人羊膜上皮細胞來源、生物學特性及應用前景,人體解剖學論文

人羊膜上皮細胞來源、生物學特性及應用前景,人體解剖學論文羊膜作為一種生物材料用于外科已有100多年的歷史，1910年初次報道了羊膜成功應用于皮膚移植[1].近年研究發(fā)現(xiàn)，人羊膜上皮細胞〔humanamnioticepithelialcells,hAECs〕具有部分干細胞特性，表示出干細胞的標記物，可分化為三個胚層不同類型的細胞[2].由于hAECs取材方便、易于分離，成為細胞治療和再生醫(yī)學的有利工具。2018年國際胎盤干細胞協(xié)會〔InternationalPlacentaStemCellSociety,IPLASS〕成立，致力于推動胎盤來源干細胞的基礎研究和臨床應用，也標志著胎盤來源干細胞已得到越來越多研究者的關(guān)注。本文就hAECs的來源、生物學特性等方面，對其臨床應用前景進行總結(jié)闡述。1hAECs的來源羊膜〔amnioticmembrane,AM〕屬于胎兒附屬物，是胎膜和胎盤的部分組織。羊膜組成胎膜和胎盤的最內(nèi)層，并覆蓋臍帶外表，與胎兒皮膚相連。羊膜為半透明薄膜，結(jié)實、堅韌而柔軟，光滑，無血管、神經(jīng)及淋巴。正常羊膜厚0.02~0.05mm,由羊膜上皮〔amnioticepithelium,AE〕和結(jié)締組織構(gòu)成[2].羊膜上皮由單層的羊膜上皮細胞構(gòu)成。羊膜是高變異性的組織，位于胎盤外表的羊膜上皮層為柱狀上皮細胞，周圍部分的羊膜上皮層是扁平上皮細胞。羊膜與羊水直接接觸，電鏡下可見羊膜上皮細胞外表有微絨毛，使羊水與羊膜間進行物質(zhì)交換。通?？蓪⒀蚰づc絨毛膜機械分離，并通過胰酶等進行一1growthfactor,EGF〕存在的培養(yǎng)基中，hAECs通?？缮L2~6代。低密度的狀態(tài)下生長較緩慢。體外培養(yǎng)的hAECs呈中等大小的圓形細胞，核居中或偏于一側(cè)，可有一個或兩個細胞核，胞質(zhì)豐富。hAECs的增殖呈典型的鵝卵石樣上皮細胞形態(tài)。hAECs在自分泌的轉(zhuǎn)化生長因子〔transforminggrowthfactor-，TGF-〕的作用下，可自發(fā)經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化〔ep-ithelial-mesenchymaltransition,EMT〕[3].2hAECs的生物學特性2.1hAECs表示出干細胞標記物hAECs在體外培養(yǎng)條件下，可表示出間充質(zhì)干細胞標記物；除此之外，hAECs還可表示出胚胎干細胞標記物、多能干細胞標記物等[4-5].間充質(zhì)干細胞標記物：CD105、CD90、CD73、CD44、CD29、HLA-A,B,C、CD13、CD10、CD166、CD49e、CD117〔表示出量極低〕,并且不表示出CD14、CD34、CD45、HLA-DR.胚胎干細胞標記物：階段特異性胚胎抗原SSEA-3、SSEA-4,腫瘤排擠抗原TRA1-60、TRA1-81.多能干細胞標記物：octamer-4〔OCT-4〕、NANOG、sexdeterminingregionY-box2〔SOX-2〕、Lefty-A、FGF-4、REX-1,andteratocarcinoma-derivedgrowthfactor1〔TDGF-1〕〔cripto-1〕。其他：CD324〔E-cadherin〕、CFC1、DPPA3、PROM1、PAX6、CD140b、GCTM2、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G2〔ABCG2/BCRP〕、CD9、CD24、整合蛋白6、1、c-met〔肝細胞生長因子受體〕。原代hAECs中，SSEA3、SSEA4和TRA陽性的細胞分別為15%、50%和5%~10%[4].顯著大于成體干細胞的比率〔0.1%~0.01%〕。Miki等[6]以為，原腸胚構(gòu)成是器官發(fā)生的開場，由于hAECs發(fā)生于原腸胚構(gòu)成前，加之羊膜腔的阻隔，原腸胚的短程器官構(gòu)成信號分子可能不能完全作用于成羊膜細胞，因而保存有較多的干細胞特性。2.2hAECs的免疫特性羊膜應用于多種外科治療已有100多年，包括皮膚燒傷、皮膚創(chuàng)傷后修復、腿部潰瘍等不同部位的創(chuàng)傷[7],泌尿生殖道及頜面部等部位重建手術(shù)，以及多種潰瘍外表的重建[8],均未出現(xiàn)免疫抑制或急性排擠反響。羊膜細胞的免疫特性表如今其特殊的免疫分子表示出譜。hAECs低表示出MHCⅠ類分子〔HLA-A,B,C,G〕,不表示出MHCⅡ類分子〔HLA-DR〕，還表示出HLA-G、CD80〔B7-1〕、CD86〔B7-2〕、CD40和CD40L[9].hAECs持續(xù)性表示出非典型MHCⅠ類分子HLA-G.通常持續(xù)性表示出HLA-G的組織為免疫豁免組織，如睪丸、卵巢、胎兒細胞。HLA-G有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。主要由ILTR辨別，表示出于T、B淋巴細胞、NK細胞、樹突狀細胞外表，結(jié)合后消除活性信號。hAECs是一類免疫豁免細胞，能在免疫不相容的異體移植受者體內(nèi)存活。在無免疫抑制劑的作用下，異體移植的羊膜或hAECs仍不發(fā)生急性免疫排擠反響。體外實驗中，從羊膜中分離的細胞不表現(xiàn)出同種和異種的免疫反響，并且能較強地抑制淋巴細胞增殖。體內(nèi)實驗證實，人羊膜和hAECs可移植到同種和異種的具有免疫功能的動物體內(nèi)，未表現(xiàn)出免疫排擠。人羊膜和hAECs能在有免疫力的動物，如兔、鼠、豚鼠、帽猴體內(nèi)長期存活，提示這類細胞不具有免疫原性。除此之外，在無免疫抑制治療的情況下，將人羊膜和hAECs應用于外科治療，也均未見急性排擠反響。3hAECs的臨床應用前景hAECs可表示出干細胞標記物，提示其可能具有干細胞特性。與人胚胎干細胞一樣，hAECs不具有構(gòu)成單個細胞克隆的能力，并且由于其基因穩(wěn)定性，在移植入異種動物體內(nèi)也不構(gòu)成畸胎瘤[4].因而，只能通過構(gòu)建嵌合體小鼠驗證其干細胞特性。在體外條件下，利用小鼠的胚胎干細胞和人羊膜細胞誘導成嵌合體小鼠。在嵌合體小鼠胚胎中，三個胚層中均有人細胞的分布[10].盡管該細胞系為人hAECs和羊膜間充質(zhì)細胞的混合，仍成功揭示了羊膜細胞的多能性。進一步的研究證實，hAECs在體外誘導條件下可分化為三個胚層的細胞，包括外胚層的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞[11],中胚層的心肌細胞肌細胞、骨細胞、脂肪細胞[12],內(nèi)胚層的肝臟[13]和胰腺細胞[14]等。3.1hAECs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的應用前景hAECs在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有著宏大的潛力。1996年Sakuragawa等[15]發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的hAECs表示出神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性蛋白，自此hAECs就開場被用于細胞治療的研究。隨后有研究證實，hAECs還可合成分泌乙酰膽堿、兒茶酚胺、多巴胺。進一步實驗也證實，hAECs可表示出神經(jīng)標記基因，如神經(jīng)特異性烯醇化酶、神經(jīng)絲蛋白、髓鞘堿性蛋白、微管相關(guān)蛋白-2、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白等[4].利用腺病毒標記系統(tǒng)證實，約20%的hAECs表示出少突膠質(zhì)細胞標志基因，如髓鞘堿性蛋白、蛋白質(zhì)脂蛋白〔PLP〕和2,3-環(huán)腺苷酸-3-磷酸二酯酶〔CNPase〕。帕金森病〔Parkinsonsdisease,PD〕是由腦黑質(zhì)的多巴胺〔dopamine,DA〕神經(jīng)元的進行性死亡導致。將hAECs移植入免疫抑制的PD大鼠模型，可改善其DA神經(jīng)元退化作用，并且其功能明顯恢復[16].這可能通過分泌DA和其他可溶性分子發(fā)揮作用。在非免疫抑制的大鼠中的進一步實驗證實，hAECs移植的大鼠腦黑質(zhì)中DA和DOPAC〔3,4-二羥基苯乙酸〕分泌明顯增加，腦脊液中DA含量明顯增加[17].除此之外，hAECs對于腦卒中、脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著潛在的治療前景。hAECs移植入大腦中動脈閉鎖的模型中，可遷移到缺血區(qū)域，減少梗死面積，提高行為功能[18].hAECs移植入脊柱橫斷的猴子中，可促進軸突迅速增長，并且抑制了脊柱微神經(jīng)元的死亡[19].通過行為評估，移植后的hAECs能在損傷的急性期起到神經(jīng)保衛(wèi)的作用，并且在長期恢復經(jīng)過中促進長纖維束的再生，而改善脊髓損傷動物的功能。大量體內(nèi)體外實驗證明，hAECs可能通過分化為神經(jīng)細胞，或分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子而起到改善疾病的作用。3.2hAECs在心臟疾病治療中的應用前景由于成熟心肌細胞的不可再生性，利用干細胞移植重建病損心臟喪失的心肌細胞、改善缺血心肌的功能，被視為有臨床應用前景的、治療冠心病尤其是急性心肌梗死的新途徑。Miki等最早對hAECs可分化為心肌細胞做出了研究，在hAECs培養(yǎng)基中添加抗壞血酸培養(yǎng)14天后，通過RT-PCR可檢測到心房型肌球蛋白輕鏈〔MLC-2A〕、心室型肌球蛋白輕鏈〔MLC-2V〕、GA-TA-4及心肌細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5的表示出[4].體內(nèi)實驗證實，將人羊膜塊移植入大鼠心肌缺血模型，明顯改善了缺血后心臟功能；實驗組動物表現(xiàn)為心臟收縮功能提高、左室短軸縮短率提高和室壁增厚；但在大鼠心肌組織中未檢測到人細胞。提示這些功能的改善應是羊膜細胞分泌的調(diào)節(jié)因子的作用，起到了保衛(wèi)和促進宿主組織再生[20].然而，不同于組織塊的移植，hAECs注射入心肌梗死的大鼠模型的心肌梗死區(qū)域4周后，存活的hAECs中3%可表示出心肌特異性蛋白肌球蛋白重鏈。實驗組動物的心臟射血分數(shù)升高，PET及組織學顯示梗死區(qū)域減少，梗死區(qū)域心肌基因和蛋白表示出增高。證實了hAECs在體內(nèi)條件下可分化為心肌樣細胞，減少梗死區(qū)域，改善心肌功能[21].因而，羊膜和hAECs改善心肌缺血華而不實的機制有兩種可能：一是移植細胞分化為心肌細胞或者血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞；二是移植細胞刺激了血管生成和預防了心肌細胞的死亡。3.3hAECs在肝臟疾病治療中的應用前景近年肝臟移植成為治療晚期肝臟疾病的新方式方法，但卻遭到肝臟來源短缺的限制。hAECs具有分化為肝臟細胞的能力，成為潛在的移植來源。Sakuragawa等[22]報道，體外培養(yǎng)的hAECs可分泌白蛋白〔Alb〕和甲胎蛋白〔AFP〕。進一步研究發(fā)現(xiàn)，未分化的hAECs表示出白蛋白、-抗胰蛋白酶、1-AT、CK-18、CPS-1、PEPCK等肝細胞基因，而誘導后的hAECs表示出1-AT、CK-18、CPS-1、CYP3A4、PEPCK等肝臟相關(guān)基因量增加，并且可合成分泌白蛋白、貯積糖原[23].通過外源性生長因子刺激方案誘導hAECs分化為肝臟細胞，能分泌多種成熟肝臟特異性標志蛋白，華而不實包括重要的藥物代謝相關(guān)的細胞色素P450基因。羊膜塊移植入SCID小鼠腹腔后可存活并在小鼠的血清和腹水中可檢測到人白蛋白的分泌[23].hAECs移植入SCID小鼠的肝臟后，表現(xiàn)為Alb和AFP陽性，并且融合為肝臟本質(zhì)組織[22].hAECs移植入免疫缺陷小鼠后，在小鼠血清中檢測到人1-抗胰蛋白酶，可進一步證實移植入的hAECs可發(fā)揮肝臟細胞的功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟細胞、基質(zhì)膠或豬肝臟細胞來源的胞外基質(zhì)，可增加hAECs分化為肝臟細胞的能力。華而不實豬肝臟細胞來源的胞外基質(zhì)培養(yǎng)的hAECs,其白蛋白和多種CYP基因表示出增加最明顯。三明治培養(yǎng)等3D培養(yǎng)法可明顯增加這類細胞的功能和活性。倒千里光堿處理的肝臟60%切除小鼠，經(jīng)脾移植入hAECs6個月后，可在肝臟組織中檢測到人源細胞[24].在誘導分化為肝臟細胞的hAECs中，當前可檢測到至少30個在成熟肝臟細胞表示出的基因，提示hAECs可成為潛在的移植來源。hAECs也為A1AT缺陷的肝臟和肺疾病等提供了新的治療思路。4結(jié)論人羊膜上皮細胞由于特殊胚胎發(fā)育來源，仍保持著部分干細胞特性。大量體內(nèi)、體外實驗都已證實了其潛在的治療效果。但hAECs不具有長期自我更新和構(gòu)成單個細胞克隆的能力，其究竟是一種可分化為三個胚層的多能干細胞還是多種各系祖細胞的混合物，仍需進一步的研究。但在臨床應用方面，hAECs具有獨特的優(yōu)勢：首先，hAECs可分化為三個胚層不同類型的細胞，多種疾病模型實驗也證實其潛在的治療效果。其次，由于hAECs基因的穩(wěn)定性，移植入免疫缺陷