無病毒苗木培育

第十章無病毒苗木培育

目的與要求

了解脫毒意義，學習植物莖尖脫毒原理及其操作程序，了解其他組織脫毒方法及應用，掌握植物理化脫毒方法。學習植物脫毒苗的鑒定方法，掌握各方法的鑒定原理，了解植物脫毒苗的保存和繁殖方法。具備植物莖尖脫毒技術基礎，具有指示植物鑒定脫毒苗的基本能力，有脫毒苗保存的認知。

1952年Morel等培養(yǎng)大麗花莖尖獲得第一株植物脫毒苗，1955年又獲得了馬鈴薯脫毒苗。20世紀70年代，幾乎所有生產(chǎn)馬鈴薯的國家都在生產(chǎn)中使用這一技術，到1975年，用該技術生產(chǎn)脫毒種薯的馬鈴薯品種已達150個左右。

1974年中國科學院植物研究所等開展馬鈴薯莖尖培養(yǎng)脫毒技術的研究及應用推廣工作，80年代中期脫毒馬鈴薯進入生產(chǎn)階段，90年代中期脫毒馬鈴薯已經(jīng)覆蓋了我國的大部分馬鈴薯產(chǎn)區(qū)，創(chuàng)造了可觀的經(jīng)濟效益。

1971年日本人Mori獲得了首例大蒜莖尖培養(yǎng)脫毒苗。法國率先將脫毒蒜種應用與生產(chǎn)，并出口到澳大利亞等國。我國于80年代初獲得脫毒苗。1988年以來，山東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所探明了侵染我國大蒜的主要病毒種類，提出了一套脫毒蒜快繁技術，提高繁殖系數(shù)7-10倍，提出了良繁體系，縮短了繁種周期，降低了生產(chǎn)成本，現(xiàn)在脫毒蒜種已在我國大面積應用于生產(chǎn)。

1988年，山東省農(nóng)業(yè)科學院植物研究所進行甘薯病毒病調查毒源鑒定工作，明確了侵染甘薯的病毒種類，傳毒介體的傳播途徑，形成了莖尖培養(yǎng)、病毒檢測、脫毒種薯的快繁和推廣應用的配套技術。此外，芋頭、大姜脫毒種在我國、日本、泰國等地已投放市場。多種蔬菜、果樹、林木、藥用植物的脫毒快繁技術研究和應用也發(fā)展迅猛，有些已形成具一定規(guī)模的工廠化產(chǎn)業(yè)

全世界已發(fā)現(xiàn)植物病毒有近788種。

病毒的危害：組織和細胞病變新陳代謝等生理機能受到干擾外觀表現(xiàn)不正常狀態(tài)由于危害可通過營養(yǎng)體傳給后代，病毒對寄主植物可造成毀滅性危害，導致大幅度減產(chǎn)，甚至全株死亡。世界作物生產(chǎn)中，病毒危害程度僅次于真菌。

危害一些植物的病毒數(shù)目植物種類感染病毒種類植物種類感染病毒種類植物種類感染病毒種類菊花19矮牽牛5蘋果36康乃馨11百合6柑橘23水仙4馬鈴薯17葡萄26唐菖蒲5大蒜24草莓24風信子3豌豆15桃23月季10櫻桃44梨11所謂脫毒就是采用一定的方法除去植物體內病毒的技術。

無病毒苗：指不含該種植物的主要危害病毒，即經(jīng)檢測主要病毒在植物體內的存在表現(xiàn)陰性反應的苗木。應用植物脫毒技術意義植物脫毒技術可使植物恢復原來優(yōu)良特性，生長勢增強，明顯提高產(chǎn)量、改善品質，產(chǎn)量的提高幅度最高可達300%。植物脫毒技術不僅脫除了病毒，還可以去除多種真菌、細菌及線蟲病害，使種性得以恢復，植株生長健壯，減少肥料和農(nóng)藥施用量，降低生產(chǎn)成本，保護了環(huán)境一、植物脫病毒的機理病毒在植物體內的分布是不均勻的，在莖尖中呈梯度分布。在受侵染的植株中，頂端分生組織無毒和含毒量極低。較老組織的含毒量隨著與莖尖距離的加大而增加。

分生組織含毒量低的原因可能是：1）植物病毒自身不具有主動轉移的能力，無論在病田植株間還是在病組織內，病毒的移動都是被動的。在植物體內，病毒可通過維管束組織系統(tǒng)長距離轉移，轉移速度較快，而分生組織中不存在維管束。病毒也可通過胞間連絲在細胞間移動，但速度很慢，難以追趕上活躍生長的莖尖。2）在旺盛分裂的細胞中，代謝活性很高，使病毒無法進行復制。3）在植物體內可能存在著病毒鈍化系統(tǒng)，它在分生組織中比其他任何區(qū)域具有更高的活性。4）在莖尖中存在高水平內源生長素，可抑制病毒的增殖。第一節(jié)植物脫毒方法一、莖尖培養(yǎng)脫毒

（一）通過莖尖培養(yǎng)脫毒的原理

1、病毒在植物體內的分布

病毒濃度不同，離尖端越遠病毒濃度越高。莖尖或根尖，離體培養(yǎng)便可獲得無病毒再生植株。

2、莖尖大小與脫毒

莖尖外植體的大小與脫毒效果成反比。莖尖分生組織不能合成自身需要的生長素，但下部葉原基能提供，因而帶葉原基的莖尖生長快，成苗率高。但莖尖越大，脫毒效果差。（二）莖尖脫毒方法

1、取樣與消毒

可直接選定的植株上取頂芽進行消毒接種。采頂芽與側芽消毒接種。

消毒方法是：剪取頂芽梢段3、5厘米，剝去大葉片，用自來水沖洗干凈，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1%-3次氯酸鈉或5%-7%的漂白粉溶液消毒10-20分，最后用無菌水沖洗材料4-5次。

酒精擦拭手外植體消毒浸泡5min器械消毒酒精燈灼燒酒精擦拭培養(yǎng)皿2、莖尖剝離和接種

將已消毒的芽放在帶濾紙的培養(yǎng)皿上—器械固定—解剖鏡下剝去幼葉—切下帶1-2個葉原基的生長點（0.3-0.5mm）—切下的莖尖轉至培養(yǎng)基上（頂部向上）。酒精擦拭旋轉灼燒顯微鏡下獲取莖尖接種蓋好瓶塞脫毒馬鈴薯試管苗3．培養(yǎng)

25+2℃

，1500-5000LX，10-16h

一般光照培養(yǎng)比暗培養(yǎng)效果好。其間應更換新鮮培養(yǎng)基。提高培養(yǎng)基中BA的濃度可形成大量從生芽。

4．生根誘導

誘導生根的方法是將2-3cm高的無根苗轉入生根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1-2個月可生根。（三）培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式

1、培養(yǎng)基：MS，White,Morel等

2、培養(yǎng)方式：一般采用半固體培養(yǎng)基。

（四）影響莖尖脫毒效果的因素（莖尖脫毒技術的關鍵）

植物種類、病毒種類、剝離莖尖的大?。?.3-0.5mm帶1-3個葉原基）、培養(yǎng)基營養(yǎng)

用于脫毒的適宜莖尖大小植物病毒名稱剝離莖尖大?。╩m）植物病毒名稱剝離莖尖大?。╩m）馬鈴薯馬鈴薯卷葉病毒馬1.0～3.0百合花葉病0.2～1.0鈴薯Y病毒1.0～3.0鳶尾花葉病0.2～0.5馬鈴薯X病毒0.2～0.5菊花各種病毒0.2～1.0馬鈴薯G病毒0.2～0.3康乃馨各種病毒0.2～0.8馬鈴薯S病毒0.2以下大麗花花葉病0.6甘薯斑紋花葉病毒1.0～2.0大蒜花葉病毒0.3～1.0縮葉花葉病毒1.0～2.0甘蔗花葉病0.7～3.0羽毛狀花葉病毒0.3～1.0草莓各種病毒0.2～1.0二、熱處理脫毒

脫毒原理

即熱處理脫毒，一些病毒對熱不穩(wěn)定，在高于常溫的溫度下（35-40度）即鈍化失活。

1、溫湯浸漬處理脫毒法材料置于50℃左右熱水中浸漬幾十分鐘到數(shù)小時。

特點：簡單易行，成本低，但易使材料受傷。適用：甘蔗、木本植物和休眠器官的處理。

2、熱空氣處理脫毒法將植物用35～40℃的熱空氣處理2～4周或更長時間。

特點：損傷較小，操作簡便，須嚴格控制溫度時間

適用：多數(shù)植物

3、熱處理結合莖尖培養(yǎng)脫毒目前常采用將熱處理和莖尖分生組織培養(yǎng)結合起來的方法脫毒。特點：既可縮短熱處理時間，提高植株成活率，又可剝離較大的莖尖，提高莖尖培養(yǎng)的成活率和脫毒率。適用：大多數(shù)植物，并可除去一般培養(yǎng)難以去除的紡錘塊莖類病毒三、其他組織培養(yǎng)脫毒方法

（一）愈傷組織培養(yǎng)脫毒

將感染病毒的組織離體培養(yǎng)獲得愈傷組織，再誘導愈傷組織分化成苗，從而獲得無病害毒植株的方法，即愈傷組織培養(yǎng)脫毒法。

部分愈傷組織細胞不帶病毒可能有以下兩方面的原因：

一是愈傷組織細胞分裂增殖速度快，而病毒復制速度較慢，趕不上細胞的繁殖；

二是愈傷組織發(fā)生了抗病毒突變。（二）珠心胚培養(yǎng)脫毒

柑橘類種子為多胚種子，除具有合子胚外還有珠心胚，種子一般不帶病毒，因此珠心胚植株不易帶病毒。

（三）微尖嫁接脫毒

指在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)實生砧木，嫁接無病毒莖尖（0.14-1.0mm,帶3-4個葉原基），以培養(yǎng)脫毒苗的技術。

脫毒程序：無菌砧木培養(yǎng)——莖尖準備——嫁接——嫁接苗培養(yǎng)——移植。第二節(jié)脫毒苗鑒定

一、直接檢查法

直接觀察待側植株生長狀態(tài)是否異常，莖葉上有無特定病毒引起的可見癥狀，從而可判斷病毒是否存在。

二、指示植物法

將一些對病毒反映敏感，癥狀特征顯著的植物作為指示植物，用以檢驗待測植物體內特定病毒的存在。即指示植物法。

特點：條件簡單，操作方便，經(jīng)濟而有效，只能測出病毒的相對感染力。一些常見病毒病引起的可見病癥癥狀病毒病名稱癥狀病毒名稱褪綠、黃化小麥黃矮病斑點十字花科黑斑病花葉、斑駁煙草花葉病、菜豆花葉病、黃瓜花葉病猝倒、立枯棉花立枯病、瓜苗猝倒病、水稻爛秧病潰瘍楊樹潰瘍病、柑桔潰瘍病，番茄潰瘍病萎蔫棉花枯萎病、茄科植物青枯病枯死馬鈴薯晚疫病、水稻白葉枯病矮化玉米矮化病、泡桐叢枝病、小麥叢矮病穿孔桃細菌性穿孔病徒長水稻惡苗病瘡痂柑桔瘡痂病、梨黑星病、馬鈴薯瘡痂病卷葉馬鈴薯卷葉病指示植物法幾種馬鈴薯病毒的指示植物及表現(xiàn)癥狀病毒種類指示植物表現(xiàn)癥狀馬鈴薯X病毒（PVX）千紅日、曼陀羅、辣椒、心葉煙脈間花葉馬鈴薯S病毒（PVS）莧色藜、千日紅、曼陀羅、昆諾阿藜葉脈深陷，粗縮馬鈴薯Y病毒（PVY）野生馬鈴薯、洋酸菜、曼陀羅隨品種而異，有些輕微花葉或粗縮，敏感品種反應為壞死馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）洋酸菜葉尖呈淺黃色，有些品種呈紫色或紅色（一）草本植物鑒定1、汁葉涂抹法被鑒定植物取1～3克幼葉—加10毫升水及少量磷酸緩沖液-研碎過濾-加金鋼砂作麾擦劑-汁液在葉面上涂抹2～3次接種2、小葉嫁接法指示植物作砧木，被鑒定植物小葉作接穗，常用劈接法。（二）木本指示植物鑒定1、直接在指示植物上嫁接待檢植株的芽片2、雙重芽嫁接3、雙芽嫁接法部分病毒的木本指示植物及相應癥狀病毒種類木本指示植物表現(xiàn)癥狀蘋果褪綠葉斑病毒蘇俄蘋果葉片出現(xiàn)褪綠斑點，葉小，植株矮化，長勢弱蘋果莖痘病毒司派227或光輝葉片反卷，植株矮化，皮層壞死蘋果莖溝病毒弗吉尼亞小蘋果植株矮小，接合部內有深褐色壞死環(huán)紋，木質部產(chǎn)生深褐色縱向條溝蘋果花葉病毒蘭蓬王、紅玉和金冠葉片上產(chǎn)生黃斑、沿葉脈條斑蘋果銹果類病毒國光葉和莖干銹斑、壞死斑葡萄扇葉病毒葡萄莖痘病毒沙地葡萄圣喬治葉片出現(xiàn)褪綠斑點、線紋斑及環(huán)斑、局部壞死、畸形；葉脈間出現(xiàn)星狀透明斑葡萄卷葉病毒歐亞種葡萄葉片下卷、葉脈間變紅葡萄莖溝病毒Kober5BB僅在Kober5BB上會產(chǎn)生莖溝葡萄栓皮病毒LN33節(jié)間腫大，部分葉片背面出現(xiàn)栓皮葡萄金黃病毒Baco22A植株矮化，葉片下卷、黃化葡萄脈壞死病110R葉片背面沿葉脈出現(xiàn)壞死斑，卷須和嫩梢壞死葡萄脈斑駁病河岸葡萄褪綠斑，沿脈斑駁，葉片畸形柑橘碎葉病臘斯克枳橙、特洛亞枳橙、卡里佐枳橙和厚皮來檬新葉上出現(xiàn)葉片扭曲，葉緣殘缺呈破碎狀三、抗血清鑒定法

特異性高，測定速度快，幾小時甚至幾分鐘就可以完成。植物病毒鑒定中最有用方法之一。

（一）原理

刺激抗體產(chǎn)生蛋白質抗原?？乖c抗體間能發(fā)生高度專一性的血清學反應（免疫反應）

三、抗血清鑒定法



（二）方法

1、葉綠體凝集法

2、塊莖沉淀法

3、環(huán)形接口法

4、酶聯(lián)免疫法：用梅標記抗原或抗體的微量測定法?，F(xiàn)在靈敏度較高和常使用的方法。四、分子生物學鑒定

1、雙鏈RNA法

通過提取純純化待測植物RNA，并對其進行電泳分析，可確定dsRNA存在，從而判斷待檢植物是否帶病毒。

2、互補DNA（cDNA）檢測法

也叫DNA分子雜交法

五、電鏡檢測法

運用電子顯微鏡可直接檢測待檢植物體內有無病毒粒體存在，并根據(jù)所觀察病毒的形態(tài)等對病毒種類進行鑒定。是較為先進的方法，但需一定的設備和技術。

第三節(jié)無病毒苗的保存和繁殖通過不同脫毒方法所獲得的脫毒植株，經(jīng)鑒定確系無特定病毒者，既是無病毒原種。無病毒植株并不是有額外的抗病性，它們有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到無病毒苗，就應很好保存，這些原原種或原種材料保管得好可以保存利用5～10年。一、無病毒苗的保存（一）隔離保存通常無病毒苗應種植在隔蟲網(wǎng)內，使用300目，即網(wǎng)眼為0.4～0.5mm大小的網(wǎng)紗，也可用盆栽缽。栽培用的土壤也應進行消毒，周圍環(huán)境也要整潔，并及時噴施農(nóng)藥防治蟲害，以保證植物材料在與病毒嚴密隔離的條件下栽培。另一種更便宜的方法，是把由莖尖得到的并已經(jīng)過脫毒檢驗的植物通過離體培養(yǎng)進行繁殖和保存。（二）長