧基，可通過N—羥基琥珀酰亞胺活化，在與氨基化合物偶聯(lián)。

琥珀酸酐法：

偶聯(lián)物一方的羥基與琥珀酸酐反應(yīng)，得到一個琥珀酸半酯，通過這個帶羧基的中間體，與氨基形成酰胺鍵。

O—（羧甲基）羥胺法：

抗原的酮基（或引進的酮基）與O—（羧甲基）羥胺反應(yīng)，產(chǎn)生O—羧甲肟衍生物，這個中間產(chǎn)物的羧基與另一化合物的氨基結(jié)合。

重氮化法；芳香胺的重氮鹽能以蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上的酚羥基的鄰位反應(yīng)，形成偶氮化合物。

2.Thiol-ReactiveProbesInproteins,thiolgroups(alsocalledmercaptansorsulfhydryls)arepresentincysteineresidues.Thiolscanalsobegeneratedbyselectivelyreducingcystinedisulfideswithreagentssuchasdithiothreitol.

StructuralcomparisonofthereducingagentsDTTandTCEP.UnlikeDTT(dithiothreitol,D1532),TCEP(tris-(2-carboxyethyl)phosphine,hydrochloride;T2556)doesnotcontainafreethiol,andthereforemaynotrequireremovalbeforereactionwithathiol-reactiveprobe.

Reactionofathiolwithanalkylhalide.

Reactionofathiolwithamaleimide(順丁烯二酰亞胺).

標(biāo)記納米粒子三、核酸的熒光分析標(biāo)記寡核苷酸分子燈標(biāo)（MolecularBeacon）1996年,SanjayTyagi等設(shè)計了一種可以特異識別核酸序列的新型熒光探針,這種熒光探針通過與核酸靶分子進行雜交后發(fā)生構(gòu)象的變化而發(fā)出熒光,他們將其命名為分子信標(biāo)(MolecularBeacon)。分子信標(biāo)因其具有背景信號低,靈敏度高、特異性識別性強、操作簡單以及不必與未反應(yīng)的探針分離即可實時檢測等優(yōu)點,在短短的幾年內(nèi)得到了迅速的發(fā)展,并已廣泛地應(yīng)用于實時監(jiān)測聚合酶鏈反應(yīng)、基因突變的快速分析、DNA、RNA的檢測、DNA/RNA雜交的動力學(xué)研究以及DNA/蛋白質(zhì)相互作用研究等,其應(yīng)用領(lǐng)域仍在不斷拓展。分子燈標(biāo)（MolecularBeacon）是一種由寡聚核酸形成的發(fā)夾型分子。它包括一個環(huán)(loop)干(莖stem)結(jié)構(gòu),其中環(huán)由與靶分子互補的核酸堿基序列組成,一般有15～20個堿基;干為兩列互補的堿基序列,一般是5～7個堿基對。分子信標(biāo)之所以能通過構(gòu)象改變而發(fā)熒光是基于它內(nèi)在的環(huán)莖結(jié)構(gòu)和熒光標(biāo)記特征:在分子信標(biāo)中,熒光基團共價地連接在其干部分的一個末端,猝滅基團也靠共價鍵連接在干部分的另一末端。分子信標(biāo)未與靶分子結(jié)合時,由于干部分兩列互補堿基對之間的氫鍵連接,使得熒光基團與猝滅基團距離很近,熒光基團將能量轉(zhuǎn)移給猝滅基團而發(fā)生熒光猝滅;當(dāng)分子信標(biāo)與序列互補的靶分子結(jié)合時,環(huán)與靶序列雜交而形成了比干部分更長更穩(wěn)定的堿基對氫鍵連接,分子信標(biāo)發(fā)生構(gòu)型的變化,干部分被打開,從而使熒光基團遠離猝滅基團,熒光基團產(chǎn)生的熒光得到恢復(fù)。分子信標(biāo)這一熒光信號傳導(dǎo)機制是基于熒光能量轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)上的。當(dāng)兩個基團的距離在1～10nm,且能量給體(熒光基團)的發(fā)射光譜與能量受體(猝滅基團)的吸收光譜有較大程度的重疊時,則可發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。4，4′-二甲基胺基苯基)偶氮苯甲酸(DABCYL)可作為分子信標(biāo)通用的猝滅基團,它對多種發(fā)射光譜不同的熒光基團都有很好的猝滅作用。非標(biāo)記的嵌插性核酸探針溴化乙錠(ethidiumbromide,EB)是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA。溴化乙錠用標(biāo)準(zhǔn)302nm紫外光透射儀激發(fā)并放射出橙紅色信號，可用Polaroid底片或帶CCD成像頭的凝膠成像處理系統(tǒng)拍攝。溴化乙錠含有一個可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個三環(huán)平面基團。它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。在高離子強度的飽和溶液中，大約每2.5個堿基插入一個溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其平面基團與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作用。這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合DNA的染料高出20-30倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠（0.5ug/ml）時，可以檢測到少至10ng的DNA條帶。

溴化乙錠可以嵌入堿基分子中，導(dǎo)致錯配。溴化乙錠是強誘變劑，具有高致癌性！SYBRGreenI和溴化乙啶（EB）Ames測試結(jié)果顯示EB容易引起有機體突變。(Singeretal.,Mutat.Res.199,439:37-47.)溴化乙錠的毒性實驗結(jié)束后，應(yīng)對含EB的溶液進行凈化處理再行棄置，以避免污染環(huán)境和危害人體健康。四、熒光納米粒子二氧化硅熒光納米粒子二氧化硅本身不具有熒光，可以通過包埋或摻雜的方法制備具有熒光的以二氧化硅為基質(zhì)的納米粒子。優(yōu)點：1、二氧化硅具有水溶性；2、當(dāng)溶劑發(fā)生變化時，粒徑不變（不溶脹）；3、二氧化硅透明，發(fā)射、激發(fā)光透過不受影響；4、二氧化硅納米粒子中染料的熒光性質(zhì)保持不變；5、二氧化硅具有生物兼容性，且易修飾、標(biāo)記；6、二氧化硅基質(zhì)對染料起到了阻止與外界氧分子的直接接觸，防止了染料的光漂白，因此具有很好的光穩(wěn)定性Acrylamide＊Mlecularprobe＊ReferenceDye＊DextranLiquidPolymer(PVCorDecylethacrylate)＊Lonophore＆indicator＊PEGSol-Gel＊Enzyme＊ReferenceDye＊PEGIonH+BoundTargetslonophoreFluorescentIndicatorEnzymeSensitizingDyeTargetingAborPeptideIonicAdditivehhhPEBBLE示意圖PEBBLE常用基質(zhì)量子點量子點熒光半導(dǎo)體材料中，微小晶體通常被稱作量子點（quantumdot)。這種量子點可以把電子鎖定在一個非常微小的三維空間內(nèi)，當(dāng)有一束光照射上去的時候電子會受到激發(fā)跳躍到更高的能級。當(dāng)這些電子回到原來較低的能級的時候，會發(fā)射出波長一定的光束?，F(xiàn)在量子點被大量地應(yīng)用在生物學(xué)實驗室內(nèi)，幫助研究人員確定生物細胞的結(jié)構(gòu)或活動。當(dāng)量子點被光脈沖照射的時候會產(chǎn)生各種各樣的顏色，不太高級的光學(xué)顯微鏡就可以觀察到這種彩色光。如果把量子點附著在需要研究的對象上，研究人員就可以了解物質(zhì)的活動。不但如此，量子點還可以用來追蹤藥物在體內(nèi)的活動、或是研究患者體內(nèi)細胞和組織的結(jié)構(gòu)。量子點可以產(chǎn)生多種顏色的光，光的顏色取決于量子點的尺寸。研究人員已經(jīng)制造出可以產(chǎn)生超過12種顏色熒光的量子點，而且理論上講可以產(chǎn)生出更多的顏色。這樣，當(dāng)某個波長的激光對多種量子點進行照射激發(fā)的時候，可以同時觀察到多個顏色，同時進行多個測量。生物研究中所使用的量子點需要覆蓋上一層物質(zhì)以便可以追蹤特定的生物分子，可以應(yīng)用在醫(yī)學(xué)成像技術(shù)中。國外的科學(xué)家已經(jīng)應(yīng)用量子點標(biāo)記腫瘤細胞憑借活體成像系統(tǒng)進行相關(guān)的研究

量子點(QuantumDots，QDs)，也稱半導(dǎo)體納米微晶體(SemiconductorNanocrystal，NCs)，是一種零維的納米材料。主要由II-VI族元素和III-V族元素組成，其直徑通常在幾到十幾納米之間。量子點概述目前研究較多的是CdTe、CdSe、CdS、ZnS等量子點。

量子點具有許多體相材料和分子級別的材料所沒有的性質(zhì)，即量子效應(yīng)，表現(xiàn)在以下幾個方面：宏觀量子隧道效應(yīng)量子效應(yīng)表面效應(yīng)小尺寸效應(yīng)量子尺寸效應(yīng)介電限域效應(yīng)量子點的量子效應(yīng)量子點的光學(xué)性