第7章種質(zhì)離體保存

第七章種質(zhì)離體保存概述低溫保存的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)保存中遺傳變異的檢測(cè)與利用影響保存效果的因素超低溫保存的方法1幾個(gè)相關(guān)概念（見《園藝植物育種學(xué)》）種質(zhì)（germplasm）：決定生物的遺傳性狀，并將遺傳信息從親代傳遞給子代的遺傳物質(zhì)。種質(zhì)資源包括動(dòng)植物的個(gè)體、器官、組織、細(xì)胞甚至控制生物遺傳性狀的基因。種質(zhì)庫：又稱基因庫（GenBank），是以種為單位的群體中的全部遺傳物質(zhì)，它由許多不同基因型的個(gè)體所組成。種質(zhì)資源（germplasmresource）或遺傳資源（geneticresource）：具有種質(zhì)并能繁殖的生物體。種質(zhì)資源保存：為避免種質(zhì)資源的流失，利用自然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境，實(shí)現(xiàn)種質(zhì)材料生活力的長(zhǎng)期保持。2種質(zhì)資源保存方法就地保存（自然保護(hù)區(qū)）遷地保存（種質(zhì)圃保存）種子保存離體培養(yǎng)保存基因文庫保存常溫限制生長(zhǎng)保存中低溫調(diào)控生長(zhǎng)保存低溫干燥保存減壓保存低溫保存（低于-80℃）超低溫保存（-196℃）難以長(zhǎng)期保持種質(zhì)壽命，對(duì)種質(zhì)保存的作用不是很大。按保存條件（溫度、含氧量等）按材料和方式3第一節(jié)概述一、植物種質(zhì)資源低溫保存的意義防止物種或品種滅絕節(jié)省人力物力便于種質(zhì)資源的國(guó)內(nèi)外交流4二、超低溫保存的概念

低溫保存（cryopreservation）是由cryo和preservation組成，在英語中cryo為一前綴，被解釋為低溫、冷、冰、霜之意。從詞義看，低溫所涉及的溫度范圍是不確定的。超低溫:≤-80℃極低溫:≤-70℃(干冰溫度)低溫:≤4℃

5但對(duì)植物而言，低溫常常是指那些比常溫稍低一些的溫度。如果低溫超過細(xì)胞原生質(zhì)所能忍受的臨界溫度，就會(huì)致使植物細(xì)胞遭受凍害而死亡。如甜橙樹發(fā)生凍害的臨界溫度通常在-6.5℃，枳殼通常在-20℃左右（沈德緒等，1986）。6低溫保存（Cryopreservation），是指將植物的組織或細(xì)胞經(jīng)過防凍處理后，在低于-80℃條件下保存的方法。超低溫保存：將植物的組織或細(xì)胞經(jīng)過防凍處理后，在-196℃的極端低溫下保存的方法。7超低溫保存的優(yōu)點(diǎn):在超低溫條件下，活細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎完全停止，呈現(xiàn)“假死”狀態(tài)。因此，細(xì)胞、組織和器官在此過程中不會(huì)發(fā)生遺傳性狀的改變，也不會(huì)丟失形態(tài)發(fā)生的潛能。在超低溫條件下，生命的代謝和衰老過程也基本停止，故能夠?qū)崿F(xiàn)長(zhǎng)時(shí)期的保存。8超低溫保存的意義:可以在有限空間內(nèi)保存大量種質(zhì)材料；與種子保存相比，可以不受時(shí)間和種子含水量的制約；與試管苗相比，可以避免頻繁繼代培養(yǎng)造成的變異，并大幅度減少工作量。9常用的超低溫保存方法：冷凍誘導(dǎo)保護(hù)性脫水的超低溫保存法玻璃化處理的超低溫保存法10三、超低溫保存的研究概況1．超低溫保存技術(shù)的發(fā)展2．用于超低溫保存的植物材料3．超低溫保存的植物種類

據(jù)王君暉等1998年統(tǒng)計(jì)，有40多個(gè)屬60多個(gè)種的木本植物已進(jìn)行了超低溫保存研究，其中：種子、胚、胚軸和胚的保存一般采用干凍法；莖尖和分生組織多采用玻璃化法或包埋脫水法；愈傷組織和懸浮細(xì)胞大多采用兩步法。1112第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)一、細(xì)胞內(nèi)外水的凍結(jié)狀態(tài)是細(xì)胞凍存技術(shù)的關(guān)鍵

植物細(xì)胞中含有大量的水分，約占細(xì)胞總重量的60-90％。細(xì)胞中的水由游離水和束縛水組成，其中游離水約占90％，很容易凍結(jié)，由于細(xì)胞內(nèi)含有許多化合物，因此細(xì)胞內(nèi)溶液并不象純水那樣在0℃就結(jié)冰。131.細(xì)胞內(nèi)外水分的凍結(jié)特性

理論上講，細(xì)胞外水的凍結(jié)溫度為-5～-15℃，細(xì)胞內(nèi)游離水的凍結(jié)溫度為-25℃，故在-30℃時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的游離水全部被凍結(jié)，而結(jié)合水則在-100℃溫度下也不發(fā)生凍結(jié)。14根據(jù)Luyet的凍結(jié)理論（1937），細(xì)胞內(nèi)游離水的凍結(jié)溫度（-30℃）可認(rèn)為是細(xì)胞凍存的安全溫度，因而細(xì)胞凍存的兩步凍結(jié)法一般以-30℃為基礎(chǔ)的。也就是說，控制細(xì)胞內(nèi)外水的凍結(jié)狀態(tài)，是細(xì)胞凍存技術(shù)的關(guān)鍵。15超低溫保存的原理為什么在超低溫條件下材料不會(huì)凍死。關(guān)鍵原因是進(jìn)行了“防凍處理”，具體如下：使用冷凍防護(hù)劑可以降低培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的冰點(diǎn)。使用冷凍防護(hù)劑可以提高培養(yǎng)基的滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，從而提高了組織和細(xì)胞的抗寒能力。16根據(jù)細(xì)胞內(nèi)外水分的凍結(jié)特性，凍存方法有：分步冷凍：在細(xì)胞內(nèi)游離水凍結(jié)之前，先使細(xì)胞外水分凍結(jié)，從而使細(xì)胞內(nèi)游離水向胞外滲溢，導(dǎo)致細(xì)胞適度脫水，利于細(xì)胞的冷凍保存?？焖倮鋬觯阂卜Q玻璃化冷凍保存技術(shù)，通過迅速降溫，使細(xì)胞內(nèi)水凍結(jié)產(chǎn)生的冰晶體積非常小，呈現(xiàn)為一種玻璃狀的凍結(jié)現(xiàn)象，避免細(xì)胞受到傷害，達(dá)到細(xì)胞冷凍保存的目的。172.低溫下細(xì)胞的致死損傷超低溫保存的一般過程：超低溫保存是建立在生物細(xì)胞凍害和抗凍機(jī)理的基礎(chǔ)之上的。超低溫保存成功的關(guān)鍵，在于降溫過程中避免細(xì)胞內(nèi)溶液結(jié)冰。為此，對(duì)于不同的植物種類或材料，應(yīng)篩選相應(yīng)的冰凍保護(hù)劑，采用適當(dāng)?shù)慕禍厮俣燃盎瘍龇绞?，才能使?xì)胞不受損傷或損傷最小。預(yù)凍超低溫長(zhǎng)期保存解凍18第三節(jié)超低溫保存的方法超低溫保存的程序包括培養(yǎng)材料的準(zhǔn)備、預(yù)處理、冰凍及保存、化凍處理、細(xì)胞活力測(cè)定、植株再生和變異評(píng)價(jià)等步驟。降溫冰凍方法玻璃化保存方法超低溫保存的方法19一、傳統(tǒng)的降溫冰凍方法1．慢凍法：以0.5-2℃/min速度降溫至-100℃后投入液氮，或以該速度一直降溫至-196℃后投入液氮。在冰凍保保護(hù)劑的作用下，既可避免在細(xì)胞脫水時(shí)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，又能防止因溶質(zhì)含量增加引起的“溶液效應(yīng)”。因此，對(duì)于原生質(zhì)體、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞等細(xì)胞類型一致的培養(yǎng)物，這種方法效果最好。202．快凍法：將材料用玻璃瓶或錫箔紙袋保護(hù)后直接投入液氮或液氮的蒸氣相中，該方法對(duì)高度脫水的材料如種子、花粉及抗寒性很強(qiáng)的休眠枝條或冬芽比較適宜，對(duì)含水量高的細(xì)胞培養(yǎng)物則不適合。213．分步冰凍法：是慢凍法和快凍法的結(jié)合，先用較慢的速度(0.5～4℃/min)降至-30～-40℃，停留0.5～1h，然后直接投入液氮中保存。停留的目的是誘導(dǎo)細(xì)胞外水分結(jié)冰，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)性脫水，避免細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生非均一性冰晶。224.干凍法：將樣品在高濃度(0.5-1.5M)滲透性化合物培養(yǎng)基上培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至數(shù)天，再經(jīng)過硅膠、無菌空氣干燥脫水?dāng)?shù)小時(shí)(使含水量降至17～40％)或用藻酸鹽包埋后投入液氮保存。該法特別適合于愈傷組織、體細(xì)胞胚、胚軸、胚、莖尖、生根苗保存，但不適用于脫水敏感的材料。23二、玻璃化保存方法玻璃化（vitrification）是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷w玻璃態(tài)的固化過程。使溶液玻璃化有兩條途徑：一是大幅度提高冷卻速率；二是增加溶液濃度。241.玻璃化法

玻璃化法是指將生物材料經(jīng)高濃度玻璃化溶液快速脫水后，直接投入液氮，使材料連同玻璃化溶液同時(shí)轉(zhuǎn)變成玻璃態(tài)。在此過程中，水分子沒有發(fā)生重排，不形成冰晶，不發(fā)生結(jié)構(gòu)和體積的改變，因而不會(huì)對(duì)材料造成機(jī)械損傷。當(dāng)保存終止后，通過快速化凍防止去玻璃化的發(fā)生。如果材料能夠安全度過冷卻和化凍兩個(gè)關(guān)口，凍存即告成功。252.包埋玻璃化法包埋玻璃化法是包埋脫水法和玻璃化法的結(jié)合。先把保存材料用藻酸鈣包埋，再經(jīng)蔗糖濃度梯度脫水和玻璃化溶液處理后投入液氮保存，其存活率比包埋脫水法要高，可能是因?yàn)樵逅徕}的包埋減輕了玻璃化溶液的毒性。26包埋玻璃化的實(shí)例(a)將離體培養(yǎng)誘導(dǎo)的莖尖在黑暗和低溫（4℃）條件下進(jìn)行鍛煉。(b)用海藻酸鈣包埋莖尖。(c)將包埋體置于超凈工作臺(tái)上吹風(fēng)干燥。(d)將包埋體在含0.75M蔗糖的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，進(jìn)一步脫水。(e)將包埋體置于冷藏管中，投入液氮中保存。(f)快速化凍。(g)植株再生。27第四節(jié)

影響超低溫保存效果的因素材料的基本特性冰凍保護(hù)劑的應(yīng)用再生技術(shù)預(yù)培養(yǎng)與低溫鍛煉解凍方法28一、材料的基本特性材料的基本特性包括植物的基因型、抗凍性、器官、組織或細(xì)胞的年齡以及生理狀態(tài)等（特別是基因型）。

植物細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)年齡，也是決定凍后細(xì)胞成活率的最重要因素之一。指數(shù)生長(zhǎng)期和滯后期的幼齡細(xì)胞抗凍力強(qiáng)，存活率高。29二、預(yù)處理和低溫鍛煉預(yù)處理對(duì)于調(diào)整植物材料的生理狀態(tài)非常有效，可以減少細(xì)胞內(nèi)自由水含量，減輕冷凍傷害，提高抗凍能力。預(yù)處理措施:包括提高培養(yǎng)基的糖濃度、提高滲透壓以減少細(xì)胞內(nèi)自由水含量；在預(yù)培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)抗寒力的物質(zhì)或冰凍保護(hù)劑，如0.3-1.0Ｍ蔗糖、甘露醇、山梨醇等滲透壓調(diào)節(jié)劑，5-10％DMSO等冰凍保護(hù)劑。低溫預(yù)培養(yǎng)：將材料于0℃以上低溫、黑暗或弱光下離體培養(yǎng)幾周，可明顯增強(qiáng)其忍耐冷凍能力。30三、冰凍保護(hù)劑的應(yīng)用冰凍保護(hù)劑（Cryoprotectiveagent，CPA）也稱抗凍劑，為植物低溫保存必不可少。特點(diǎn)：易溶于水，對(duì)細(xì)胞無毒害，容易從組織或細(xì)胞中清除。作用：增加膜透性，加速細(xì)胞內(nèi)水流到細(xì)胞外結(jié)冰；穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，阻止低溫傷害；降低冰點(diǎn)，提高溶液的粘滯性，阻止冰晶的生長(zhǎng)。依據(jù)滲透性的有無，可將CPA分為兩類：

滲透型非滲透型&31滲透型冰凍保護(hù)劑特點(diǎn)：多為中性低分子物質(zhì)，在溶液中易與水分子結(jié)合發(fā)生水合作用，增加溶液的粘稠度，降低溶液的冰點(diǎn)，從而弱化了水結(jié)晶的過程，達(dá)到保護(hù)材料的目的。

種類：常用的有甘油、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）。不同滲透型冰凍保護(hù)劑滲入細(xì)胞的能力及其對(duì)水分子活性的影響也有不同，如甘油適用于慢速冷卻，DMSO容易滲入細(xì)胞，但有輕微毒性。32非滲透型冰凍保護(hù)劑特點(diǎn)：能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，它使溶液呈過冷狀態(tài)，在特定溫度下能夠降低溶質(zhì)（電解質(zhì)）濃度，從而起到保護(hù)作用。種類：主要有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖(Dextrane)、聚乙二醇(PEG)、白蛋白(Albumin)、羥乙基淀粉(HES)等。33四、解凍方法根據(jù)解凍速度分為快速解凍和慢速解凍兩種方式：快速解凍：能使材料迅速通過冰融點(diǎn)的危險(xiǎn)溫度區(qū)(-50～-10℃)，防止降溫過程中形成晶核對(duì)細(xì)胞造成損傷。通常的做法是把樣品放入37～45℃溫水浴中，待冰完全溶化后（約90s）立即移開。慢速解凍：對(duì)于脫水處理后干凍保存的材料，一般認(rèn)為應(yīng)先置于0℃下一段時(shí)間，再于室溫下緩慢解凍效果較好。34另外，不同材料或方法采用的化凍方式也有不同：材料含水量：液泡小、含水量少的細(xì)胞（如莖尖分生組織），可采用快速化凍的方法；液泡大、含水量高的細(xì)胞則一般需要采用慢速化凍法。材料的生理狀態(tài)：生長(zhǎng)季節(jié)中的材料，一般在37～45℃溫水浴中快速化凍（500-700℃/min）比在室溫下慢速化凍要好，而木本植物的冬芽，在超低溫保存后，必須在0℃低溫下進(jìn)行慢速化凍才能達(dá)到良好的效果。保存方法：玻璃化凍存的材料在保存終止后，要求快速化凍，以防止次生結(jié)冰對(duì)組織細(xì)胞造成傷害。351.冷凍保存后細(xì)胞和器官活力的檢測(cè)再培養(yǎng)法測(cè)定存活率存活細(xì)胞(或器官)數(shù)目解凍(或器官)數(shù)目存活率=×100%五、培養(yǎng)及再生36經(jīng)凍存的材料，不可避免地受到一些傷害，需要小心維護(hù)：培養(yǎng):一般將材料培養(yǎng)在黑暗或弱光下培養(yǎng)1-2周，再轉(zhuǎn)入正常光照下培養(yǎng)。

培養(yǎng)基:一般是保存前使用的培養(yǎng)基，但有時(shí)需將大量元素或瓊脂含量減半，或在培養(yǎng)基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等，以利于材料的恢復(fù)生長(zhǎng)。

2.培養(yǎng)及再生37六、超低溫保存中變異及其檢測(cè)保持原有種質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性，是種質(zhì)保存的基本要求。超低溫保存的遺傳變異屬于體細(xì)胞變異。變異與起始細(xì)胞的生理狀態(tài)和培養(yǎng)基、預(yù)處理方式、解凍方式等有關(guān)（變異基本上都是在非超低溫下產(chǎn)生的）。在保證保存材料活性的同時(shí)，應(yīng)盡量采用減少變異的方法技術(shù)。38為了掌握超低溫保存材料的遺傳變異情況，有必要在保存材料的恢復(fù)和再生階段建立有效的檢測(cè)體系。目前，形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞學(xué)方法、同功酶、分子標(biāo)記（如RFLP和RAPD）等檢測(cè)方法常常單獨(dú)或結(jié)合起來用于遺傳變異分析。39種質(zhì)超低溫保存法程序示意圖植物器官、組織和細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)或植株再生再培養(yǎng)玻璃化凍存法分步冷凍法（兩步法、多步冰凍法）加冷凍防護(hù)劑（0℃）快速冷凍法（降溫速度1000℃/min）預(yù)處理（加速繼代、提高培養(yǎng)基滲透壓、低溫鍛煉）種質(zhì)庫（-196℃）迅速解凍（34-45℃）包埋干燥冷凍法40

植物種類參考文獻(xiàn)白花三葉草（Trifoliumrepens）Yamadaetal.1991白薯（Ipomoeabatatas）

Towill1992百合（LiliumjaponicumThumb）Matsumoto1995,Sakai&Matsumoto1996菠蘿（Ananascomosus）Gonzalez-Arnaoetal.1998薄荷(MenthaspicataL.)Hiraietal.1999茶（Camelliasinensis）Kuranuki&Sakai1994大麻（HumuluslupulusL.）Martínez1999大蒜（AlliumsativumL.）Niwataetal.1998豆莢樹(Acaciamangium)Sudarmonowatietal.1998番木瓜（Caricapapaya）Towill1990甘蔗(BetavulgarisL.cloneSES1)Vandenbusscheetal.1998,柑橘（Poncirustrifoliate(L.)Raf.）Gonzalez-Arnaoetal.1998龍膽（GentianascabraBungevarbucrgcriMaxim.）SukaiandMatsumoto1996蘆筍（Asparagusofficinalis）Uragamietal.1990,Kohmuraetal.1992陸生蘭（Cymbidiumspp）Thinhetal.1998馬鈴薯（Solanumtuberosum）Fabre&Dereuddre1990獼猴桃（Actinidiadeliciosa）Suzukietal.1994苜蓿(MedicagosativaL.)Shiblietal2001蘋果（Matusdomestica）Niinoetal.1992,Niino&Sakai1992,Pauletal2000葡萄（VitisvinifcraL.cv.chardonnay）Plessoaetal.1994桑樹（Manihotesculenta）Niinoetal.1992山茱菜（Wasabiajaponica）Matsumonoetal.1994,Sakai&Mataumoto1996麝香石竹（Dianthuscaryophullus）Langisetal.1990,Towill1990柿(DiospyroskakiThunb.)Matsumotoetal.2001薯蕷(Dioscoreaspp)Mandal1995香蕉(Musaspp.)Helliotetal.2002杏（PrunusdulcisMill.）Shatnawietal.1998洋梨（Pyruscommunis）Niinoetal.1992,Dereuddreetal.1990,Niino&Sakai1992芋（Colocasiaesculenta(L.)schott）Takagietal.1997蕓苔（Betavulgaris）Kohmuraetal.1992

玻璃化法和包埋脫水法保存植物莖尖文獻(xiàn)一覽表

41冷凍保存的應(yīng)用前景1、長(zhǎng)期保存種質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性。2、長(zhǎng)期保存去病毒的種質(zhì)。3、保持稀有珍貴及瀕危植物的種質(zhì)資源。4、保持不穩(wěn)定性的培養(yǎng)物，如單倍體。5、保持培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的能力。6、防止種質(zhì)衰老。7、延長(zhǎng)花粉壽命，解決不同開花期和異地植物雜交上的困難。8、冷凍解